ПРОИЗВОДНЫЕ ГЕМИНА ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2010 года по МПК C07K14/805 C07D487/22 A61K38/42 A61P31/00 

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новым производным гемина, представляющим собой соединения общей формулы I:

где R₁=R₂ и представляют собой β-аланилгистамин, или γ-глутамилгистамин, или β-аланилгистидин,

или R₁ представляет собой ОН и R₂ представляет собой γ-глутамилгистамин;

Y^- представляет собой Сl^-; Me представляет собой Feⁿ⁺, где n=2, 3; и где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим С_1-8 эфиром, или их фармацевтически приемлемым солям, обладающим вирулицидным действием;

к способу синтеза этих соединений; композиции и применению, в том числе биомедицинскому, новых и известных производных гемина формулы I в качестве катализаторов окисления природных органических субстратов и потенциальных вирулицидных средств.

Известны производные гемина (геминпептиды), в частности моно-HemLeuHisOMe, обладающие пероксидазной активностью в реакции окисления NADH пероксидами (Н₂О₂, ТБГ) [Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Рожкова Е.А.// Кинетика и катализ, Т.40, №2, 1999, с.256-260]. Для некоторых аминокислотных и пептидных производных гемина общей формулы I, а именно при R₁=-OH, R₂=-ArgOMe, или R₂=-LeuHisOMe, или R₂=ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, или R₂=-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, или R₂=-TrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, установлена нуклеазная (нуклеолитическая) активность, проявляющаяся в способности разрушать плазмидную ДНК [Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Лобанова Т.Н.// Патент РФ №2250906; Желтухина Г.А., Лобанова Т.Н., Небольсин В.Е., Галлямов М.О., Драницына С.М., Костанян И.А. // Биоорган. химия. 2006. Т.32, №2, с.198-210].

Отдельные аминокислотные и пептидные производные гемина общей формулы I, а именно при R₁=-OH, R₂=-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH или R₂=-LeuHisOMe, а также при R₁=R₂=-ArgOMe, способны ингибировать протеиназу ВИЧ и оказывать вследствие этого противовирусное анти-ВИЧ действие [Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик Н.Н. // Патент РФ №2238950]. Однако не была известна вирулицидная активность известных аминокислотных и пептидных производных гемина, за исключением монозамещенных геминпептидов общей формулы I с R₁=-OH, содержащих в качестве заместителя R₂=-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH или -TrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH [Патент РФ 2296131]. Последние обладают вирулицидной активностью, в частности, против вирусов герпеса, но они сравнительно малодоступны из-за сложности строения и недостаточно эффективны, проявляя вирулицидное действие лишь спустя 1-2 часа.

Поэтому существует необходимость в синтезе низкомолекулярных, более простых производных гемина общей формулы I, например его дизамещенных аминокислотных производных.

Синтезы и физико-химические константы известных аминокислотных производных гемина общей формулы I, упоминаемых в данном изобретении, а именно соединений общей формулы I, где R₁=R₂=-SerOMe и R₁=R₂=-LysOMe, приведены соответственно в источниках [Небольсин В.Е., Желтухина Г.А., Лобанова Т.Н.// Патент РФ №2280649, Лившиц А.Б., Тульчинский В.М., Васильев А.Е. // Ж. орган. химия. 1977, т. ХIII, стр.436-442].

Однако вирулицидная активность для этих соединений не была установлена.

Композиции для предотвращения вирусных инфекций, включающие конъюгаты гемина с аминокислотами, пептидами и пептидомиметиками, неизвестны.

Задачей настоящего изобретения явилось создание новых доступных водорастворимых производных гемина общей формулы (I) и их фармацевтически приемлемых солей, за исключением известных производных геминпептидов, где R₁=OH, R₂=-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, или R₂=-TrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, обладающих одновременно вирулицидным действием и нуклеазной активностью, простого способа получения производных гемина общей формулы I с незащищенными карбоксильными группами, композиций для использования в качестве дезинфектантов, антисептиков, в том числе фармацевтических, на основе этих производных гемина и применение их в качестве вирулицидных агентов и средств предотвращения вирусных инфекций.

Поставленная задача в части новых соединений решается новыми производными гемина или их фармацевтически приемлемыми солями, представляющими собой соединения общей формулы I:

где R₁=R₂ и представляют собой -β-аланилгистамин, или -γ-глутамилгистамин, или -β-аланилгистидин,

или R₁ представляет собой ОН и R₂ представляет собой -γ-глутамилгистамин;

Y^- представляет собой Сl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3; и где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C₁-C₈ эфиром.

При этом предлагаемые производные гемина, описываемые общей формулой I, обладают вирулицидным действием, представляют собой искусственную нуклеазу, обладают пероксидазной активностью, являются катализаторами окисления природных органических субстратов.

Далее настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей вирулицидной активностью; дезинфицирующей, антисептической композиции, содержащим эффективное количество соединения общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, а также, если требуется, носитель, в том числе фармацевтически приемлемый.

Еще одним объектом данного изобретения является новый способ получения конъюгатов гемина, описываемых общей формулой I, путем взаимодействия активированного по карбоксильной/ым группе/ам производного гемина с незащищенным по карбоксильной группе аминокомпонентом в присутствии четвертичного аммониевого основания в органическом растворителе с использованием катализатора межфазного переноса.

Новые предпочтительные соединения общей формулы I представлены ниже:

Далее перечислены известные предпочтительные соединения общей формулы I:

В соответствии с настоящим изобретением новые дизамещенные производные гемина, соответствующие общей формуле I, а именно II, III и IV, получают путем взаимодействия свободной по аминогруппе аминокомпоненты, включающей незащищенную по карбоксильной группе аминокислоту, с бис→N-оксисукцинимидным эфиром гемина, а соединение (V) синтезируют в растворе путем ацилирования аминогруппы соответствующей аминокомпоненты N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидным (ONb) эфиром гемина.

Одной из задач настоящего изобретения явилась разработка эффективного способа получения соединений общей формулы I, а именно конъюгатов гидрофобного гемина с гидрофильными незащищенными цвиттер-ионными аминокомпонентами, в частности новых соединений (II-V). Данная задача решена путем проведения реакции в присутствии четвертичного аммониевого основания - катализатора межфазного переноса, причем в качестве четвертичного аммониевого основания использован бензилтриметиламмония гидроксид (Triton В).

В отличие от ранее использованных способов синтеза известных соединений общей формулы I в соответствии с настоящим изобретением успешное проведение реакции взаимодействия бис-N-оксисукцинимидного эфира гемина, растворимого лишь в органических растворителях, с пептидомиметиком, например H-γ-GluHA, или пептидами, или аминокислотами цвиттер-ионного строения, которые растворимы исключительно в водной среде, было достигнуто в присутствии Triton В (бензилтриметиламмония гидроксида). Добавление последнего к этим аминокомпонентам позволило гомогенизировать реакционную смесь, способствуя растворению γ-GluHA, карнозина и аминокислот в среде органического растворителя (диметилформамида), депротонировать аминогруппы аминокомпонентов. В результате целевые продукты (III-V) были получены с высокими выходами (60-76%). Преимуществами способа, кроме того, явились минимальная длительность процесса и минимально простая необходимая очистка, например флэш-хроматографией. Дополнительное преимущество процесса заключается в его упрощении в сравнении с возможным альтернативным способом синтеза производных гемина, подобных IV-VI, путем получения, а затем омыления производных гемина, модифицированных остатками эфиров аминокислот и пептидов по карбоксильной группе. В последнем случае синтез включает дополнительную стадию (омыление), может сопровождаться рацемизацией и побочной реакцией образования Fe-O-Fe мостиков между остатками гемина.

Производные гемина (II-V) могут быть получены в виде фармацевтически приемлемых солей, например ацетатов, хлоридов, сульфатов, лактатов и т.д., путем варьирования природы кислоты при выделении производного гемина или превращены в таковые с применением ионообменной хроматографии.

Синтез производных гемина отражен в примерах 1-7.

Список сокращений:

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид,

DMF - N,N'-диметилформамид,

DMSO - диметилсульфоксид,

НА - гистамин,

Неm - остаток гемина,

iPrOH - изопропанол,

LOOH - липидная гидроперекись,

NADH - никотинамид адениндинуклеотид (восстановленный),

ОМе - метиловый эфир,

ONb - N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир,

ГП - производные гемина,

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты,

МЛ - метиловый эфир линолевой кислоты,

ТБГ - трет-бутилгидроперекись,

ТСХ - хроматография в тонком слое,

ЦВА - циклическая вольтамперометрия,

ЦПЭ - цитопатический эффект,

ЭА - этилацетат.

ПРИМЕРЫ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В синтезе используют производные β-AlaHA и γ-GluHA, полученные по методикам, описанным ранее [Рожкова Е.А., Огрель С.А., Григорьев Д.Н., Небольсин В.Е., Желтухина Г.А., Евстигнеева Р.П.// Биоорганическая химия. 1996 г. Т.22. №10-11. С.838-847. Кромова Т.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Ковалева В.Л., Кржечковская В.В., Евстигнеева Р.П.// Хим. Фарм. журнал. 2005. Т.39. №3. С.12-15.]. Все растворители безводные, за исключением тех, которые применяют для экстракции из водных растворов.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия) в системах: хлороформ - метанол - 25% водный аммиак 5:3:0.5 (1), iPrOH - ЭА - 25% водный NН₃ 3:1:1 (2), хлороформ - метанол 9:1 (3).

Хроматограммы проявляют хлор-толидиновым реактивом, нингидрином, по свечению в УФ-свете; имидазолсодержащие производные - реактивом Паули. Масс-спектры высокого разрешения получают на времяпролетном масс-спектрометре "ULTRAFLEX ("BRUKER", Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации (TOF MALDI); в качестве матрицы используют 2,5- дигидроксибензойную кислоту. ИК-спектры регистрируют на приборе: "Magna 750" ("Nicolet", США). Электронные спектры снимают на спектрофотометре "Jasco" UV/VS 7800 (Япония).

Притязания подтверждены следующими примерами.

Пример 1. 6,7-бис-(N-β-аланилгистаминил)-протогемин IX (II)

К 0.1 г (0.40 ммоль) N-β-аланилгистамина×2 НСl в 4 мл DMF при перемешивании прибавляют 0.11 мл (0.80 ммоль) Еt₃N при 0°С в течение 15 мин. К полученному раствору добавляют раствор 0.17 г (0. 20 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX, полученного ранее, в 6 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают 2.5 ч при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляют методом ТСХ в условиях (1). Растворитель удаляют в вакууме. Для отделения примесей аминокомпонента и введения противоиона Сl^- сухой остаток растворяют в 15 мл н-бутанола и встряхивают с 0.5 N раствором соляной кислоты, промывают водой, насыщенной NaCl, до нейтральной реакции. Растворитель удаляют в вакууме. Для удаления солей остаток растворяют в безводном DMF, осадок NaCl отфильтровывают. Растворитель удаляют в вакууме. Целевое вещество (II) переосаждают из метанола диэтиловым эфиром. Твердый остаток сушат в вакууме над безводным CaCl₂. Выход 0.14 г (71%). Rf 0.72 (1), 0.62 (2). Электронный спектр, λ_mах, нм, вода, (ε·10^-3): 408.6 (51.30), 532.0 (1.61), 564.1 (1.20). ИК-спектр Фурье, ν, см^-1, KBr: 3423 (NH), 1645 (амид I), 1536 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 944.3.

Пример 2. 6,7-бис-(N-γ-глутамилгистаминил)-протогемин IX (III)

К 0.1 г N-γ- глутамилгистамина (0.42 ммоль) прибавляют 3 мл DMF, затем добавляют по каплям 0.43 мл (0.84 ммоль) 35% раствора Triton В в МеОН до полного растворения γ-GluHA. К полученному раствору прибавляют раствор 0.18 г (0.21 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 6 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают 1.5 ч при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляют методом ТСХ в условиях (1). Раствор концентрируют в вакууме до 2 мл, продукт осаждают диэтиловым эфиром. Осадок очищают флэш-хроматографией на силикагеле Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол-25% водный аммиак (5:3:2). Растворитель удаляют в вакууме. Для введения противоиона Cl^- раствор соединения (III) в 20 мл смеси хлороформ-метанол (8:4) встряхивают с 0.5 N раствором соляной кислоты, промывают водой. Водные слои объединяют и экстрагируют н-бутанолом, органический слой промывают водой, насыщенным раствором NaCl до нейтральной реакции. Органический растворитель удаляют в вакууме. Для удаления солей остаток растворяют в DMF, осадок NaCl отфильтровывают. Растворитель отгоняют в вакууме. Остаток сушат в вакууме над безводным CaCl₂. Выход 0.175 г (76%). Rf 0.54 (1). Электронный спектр, λ_max, нм, вода, (ε·10^-3): 408.4 (54.36), 535.8 (4.05), 570.2 (2.88). ИК-спектр Фурье, ν, см^-1, KBr: 3247 (NH), 1647 (COO^- амид I), 1541 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1060.6.

Пример 3. 6-7-моно-(N-γ-глутамилгистаминил)-протогемин IX (V)

К 0.074 г N-γ- глутамилгистамина (0.31 ммоль) прибавляют 2 мл DMF, затем по каплям прибавляют 0.31 мл (0.62 ммоль) 35% раствора Triton В в МеОН до полного растворения γ-GluHA. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 15 мл (0.31 ммоль) 6(7)-моно-N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина (IX) в DMF. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляют методом ТСХ в условиях (2), (3). Наблюдается выпадение осадка. Реакционную смесь центрифугируют (15 мин при 2900 об/мин). Супернатант отделяют от осадка декантированием и отбрасывают. К остатку прибавляют порциями DMF и центрифугируют в тех же условиях, супернатант отделяют декантацией. Процедуру повторяют несколько раз до полного отделения осадка от гемина. Для введения противоиона Сl^- раствор соединения (IV) в 12 мл смеси хлороформ-метанол (8:4) встряхивают с 0.5 N раствором соляной кислоты, промывают водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток сушат в вакууме над безводным CaCl₂. Выход 0.23 г (68%). Rf 0.82(1). Электронный спектр, λ_max, нм, хлороформ-метанол (7:3), (ε·10^-3): 402.00 (47.9), 500.60 (2.17), 629.20 (0.84). ИК-спектр Фурье, ν, см^-1, KBr: 1717(СООН), 1638(амид I), 1540(амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 837.6.

Пример 4. 6,7-бис-(N-β-аланилгистидин)-протогемин IX (IV)

Исходя из 0,1 г (0,442 ммол) β-аланилгистидина (карнозина) по методике, описанной в примере 2 для соединения (III), получают 0,270 г (71%) соединения (IV). R_f 0,4(1). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 824,4.

Таким образом, предлагаемые производные гемина (II -V) получены с высокими выходами, в индивидуальном состоянии и охарактеризованы электронной и ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, ТСХ.

Исследование активности производных гемина в реакциях окисления органических субстратов и вирулицидного действия описано далее в примерах 5-9.

Пример 5. Исследование нуклеазной активности геминпептидов

Исследование нуклеазной активности производных гемина (II, III, V-IX) проводят по типичной методике [Maniatis Т., Fritish В., Sambrook J. Molecular Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982] с применением ДНК-плазмиды pGem-Т, состоящей из 3700 пар оснований, выделенной из клеток E.coli JS-5, с помощью набора "Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System" (Promega, США). Производные гемина в концентрации 10^-4÷10^-5М инкубируют с 0.05 мг/мл плазмидной ДНК в течение 1 ч при 37°С в 10 мкл реакционной смеси. Продукты расщепления анализируют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере (0.04 М Трис-ацетат, рН 8.0, 0.02М ЭДТА) при напряжении 10 В/см. Продукты реакции визуализируют путем окрашивания их флуоресцентным красителем бромистым этидием. Полосы ДНК детектируют с помощью источника УФ-света длинноволновой области с λ 300 нм и фотографируют с использованием цифровой камеры фирмы «Canon».

Активность соединений исследуют при кислых и нейтральных значениях рН в следующих буферных растворах:

буфер I: 50 мМ AcONH₄ (рН 4.5), 5 мМ MnCl₂;

буфер II: 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 10 мМ MnCl₂.

Производные гемина прибавляют к реакционной смеси в воде или в виде раствора в смеси воды и DMSO, причем концентрация DMSO в конечной пробе составляет ≤10%.

Результаты исследования нуклеазной активности новых и известных производных гемина, соответствующих общей формуле I, приведены в табл.1.

Таблица 1
Нуклеазная активность производных гемина, соответствующих общей формуле I, в отношении плазмидной ДНК pGem-T № соединения (10^-4 М) Буфер I рН4.4 Буфер II рН7.5 II + + III - - V - - VI + + VII - - VIII + + IX + + + расщепление ДНК
- отсутствие расщепления ДНК

Таким образом, введение в реакционную смесь производных гемина может вызывать исчезновение полос (расщепление) ДНК, в зависимости от условий рН и структуры заместителя в молекуле гемина.

Проведено исследование каталитической активности производных гемина, соответствующих общей формуле (I), в реакциях окисления природных органических субстратов.

Пример 6. Исследование пероксидазной активности производных гемина в реакции окисления никотинамидадениндинуклеотида (NADH)

Пероксидазную активность производных гемина, соответствующих общей формуле I, оценивают по скорости окисления восстановленного пиридиннуклеотида (NADH), определяемой спектрофотометрически по снижению интенсивности полосы поглощения при λ_max 339.0 нм [Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Рожкова Е.А.// Кинетика и катализ, Т.40, №2, 1999, с.256-260].

Реакцию окисления NADH гидроперекисями (трет-бутилгидроперекись - ТБГ, Н₂О₂) осуществляют следующим образом: в спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл помещают 20 мМ калий-натрий фосфатного буфера (рН 7.4), содержащего 10^-4М NADH, 9·10^-3M ТБГ или Н₂О₂, при 25°С. Пероксидазную реакцию запускают добавлением раствора производного гемина, конечная концентрация которого в кювете составляет 25·10^-6М.

Семейство спектральных кривых регистрируют в интервале от 200 до 600 нм последовательно через равные промежутки времени (1÷15 мин).

Спад поглощения при λ_mах 339.0 нм соответствовал окислению восстановленного пиридиннуклеотида.

Из данных, представленных на чертеже, следует, что новые и известные соединения, соответствующие общей формуле I, обладают пероксидазной активностью.

При катализе реакции окисления NADH в присутствии ТБГ (см. чертеж, a) Hem-(ArgOMe)₂ (VI) и Hem-(γ-GluHA)₂ (III) быстро (за 1 мин) и эффективно (почти на 100%) катализируют окисление NADH.

В присутствии Неm-(β-АlаНА)₂ (II) и Hem-(LeuHisOMe) (X) эта реакция протекает медленнее.

В реакции окисления NADH перекисью водорода Hem-(ArgOMe)₂ (VI), Hem-LeuHisOMe (X) и Hem-(β-AlaHA)₂ (II) проявляют высокую активность, в то время как Hem-(γ-GluHA)₂ (III) окисляет NADH с меньшей скоростью.

Таким образом, заявляемые соединения, соответствующие общей формуле I, эффективно, но с разной скоростью катализируют окисление NADH пероксидами, проявляя пероксидазную активность.

Пример 7. Исследование каталитической активности производных гемина в реакции окисления метиллинолеата (МЛ)

Эффективность производных гемина как инициаторов и катализаторов окисления метиллинолеата (МЛ) зависит от двух факторов: от скорости генерации активных радикалов при взаимодействии производных гемина с МЛ или с продуктом окисления МЛ - липидной гидроперекисью (LOOH) и продолжительности каталитического действия производных гемина, которая обусловлена главным образом способностью каталитически активной формы производных гемина к регенерации.

В качестве тестирующей системы используют цепное окисление 5 mМ метиллинолеата (МЛ) в 50 mM мицеллярном растворе неионогенного ПАВ Тритон 100-Х в 50 mM Na-фосфатном буфере при рН 7.4 и 37°С.

Скорость окисления МЛ определяют по скорости поглощения кислорода, при этом концентрацию кислорода в тестирующей системе определяют с помощью кислородного биологического монитора YCI-5300 (Yellow Springs Instruments, США) с электродом Кларка в качестве сенсора. Скорость окисления МЛ находят исходя из наклона кинетических кривых в зависимости от изменения концентрации кислорода от времени [Roginsky V.A., Stegmann H.B.// Free Rad. Biol. Med. 1994. V.17. P.93-103].

Метиллинолеат (МЛ) вводят в измерительную ячейку после 10-минутного термостатирования и стабилизации системы. Катализатор окисления МЛ из ряда заявляемых производных гемина вводят после 3-5 мин периода неингибированного окисления без открытия рабочей ячейки и без прекращения мониторинга.

В качестве основных параметров, характеризующих каталитическую активность производных гемина, используют эффективную константу скорости генерации активных радикалов k_in и константу скорости первого порядка, характеризующую скорость снижения во времени генерирующей способности k_D, а также коэффициент регенерации (f), который характеризует устойчивость к деградации и суммарную эффективность катализатора.

Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2
Кинетические параметры, характеризующие каталитическую активность производных гемина при окислении МЛ № соединения k_in, М^-1 сек^- f, коэф. регенерации K_D, сек^-1 (II) 800 24 0.019 (III) 80 >7.5 0.006 (VI) 110 25 ~0.0033 (VII) 240 >25 0.0019 (VIII) 540 >27 0.013 (IX) 360 12 ~0.015 (X) 900 20-25 0.018 (XI) 35±9 1.9 0.014 (XII) 375±25 9-10 0.018

Из таблицы следует, что производные гемина по изобретению, соответствующие общей формуле I, могут катализировать окислительное расщепление органических субстратов, в том числе компонентов вируса, таких как ПНЖК, ДНК, NADH и др., представляя свидетельство их вирулицидного действия. Кроме того, данная каталитическая активность может представлять самостоятельную ценность для потенциального индустриального использования синтетических производных гемина общей формулы I в качестве катализаторов окисления в химии и биотехнологии.

Пример 8. Тестирование вирулицидной активности производных гемина

Для выявления вирулицидной активности исследуют влияние производных гемина общей формулы I на модели безоболочечного РНК-содержащего вируса, высокорезистентного к физико-химическим воздействиям (вирус полиомиелита), и ДНК-содержащего крупного вируса, имеющего оболочку (вирус герпеса простого). Вирус полиомиелита, тип 1, вакцинный штамм, получали из НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Вирус герпеса простого, тип 1, получали из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Используют перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек VERO, культивируемую в среде Игла с 10% сыворотки эмбриона коров. Жизнеспособность клеток определяют окраской 0.4%-ным раствором трипанового синего (Sigma, США).

Инфицирование чувствительных культур клеток проводят путем инкубации при 34°С с вируссодержащей средой (вирус полиомиелита) и 37°С (вирус герпеса простого) до развития цитопатического эффекта (ЦПЭ) со 100% гибелью клеток. Учет результатов проводят микроскопически. Репродукцию вирусов в клетках оценивают по вирус-индуцированному ЦПЭ. Водорастворимые геминпептиды растворяют в стерильной дистиллированной воде, а гидрофобные - в ее смеси с DMSO (5%).

Результаты экспериментов по изучению вирулицидных свойств производных гемина общей формулы I приведены в табл.3 и 4.

Таблица 3
Исследование вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса герпеса простого и полиомиелита соединение Степень ингибирования вируса Вирус полиомиелита, исх. титр 5,5 log₁₀ Вирус герпеса простого, исх. титр 4,5 log₁₀ 10^-4 М 10^-5 M 10^-4 М 10^-5 M 30 мин 60 мин 30 мин 60 мин 30 мин 60 мин 30 мин 60 мин (IX) 4,0 4,5 4,0 3,8 - - - - (XI) 3,5 4,0 3,0 3,75 2,25 2,75 2,0 2,5 (VI) 3,5 4,5 3,5 4,5 3,0 3,0 2,5 2,5 - не исследовали

Вирулицидные свойства соединений (табл.3) исследовали при обработке поверхности (линолеум). Способ обработки - протирание избытком раствора вещества.

Таблица 4
Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса полиомиелита (в суспензионном тесте) соединение Степень ингибирования вируса полиомиелита, исх. титр 6,0 log₁₀ 10^-4 М 10^-5 М 30 мин 60 мин 30 мин 60 мин (П) 2,6 2,7 2,4 2,6 (III) 3,25 3,5 3,0 3,25 (V) 3,0 3,75 2,75 3,0 (VI) 2,6 4,6 2,6 3,6 (VII) 3,2 3,2 3,0 3,0 (VIII) 2,1 4,5 3,0 2,6 (IX) 3,0 3,6 2,1 2,7 (XI) 3,5 4,2 3,0 4,0

Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса герпеса простого при различном времени воздействия представлены в табл.5. В качестве тест-объекта используют линолеум. Способ обработки - протирание с избытком раствора исследуемого соединения.

Таблица 5
Вирулицидные свойства производных гемина в отношении вируса герпеса простого, тип 1 Шифр Степень ингибирования вируса, log₁₀ ТЦИД₅₀ 10^-4 М 10^-5 М 30 минут 60 минут 30 минут 60 минут VII 4,5 4,5 3,0 2,6 VIII 3,0 3,6 2,1 2,7 XI 2,6 2,75 2,0 2,5 III 2,6 2,7 2,4 2,6

Исходный титр вируса - 4,5 log₁₀ ТЦИД₅₀, время экспозиции 30 и 60 минут. Способ исследования - протирание вирусной пленки на поверхности избытком раствора вещества.

В табл.6 приведены испытания на вирулицидную активность в отношении вируса герпеса производного гемина формулы I, где R₁=R₂=β-аланилгистидин (соединение IV).

Таблица 6
Вирулицидная активность соединения IV в отношении вируса герпеса (ВПГ-1) Соединение № ИНФЕКЦИОННЫЙ ТИТР ВИРУСА (log₁₀) КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА 10^-4 M 10^-5 M Снижение титра на log₁₀ 30 минут 60 минут 30 минут 60 минут IV 5,0 3,0 5,0 4,0 2,0; 1,0 вирус 5,0        

Исходный титр вируса - 5,0 log₁₀ ТЦИД₅₀, время экспозиции в 30 и 60 минут.

Способ исследования - в суспензии вируса.

Представленные результаты указывают на способность исследуемых соединений ингибировать инфекционную способность вируса герпеса. Степень ингибирования была различной. Отмечается как временная, так и дозовая зависимость степени подавления вируса. Наиболее выраженное антигерпесное вирулицидное действие наблюдалось для соединения VII при концентрации 10^-4 М и времени воздействия 30 минут. При уменьшении конечной концентрации в 10 раз (до 10^-5М) ингибирующий эффект снижался.

Пример 9. Проведено изучение вирулицидного действия соединений, соответствующих общей формуле I в суспензии, на интактные вирусные частицы гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)

Методика изучения вирулицидного действия соединений, соответствующих общей формуле I в суспензии, на интактные вирусные частицы гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)

Вируссодержащую жидкость с титром 4,0 для вируса гриппа соединяли 1:1 с учетом разведения препаратов вирусным материалом в 2 раза, инкубировали при комнатной температуре в присутствии и в отсутствие испытуемых соединений. Экспозицию с препаратами вируса гриппа проводили в течение 30 и 60 минут.

Вируссодержащий материал инкубировали в присутствии соединения IV в исследуемой концентрации и определяли величину снижения инфекционного титра вируса по сравнению с контролем - вирусом, инкубируемым в тех же условиях, но без испытуемого соединения.

Инфекционный титр вирусов определяли путем заражения культур клеток.

Перед инфицированием клетки дважды промывали средой без сыворотки для снижения неспецифической реакции. Инфицирование проводили 10-кратными разведениями проб вирусов с соединением IV и без него на соответствующей среде с добавлением трипсина (ТРСК treated, Sigma) в случае исследования вируса гриппа. Адсорбцию вирусов проводили в течение 40-60 минут при 37°С. Несорбировавшийся вирус удаляли 3-кратной промывкой средой без сыворотки. Контроли вирусов и клеток культивировали в соответствующей клеткам среде. Далее планшеты инкубировали в термостате в течение 48-72 часов при 37°С.

Учет результатов проводили по определению гемагглютинирующей активности вируса гриппа в надосадочной жидкости в реакции гемагглютинации с человеческими эритроцитами 0(1) группы.

Инфекционный титр вируса герпеса ВПГ-1 определяли в реакции иммуноферментного анализа, используя коммерческие тест-системы и ПЦР фирмы «Амплисенс». Результаты испытаний приведены в таблице 7.

Таблица 7
Вирулицидная активность заявляемых соединений общей формулы I в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) Соединение, № ИНФЕКЦИОННЫЙ ТИТР ВИРУСА (log₁₀) КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА 10^-4 M 10^-5 M Снижение титра на log₁₀ 30 минут 60 минут 30 минут 60 минут IV 4,0 2,0 4,0 2,5 2,0; 1,5 вирус 4,0        

Исходный титр вируса - 4,0log₁₀ TЦИД₅₀, время экспозиции 30 и 60 минут. Способ исследования - в суспензии вируса.

Проведенные испытания на примере соединения IV показали, что заявляемые соединения общей формулы I проявляют вирулицидную активность также в отношении вируса гриппа, и при этом показали, что соединение IV обладает высокой активностью в отношении вируса герпеса (ВПГ-1) и в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).

Проведенные исследования свидетельствуют, что производные гемина по изобретению, соответствующие общей формуле I, обладают выраженными вирулицидными свойствами в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов (полиомиелит, герпес, грипп), обладающих различной степенью устойчивости к воздействию физико-химических факторов.

Пример 10. Композиции настоящего изобретения могут быть использованы в виде дезинфицирующих, антисептических и фармацевтических препаратов (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих предлагаемые в настоящем изобретении соединения в качестве активных ингредиентов в смеси с органическим или неорганическим носителем или наполнителем, приемлемым для внутримышечного, внутривенного, интраназального, перорального, сублингвального, ингаляционного и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными, фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, эмульсий, суспензий, спреев, ингаляторов, капель, мазей и любых других лекарственных форм. В качестве носителей могут быть использованы вода, глюкоза, лактоза, аравийская камедь, желатин, крахмал, триксилит магния, тальк, кукурузный крахмал, мочевина, полиэтиленгликоль и другие носители, пригодные для изготовления твердых, мягких или жидких препаратов. При этом в качестве добавок могут быть использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.

Активное действующее соединение общей формулы I вводят в композицию в количестве, достаточном для получения нужного вирулицидного эффекта.

При изготовлении разовой лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьировать в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.

Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций содержание действующего начала в них составляет 0.001-1%. В качестве разбавителя вещества могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы. При использовании соединения общей формулы (I) в виде таблеток и суппозиториев количество вещества составляет 1,0-100,0 мг на единичную дозированную форму. Для таблеток и суппозиториев в качестве фармацевтического наполнителя используют любую фармацевтически пригодную основу.

Ниже приведены примеры лекарственных форм.

А. Желатиновые капсулы

Состав вводимого в капсулу порошка:

Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг Оксид магния 50 мг Крахмал 100-200 мг

Указанные выше ингредиенты смешивают и смесь вводят в твердые желатиновые капсулы в количестве 151- 285 мг.

Б. Таблетированная форма

Таблетированную форму получают, используя приведенные ниже ингредиенты:

Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг Крахмал картофельный 100 мг Поливинилпирролидон 10мг Магния стеарат 2 мг Лактоза 48-82 мг Аэросил 5 мг

Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток весом 200 мг каждая.

В. Аэрозольная форма

Состав аэрозольной смеси, рассчитанной на 10 приемов:

Соединение, соответствующее общей формуле (I) 10-100 мг Магния сульфата 150 мг Лактоза 110-140 мг

Соединение смешивают с наполнителями и помещают в специальное устройство для распыления.

Г. Суппозитории

В качестве суппозиторной основы могут быть использованы:

основы, нерастворимые в воде, - масло какао;

основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой, - желатино-глицериновые или полиэтиленоксидные;

комбинированные основы - мыльно-глицериновые.

Пример состава суппозитория:

Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг Масло какао количество, необходимое для получения суппозитория

При необходимости возможно изготовление ректальных, вагинальных и уретральных суппозиториев с соответствующими наполнителями.

Д. Мази

В качестве мазевой основы могут быть использованы:

углеводородные мазевые основы - вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции - твердый парафин и воск;

абсорбтивные мазевые основы - гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens);

мазевые основы, смываемые водой, - гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum); водорастворимые мазевые основы - полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), бентонитовые основы и другие.

Пример состава мази:

Соединение соответствующее общей формуле (I) 0,01 г-0,1 г Вазелин 10 г

Мази изготавливают по соответствующей технологии.

Е. Раствор для инъекций

В качестве растворителя при приготовлении раствора для инъекций могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина. Форма выпуска - ампулы, флаконы, шприц-тюбики.

Состав раствора для инъекций:

Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг Вода дистиллированная 1 -2 мл

Возможно изготовление различных лекарственных форм для инъекций - стерильных растворов, стерильных порошков и таблеток.

Примеры композиций для дезинфицирующих и антисептических средств.

Г. Соединение, соответствующее общей формуле I 0,001-1% 1-пропанол 30-40% 2-пропанол 10-70% вода дистиллированная 10-60% D. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1% Четвертичное аммониевое основание (или их смесь) 2-10% Поверхностно-активное соединение (ПАВ) катионного, анионного или амфотерного типа   Вода дистилированная до 100% Е. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1% Диметилсульфоксид (DMSO) 1-20% или полиэтиленгликоль (PEG) M.M. 200-12000 1-20% вода дистиллированная до 100% Ж. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1% Смесь спиртов, DMSO, PEG, ПАВ в различных   сочетаниях и соотношениях 1-80% вода дистиллированная до 100% И. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1% вода дистиллированная до 100%

Таким образом, заявленные производные гемина общей формулы I обладают вирулицидной активностью в низких дозах и способны инактивировать вирусы различного строения, в том числе полиомиелита и герпеса, в соответствии с механизмами, включающими пероксидазную и нуклеазную активность, в отношении компонентов вируса, а также способны катализировать окисление ПНЖК, входящих в состав липидных вирусных мембран. Эффективность отдельных представителей соединений, соответствующих общей формуле I, понижающих титр вируса на 3-4 log₁₀, подтверждает их пригодность для индустриального применения в составе дезинфицирующих, антисептических и терапевтических средств с вирулицидным действием.

Каталитическая активность соединений общей формулы I в реакциях окисления органических субстратов, в частности нуклеиновых кислот, NADH и ПНЖК, может иметь самостоятельное индустриальное применение в качестве катализаторов окисления в химии и биотехнологии.

Изобретение относится к новым производным гемина общей формулы I, где R₁=R₂ и представляют собой β-аланилгистамин, или γ-гутамилгистамин, или β-аланилгистидин, или R₁ представляет собой ОН и R₂ представляет собой γ-глутамилгистамин; Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3; и где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C_1-8 эфиром; их фармацевтически приемлемым солям; способу их получения и фармацевтическим композициям. Производные гемина общей формулы I могут быть использованы в качестве искусственных нуклеаз, средства, обладающего пероксидазной активностью, катализаторов окисления метиллинолеата и дезинфицирующей, антисептической композиции, обладающей вирулицидным действием. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл.

1. Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, представляющие собой соединения общей формулы I

где R₁=R₂ и представляет собой β-аланилгистамин, или γ-глутамилгистамин, или β-аланилгистидин,
или R₁ представляет собой ОН и R₂ представляет собой γ-глутамилгистамин;
Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3; и где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C_1-8 эфиром.

2. Способ получения производных гемина или их фармацевтически приемлемых солей общей формулы I

где R₁=R₂ и является β-аланилгистамином, γ-глутамилгистамином или β-аланилгистидином или R₁ представляет собой ОН и R₂ представляет собой γ-глутамилгистамин; Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3; и где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C_1-8 эфиром, путем взаимодействия активированного по карбоксильной/ым группе/ам производного гемина с аминокомпонентом в присутствии четвертичного аммониевого основания, отличающийся тем, что процесс ведут в органическом растворителе в присутствии катализатора межфазного переноса.

3. Способ получения производных гемина или их фармацевтически приемлемых солей по п.2, где активированное производное гемина представляет собой бис-N-оксисукцинимидный эфир гемина или моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир гемина, причем в качестве растворителя используют N,N-диметилформамид, а в качестве катализатора межфазного переноса используют четвертичное аммониевое основание - бензилтриметиламмония гидроксид (Triton В).

4. Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли по п.1, обладающие вирулицидным действием.

5. Искусственная нуклеаза, представляющая собой производное гемина или его фармацевтически приемлемую соль формулы I

где R₁=R₂ и представляет собой β-аланилгистамин, метиловый эфир аргинина или метиловый эфир лизина, Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3.

6. Средство, обладающее пероксидазной активностью, представляющее собой производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли общей формулы I

где R₁=R₂ и представляет собой β-аланилгистамин, γ-глутамилгистамин или метиловый эфир аргинина; Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Feⁿ⁺, гдe n=2, 3.

7. Катализатор окисления метиллинолеата, представляющий собой производное гемина или его фармацевтически приемлемую соль, общей формулы (I)

где R₁=R₂ и представляет собой β-аланилгистамин, γ-глутамилгистамин или метиловый эфир аргинина, метиловый эфир серина, метиловый эфир лизина;
или
R₁ - OH, a R₂ - ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, или LeuHisOMe, или ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH;
Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3, где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C_1-8 эфиром.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая вирулицидной активностью, содержащая эффективное количество производного гемина или его фармацевтически приемлемой соли, общей формулы (I)

где R₁=R₂ и представляет собой, или β-аланилгистамин, или γ-глутамилгистамин, или -ArgOMe, или -SerOMe, или -LysOMe, или β-аланилгистидин,
или R₁ представляет собой -ОН и R₂ выбирают из γ-глутамилгистамина, или
- ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, или -LeuHisOMe;
Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3;
где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим C_1-8 эфиром, и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Дезинфицирующая антисептическая композиция, обладающая вирулицидной активностью, содержащая эффективное количество производного гемина или его фармацевтически приемлемой соли общей формулы (I)

где R₁ - R₂ и выбраны из β-аланилгистамина, γ-глутамилгистамина, -ArgOMe, -SerOMe, -LysOMe, β-аланилгистидина
или R₁ представляет собой -ОН и R₂, выбирают из γ-глутамилгистамина,
-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, -LeuHisOMe;
Y^- представляет собой Cl^-;
Me представляет собой Fеⁿ⁺, где n=2, 3, и
где карбоксильная группа гемина может быть модифицирована метиловым или другим С_1-8 эфиром, и приемлемый носитель.