СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЛЬЕФООБРАЗУЮЩИХ СТРУКТУР БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБОЛОЧЕК Российский патент 2011 года по МПК G01N33/483 G01N1/30 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к методам гистологических исследований биологических оболочек с естественной поверхностью (брюшина, плевра) при помощи световых микроскопов.

При изучении рельефа поверхности брюшины и плевры обнаруживаются различной формы, размерности, ориентации и регулярности возвышения и углубления. Наиболее характерной особенностью рельефа поверхности серозных оболочек является его регулярная волнистость. Возникают значительные трудности в определении происхождения отдельных форм поверхности, разновидностей и параметров волн на ней. В частности, как формируются ряды узких гребневидных возвышений с крутопадающими склонами с шириной верхушки волны, примерно равной диаметру подлежащих коллагеновых волокон, чем определяется длина волны поверхности по его фронту, дистанция между волнами, как соотносятся направление волн поверхности с направлением подлежащих коллагеновых волокон, соответственно, с направлением их циклического обратимого растяжения. То есть картину рельефа поверхности серозных оболочек, распределения мезотелиоцитов на ней, картину рельефа поверхности базальной мембраны трудно интерпретировать, не имея представления (трехмерного изображения) о совокупной рельефообразующей поверхности подлежащих (подпокровных) коллагеновых волокон, о пространственных взаимоотношениях между соседними волокнами и о конформационных (трехмерных) вариантах строения отдельных коллагеновых волокон.

Традиционная световая микроскопия внутренних структур гистологических препаратов, в частности, коллагеновых волокон, проводится освещением их на просвет, в двумерном изображении. Оно не дает изображения трехмерных коллагеново-волокнистых конструкций, способных инициировать формирование на естественной поверхности оболочек регулярных трехмерных (рельефных) структур.

Понятие «рельеф» не имеет физического содержания, оно является трехмерным геометрическим образом, формой некой границы раздела сред. Для исследования рельефа поверхности объекта необходимо его поверхности придать равномерную светоотражательную способность и освещать эту поверхность «спереди», со стороны объектива микроскопа, со стороны наблюдателя. При этом в микроскопе в падающем отраженном от объекта свете создается картина градиента освещенности различных участков поверхности препарата, зависящая от угла наклона этих участков поверхности к источнику света, то есть получаемое изображение детерминировано формой поверхности объекта. Указанные рассуждения относятся как для поверхности пленочного препарата в целом, так и для поверхностей отдельных его структур, расположенных в толще препарата, в данном случае это касается поверхности подпокровных коллагеновых волокон.

Известен способ световой микроскопии гистологических препаратов, позволяющий получать объемное изображение с помощью микроскопов плоского поля, с детализацией структур до уровня 25- и 50-кратных объективных увеличений, достаточных для визуализации отдельных коллагеновых волокон (Минигазимов Р.С. Способ исследования рельефа поверхности гистологических препаратов. Патент на изобретение RU 2270446 С1 от 20 февраля 2006 года). При этом способе микроскопию проводят микроскопами плоского поля проходящего света при одностороннем падающем тенеобразующем освещении, а поверхности препарата придают светоотражательную способность путем импрегнации серебра. При этом импрегнацию серебра осуществляют выдерживанием препарата в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут и последующим восстановлением его в металлическое состояние 1% раствором аскорбиновой кислоты в течение 1 минуты. Далее препараты обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам между стеклами. Данный способ взят за прототип.

Общие принципы формирования объемного изображения в микроскопах плоского поля путем создания одностороннего косого падающего освещения и придания светоотражающей способности препарату импрегнацией серебра в предлагаемом способе аналогичны с таковыми у прототипа. Но без существенных изменений прототип непригоден для исследования коллагеновых волокон, расположенных в толще препарата. Он разработан, во-первых, для получения объемного изображения рельефа поверхности препарата, поэтому светоотражающая способность придается поверхности препарата как таковой. А светоотражающая поверхность препарата не позволяет падающему свету проникать глубже поверхности в толщу препарата, то есть не позволяет освещать рельефообразующие конструкции подпокровных коллагеновых волокон падающим светом. Во-вторых, серебрение препарата проводится сплошное, не селективное, а в задачи предлагаемого способа входит селективное серебрение коллагеновых волокон.

Задачей изобретения является повышение качества исследования структурной организации поверхности биологических оболочек, получение новых данных о трехмерных вариантах строения в них подпокровных коллагеновых волокон.

Технический результат при использовании изобретения - получение трехмерного изображения подпокровных коллагеновых волокон с детализацией до 600-кратных оптических увеличений.

Для получения трехмерного изображения подпокровных коллагеновых волокон пленочного препарата серозных оболочек предлагаемым способом необходимо:

- придать коллагеновым волокнам препарата светоотражающую способность,

- применить микроскопы плоского поля с детализацией изображения исследуемых структур до уровня 25-50-кратных объективных увеличений,

- применить одностороннее косое тенеобразующее (под большим углом падения, порядка 70-85 градусов к оси объектива) падающее освещение препаратов,

- визуализировать светоотражение подпокровных коллагеновых волокон, обеспечив условия для микроскопии их в падающем свете, то есть сделать их доступными для падающего освещения, предотвратить заслоняющее светоотражение вышележащих мезотелиальных клеток и базальной мембраны,

- микроскопию проводить на влажных, не заключенных между стеклами препаратах и хранить препараты в незаключенном влажном состоянии.

Поставленная задача достигается способом придания коллагеновым волокнам светоотражательной способности и исследования их микроскопами плоского поля в отраженном свете, в котором, в отличие от прототипа, микроскопию проводят на влажных не заключенных между стеклами препаратах, в отличие от прототипа, микроскопами плоского поля падающего света, снабженными объективами для работы без покровных стекол, в одностороннем косом падающем освещении, создаваемом, в отличие от прототипа, табельной эписистемой освещения микроскопов плоского поля падающего света, перекрывая для этого с одного края половину светового потока перед эпиобъективом непрозрачной шторкой. При этом препараты, в отличие от прототипа, до фиксации в формалине проводят через этап десквамации мезотелиальных клеток в «изолирующем клетки» растворе, обезжиривают, сенсибилизируют 10% раствором азотнокислого серебра, импрегнируют аммиачным раствором азотнокислого серебра, промывают в течение 2 минут в дистиллированной воде для удаления серебра из базальной мембраны, помещают в 1% раствор формалина для восстановления серебра в металлическое состояние, промывают в 0,5% аммиачно-спиртовом растворе детергента, расправляют на предметном стекле, микроскопируют и хранят во влажном незаключенном состоянии.

Нами установлено, что трехмерную световую микроскопию поверхности, а также подпокровных структур серозных оболочек в отраженном свете можно успешно проводить и на влажных, не заключенных между стеклами, препаратах. Для этого серебренные пленочные препараты расправляют в плоской чашке с дистиллированной водой и переносят на предметное стекло для микроскопии (удобнее пользоваться стеклами размерами 5×8 см - в диапазоне перемещений стандартных препаратоводителей). При этом исключается бликообразование от покровного стекла (оно должно быть абсолютно чистым), исключаются трудоемкие процедуры обезвоживания препаратов, пропитывания и заключения их в бальзам между предметным и покровным стеклами, площадь препарата не лимитируется размерами предметных и покровных стекол, не лимитируется толщина препарата. Можно микроскопировать неотсепарованные оболочки, к примеру, диафрагмальную плевру и диафрагмальную брюшину, переворачивая цельный (интактный) фрагмент диафрагмы размерами до 5×20 см. Не изолированные стеклами и не пропитанные бальзамом препараты можно дополнительно красить, промывать, по отношению к ним можно применять микроманипуляционные технологии. Для микроскопии незаключенных влажных препаратов в отраженном свете поверхность препарата необходимо обезжиривать с целью получения на его поверхности тонкого равномерного смачивающего слоя воды. Обезжиривание поверхностных структур пленок проводится выдерживанием их в 96% спирте в течение 30 минут перед процедурой серебрения, что, в свою очередь, улучшает условия проникновения в препарат водных растворов азотнокислого серебра и его восстановителей.

Нами также установлено, что импрегнированные серебром препараты можно хранить в затемненном месте в склянке с дистиллированной водой с добавлением этилового спирта до 40% (в том числе и для защиты от случаев промерзания) неограниченное время без ухудшения качества его первичной обработки. Импрегнированное серебро обеспечивает стерильность воды и препарата при многократном его извлечении, расправлении на предметном стекле и микроскопии. Посевы воды из склянки с препаратами 4-летней давности хранения не дали роста колоний на питательных средах.

Для микроскопии не заключенных между стеклами препаратов нужны объективы, рассчитанные для работы без покровных стекол. Таковыми являются эпиобъективы микроскопов плоского поля падающего света (современная классификация микроскопов - Егорова О.В. С микроскопом на «ты». СПб.: «Интермедика», 2000, стр.43-44 и 57-59), предназначенные для работы без применения покровного стекла. Микроскопы плоского поля падающего света оснащены 25-, 12,5-; 10- и 6,3-кратными окулярами и 6,3-, 9-, 12,5-; 16-, 25-, 40- и 50-кратными эпиобъективами, что позволяет получать хорошего качества изображения коллагеново-волокнистых структур в диапазоне 60-600-кратных оптических увеличений, достаточных для визуализации конформативных вариантов строения коллагеновых волокон. 50-кратный эпиобъектив имеет незначительную глубину резкого изображения, поэтому его применение ограничено объектами с незначительными перепадами уровней расположения деталей.

Микроскопия препаратов проводится с помощью микроскопов плоского поля падающего света, в которых табельной эписистемой освещения (Фиг.2) устанавливается режим падающего освещения методом темного поля, которое является круговым (бестеневым) косым падающим освещением. Для преобразования его в одностороннее косое падающее тенеобразующее освещение нами (Фиг.3) проводится краевое перекрывание половины светового потока осветителя до поворотного зеркала перед эпиобъективом непрозрачной шторкой (боковым смещением ползунка-держателя светофильтров в гнезде для введения в световой поток сменных светофильтров).

Открытие доступа падающему свету и визуализацию картины светоотражения подпокровных коллагеновых волокон, расположенных под слоем мезотелиальных клеток и под базальной мембраной, осуществляют в два этапа: первый этап - десквамация мезотелиальных клеток по Ранвье (Микроскопическая техника. Ромейс Б. / М.: Иностранная литература, 1953, стр.308-309). Для этого нефиксированные пленочные препараты помещают на 6 часов в «изолирующий» клетки эпителия 30% спиртовый раствор. Количество «изолирующей» жидкости берется примерно равным объему препарата. После десквамации клеток препараты, встряхивая, промывают 10 минут в проточной воде. Второй этап - девизуализация базальной мембраны как предотвращение приобретения ею светоотражательной способности импрегнируемым серебром, достигается дозированным вымыванием аммиачного раствора азотнокислого серебра с поверхности препарата (из базальной мембраны) дистиллированной водой в течение 2 минут перед процедурой восстановления импрегнированного серебра в металлическое состояние. Несеребренная тонкая базальная мембрана является прозрачной при микроскопии, подобно многим другим структурам неокрашенных биологических тканей. Отметим, что попытки удаления аммиачного раствора серебра из мезотелиальных клеток вымыванием его дистиллированной водой не привели к желаемому результату. Аргентофилия мезотелиальных клеток оказалась выше аргентофилии подпокровных коллагеновых волокон - коллагеновые волокна теряют серебро быстрее, чем клетки. В свою очередь, аммиачное серебро из базальной мембраны удаляется намного быстрее, чем из подпокровных коллагеновых волокон, то есть на стадии полного вымывания серебра из базальной мембраны, подпокровные коллагеновые волокна сохраняют хорошую светоотражательную способность. Очевидно, это связано с тем, что коллагеновые фибриллы базальной мембраны, относящиеся к коллагену 4-го типа, намного тоньше, чем подпокровные коллагеновые волокна. Для десквамации мезотелиальных клеток выбран наиболее простой способ (по Ранвье), так как мезотелиоциты сами по себе очень легко слущиваются, а открывающаяся базальная мембрана в последующем девизуализируется.

Придание светоотражательной способности коллагеновым волокнам препарата осуществляется селективной импрегнацией их аммиачным раствором азотнокислого серебра, способом, основанным на общепринятом методе импрегнации серебром по Бильшовскому и на модификации его Гомори (Микроскопическая техника. Ромейс Б. / М.: Иностранная литература, 1953, стр.360-366). Для этого фиксированные формалином, после десквамации мезотелиальных клеток, пленочные препараты промывают в водопроводной воде в течение 6 часов, обезжиривают в 96% спирте 30 минут, промывают в проточной воде 10 минут, проводят через несколько порций (чашек) дистиллированной воды и сенсибилизируют, выдерживанием в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут в затемненном месте. Далее препараты промывают в течение 5 минут в 5 порциях дистиллированной воды и помещают в аммиачный раствор азотнокислого серебра на 30 минут в затемненном месте. После этого препараты промывают 2 минуты в 5 порциях дистиллированной воды для вымывания аммиачного раствора азотнокислого серебра из базальной мембраны и переносят на 30 секунд в 1% раствор формалина на дистиллированной воде для восстановления серебра в металлическое состояние - до придания препаратам черного оттенка. Остановку восстановления серебра производят в аммиачной воде. Затем осуществляют удаление остаточного фонового серебра выдерживанием препаратов в «моющем» растворе, состоящем из 10 мл аммиака, 40 мл спирта, 50 мл дистиллированной воды и 0,5 грамма детергента (стиральный порошок «Лотос») в течение 30 минут (раствор за это время окрашивается в светло-коричневый цвет не отражающими свет окислами серебра) и промыванием препарата в проточной воде в течение 10 минут с последующей проводкой через 2 порции дистиллированной воды. Готовые влажные и незаключенные препараты хранят в затемненном месте в склянке с дистиллированной водой с добавлением этилового спирта до 40%.

Аммиачный раствор азотнокислого серебра готовят следующим образом: 5 граммов азотнокислого серебра растворяют в 50 мл дистиллированной воды. В этот 10% раствор азотнокислого серебра осторожно по каплям, при постоянном взбалтывании, прибавляют крепкий аммиак. После полного растворения образовавшегося осадка проводят обратное титрование, осторожно прибавляя несколько капель 10% раствора азотнокислого серебра, пока появляющийся при этом осадок не начнет исчезать с трудом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Перед микроскопией подпокровные коллагеновые волокна препарата подвергают серебрению для придания им светоотражательной способности, при этом для обеспечения проникновения падающего света в толщу препарата и визуализации картины светоотражения волокон проводят превентивную десквамацию мезотелиальных клеток и предотвращают серебрение базальной мембраны.

Участок серозной оболочки с естественной поверхностью в виде отсепарованной пленки или пластинки (интактная диафрагма) помещают на 6 часов в «изолирующий клетки» 30% водный раствор спирта в количестве, приблизительно равном объему препаратов, затем, встряхивая, промывают в проточной воде в течение 10 минут для удаления слущенных мезотелиальных клеток, фиксируют в 10% формалине (толстые пленки - в расправленном виде) 10 суток, промывают в проточной воде не менее 6 часов (толстые препараты, диафрагма - 24 часа), помещают в 96% спирт на 30 минут для обезжиривания поверхности препаратов, промывают в проточной воде 10 минут, проводят через несколько порций дистиллированной воды. Далее препараты сенсибилизируют выдерживанием их в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут в затемненном месте. Объем раствора азотнокислого серебра должен превышать объем препаратов не менее чем в 5 раз. После этого препараты промывают в течение 5 минут в 5 порциях дистиллированной воды и помещают в аммиачный раствор азотнокислого серебра на 30 минут в затемненном месте. Затем препараты промывают 2 минуты в 5 порциях дистиллированной воды для удаления аммиачного раствора азотнокислого серебра из базальной мембраны и переносят на 30 секунд в 1% раствор формалина на дистиллированной воде для восстановления оставшегося импрегнированного серебра в металлическое состояние - до придания препаратам черного оттенка. Далее остановка восстановления серебра в аммиачной воде. Затем осуществляют удаление остаточного (фонового) серебра из препарата. Для этого препараты помещают на 30 минут в «моющий» раствор, состоящий из 10 мл аммиака, 40 мл спирта, 50 мл дистиллированной воды и 0,5 грамма детергента (стиральный порошок «Лотос» без отбеливателей и красителей). В завершение препараты промывают в проточной воде в течение 10 минут и проводят через 2 порции дистиллированной воды. Готовые влажные и незаключенные пленочные препараты хранят в затемненном месте в склянке с дистиллированной водой с добавлением этилового спирта до 40%.

Подготовленные таким образом пленочные препараты на время исследования извлекают из склянки, расправляют в плоской чашке с дистиллированной водой, переносят на предметное стекло и исследуют с помощью микроскопа плоского поля падающего света. Используют 6-25-кратные эпиобъективы с 6-25-кратными окулярами и 40-50-кратные эпиобъективы с 6-12-кратными окулярами. Микроскопию проводят в отраженном свете при одностороннем (азимутальном) косом падающем освещении. Для этого табельной эписистемой освещения микроскопа устанавливают режим падающего освещения методом темного поля (круговое - коаксиальное (бестеневое) косое падающее освещение), которое преобразуют в одностороннее косое падающее освещение краевым перекрыванием половины светового потока осветителя до поворотного зеркала перед эпиобъективом непрозрачной шторкой (боковым смещением ползунка-держателя светофильтров в гнезде для введения в световой поток сменных светофильтров). Изменение азимута освещения коллагено-волокнистых конструкций, к примеру, вдоль сформированных ими волн или перпендикулярно к их фронту, осуществляют поворотом предметного столика микроскопа.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими фигурами: на фиг.1 изображена схема микроскопии по прототипу с помощью микроскопов плоского поля проходящего света, где 1 - объектив микроскопа плоского поля проходящего света для работы с покровным стеклом, 2 - покровное стекло, 3 - заключенный между стеклами объект (и его тень), 4 - односторонний косой падающий свет от переносного источника света. На фиг.2 - схема табельного освещения методом темного поля микроскопов плоского поля падающего света - круговым (коаксиальным) бестеневым косым падающим светом, где 5 - эпиобъектив микроскопа плоского поля падающего света, 3 - объект (без тени), 6 - табельное падающее освещение объекта методом темного поля (круговое бестеневое косое падающее освещение). На фиг.3 представлена схема предлагаемого одностороннего (азимутального) косого падающего освещения, где 5 - эпиобъектив микроскопа плоского поля падающего света, 3 - объект (и его тень), 4 - одностороннее косое падающее освещение объекта, 7 - шторка для краевого перекрывания половины светового потока.

На фиг.4-11 представлены фотографии изображений подпокровных коллагеновых волокон, полученных с помощью предлагаемого способа.

Фиг.4. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя межреберной плевры, где 8 - синхронизированные по фазе, амплитуде и длине волны, правого вращения спиралевидно извитые-волнистые коллагеновые волокна. Спиралевидная волнистость имеет «правильную» - симметричную, метамерную форму, то есть равными являются длины периодов волн (шагов спиралей - по оси Y вдоль основного направления волокна), так же равными являются боковые отклонения волокна по оси Х - перпендикулярно к основному направлению волокна в тангенциальной плоскости - в плоскости поверхности препарата и боковые отклонения волокна по оси Z - перпендикулярно к поверхности препарата, то есть в сторону серозной полости и в глубь препарата. Такая синхронизированная волнистость коллагеновых волокон придает волнистость всему поверхностному волокнистому слою, формируя на его поверхности регулярные волны с симметричными склонами возвышений и углублений; 9-9 - фронт волны поверхности. Он располагается под углом, близким к прямому к основному направлению формирующих его коллагеновых волокон. Стрелка - направление дивергенции волны поверхности. Одна фигура дивергенции является результатом локального дискретного увеличения длины коллагеновых волокон, формирующих данную волну, на длину периода одной их волнистости, то есть увеличения площади серозной оболочки в направлении дивергенции волн поверхности (или уменьшения этой площади в обратном направлении - в направлении конвергенции этих волн). 10 - разреженные участки поверхностного волнистого слоя зоны «диафрагмы люка» небольших размеров. Они несколько нарушают синхронность параметров волнистостей соседних коллагеновых волокон. Объектив 25; окуляр 12,5. Направление освещения справа-снизу (в северо-западном азимутальном направлении).

Фиг.5. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя диафрагмальной плевры. Основное направление коллагеновых волокон (ось Y) поворотом предметного столика ориентировано по нулевому азимуту. Синхронизация волнистостей соседних коллагеновых волокон не строгая. Витки спиралей отдельных волокон также являются несимметричными, с признаками сдавленности по оси Z. Правого вращения спиралевидные волнистости соседних волокон синхронизированы по амплитуде, по длине волн, но несколько сдвинуты по фазе колебаний. Фазы колебаний восточных волокон (11) несколько смещены вдоль соседних западных волокон (12) к северу примерно на 45 градусов фазового угла - на одну восьмую длины периода волнистости. При этом направление фронта волны поверхности (9-9) располагается под азимутальным углом около 45 градусов по часовой стрелке от северного полюса к основному направлению коллагеновых волокон. Локальное направление коллагеновых волокон под цифрами 11, 12 на гребне волны (поверхностный участок витка-шага спирали) расположено под азимутальным углом около 30 градусов, а в глубоком участке витка спирали (13) - около 300 градусов. Отклонения участков витков спиралей в плане (в тангенциальной плоскости) описаны по ходу волокна с южного полюса к северному полюсу, то есть в нулевом азимутальном направлении. Объектив 25; окуляр 12,5. Направление освещения под азимутальным углом около 150 градусов (освещение сверху-слева). Все азимутальные направления указаны от нулевого - северного направления по направлению движения часовой стрелки. Для обозначения локальных изменений направления оси коллагенового волокна применена картографическая терминология, приняв ход описания этих отклонений вдоль волокна в направлении нулевого азимута.

Фиг.6. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя межреберной плевры. Основное направление коллагеновых волокон поворотом предметного столика ориентировано по нулевому азимуту. 8 - коллагеновые волокна спиралевидной волнистости правого вращения. Волны поверхности с асимметричными склонами возвышений и углублений имеют вид широких валиков с пологими вершинами, разделенных узкими глубокими бороздами с крутопадающими склонами. В формировании одного гребня волны поверхности участвуют несколько периодов волнистости коллагеновых волокон (14), интервал между волнами поверхности равняется нескольким периодам волнистости формирующих их коллагеновых волокон. То есть подобная крупная и относительно регулярная волнистость поверхности обусловлена складками поверхностного волнистого слоя как такового, а не волнистостью его коллагеновых волокон. Направление фронта волн поверхности, очевидно, не связано с основным направлением волокон. Объектив 25; окуляр 12,5. Направление освещения под азимутальным углом около 220 градусов.

Фиг.7. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя легочной плевры справа. Коллагеновые волокна спиралевидной конформации левого вращения. 11 - локальное направление коллагенового волокна на гребне волны (поверхностный участок витка спирали) под азимутальным углом 280-310 градусов, а в глубоком участке витка спирали (13) - около 30-40 градусов при описании хода волокна в нулевом азимутальном направлении. У спиралей коллагеновых волокон протяженность глубоких участков витков несколько больше протяженности поверхностных их участков. Объектив 25; окуляр 25. Направление освещения под азимутальным углом около 180 градусов.

Фиг.8. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя перикарда. Рельеф поверхности образован узкими гребневидными возвышениями с широкими плоскими углублениями между ними. Объектив 12,5; окуляр 12,5. Направление освещения под азимутальным углом около 45 градусов.

Фиг.9. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя перикарда. Тот же участок препарата, что и на фиг.8. Объектив 50; окуляр 12,5. Препарат ориентирован основным направлением коллагеновых волокон по нулевому азимуту. Коллагеновые волокна формируют сильно растянутую спираль правого вращения с превалированием протяженности глубоких участков своих ветвей. Поверхностные участки ветвей спиралей совершают полуоборот на коротком расстоянии, выпячиваясь в направлении свободной полости серозной оболочки, формируя узкие остроконечные гребневидные волны. При этом ширина гребня волны стремится к своему минимуму, равному диаметру всего одного коллагенового волокна (8). Направление фронтов волн поверхности зависит от синхронизированности фаз колебаний соседних волокон. При синфазных колебаниях - перпендикулярно основному направлению волокон. При смещении фаз колебаний восточно расположенных волокон в направлении нулевого азимута направление фронта волны поверхности (9-9) смещается от 90 градусов в сторону нулевого азимута. При смещении фаз колебаний восточно расположенных волокон в направлении южного азимута направление фронта волны поверхности поворачивает от 90 градусов азимутального угла в сторону его увеличения - в сторону южного азимута (15-15). Расстояние 15-15 - протяженность фронта отдельной волны поверхности. Она определяется количеством коллагеновых волокон, формирующих данную волну, волна 15-15 (по ее фронту) образована 18 волокнами. Направление освещения препарата под азимутальным углом около 180 градусов.

Фиг.10. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя сухожильного центра диафрагмальной плевры. Множество небольших «диафрагм люков» сходного строения и ориентации (10). Волнистость поверхности сохранена вне зоны «диафрагм люков». Объектив 12,5; окуляр 12,5. Направление освещения под азимутальным углом около 120 градусов.

Фиг.11. Совокупная поверхность коллагеновых волокон поверхностного волнистого слоя диафрагмальной брюшины. Множество крупных «диафрагм люков» преимущественно округлой (10) формы в проекции. Коллагеновые волокна поверхностного волнистого слоя в составе «диафрагмы люков» формируют разрежения, консолидируясь в трабекулы (16). Объектив 12,5; окуляр 12,5. Направление освещения под азимутальным углом около 220 градусов.

Полученные изображения позволяют осуществлять качественное исследование трехмерных рельефообразующих конструкций подпокровных коллагеновых волокон биологических оболочек для последующей интерпретации строения рельефа поверхности этих оболочек. В частности, регулярная волнистость поверхности оболочек, направление фронтов волн поверхности, строение склонов возвышений и углублений отдельных волн позволяют судить о направлении подпокровных коллагеновых волокон, о синхронизированности их волнистостей, о характере их конформативного строения. Полученные изображения позволяют интерпретировать «хаотичную» ориентацию мезотелиальных клеток как маскированную ориентацию их по направлениям поверхностных и глубоких участков ветвей спиралевидных подпокровных коллагеновых волокон. Фигуры конвергенции-дивергенции волн поверхности позволяют судить о направлении сужения-расширения площади поверхности оболочек. Изображения «диафрагм люков» позволяют идентифицировать их на мезотелиальной поверхности оболочек, судить об их размерах, форме, ориентации и распределении.

Полученные изображения позволяют изучать конформативные варианты строения отдельных коллагеновых волокон, выделять волокна спиралевидной конформации правого и левого вращения.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество изучения структурной организации поверхности биологических оболочек, наблюдая подпокровные коллагеново-волокнистые структуры в объемном изображении на тканевом уровне исследований, что обеспечивает получение дополнительной достоверной информации о строении и состоянии изучаемых объектов.

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к методам гистологических исследований биологических оболочек при помощи световых микроскопов. Отсепарованные пленки помещают на 6 часов в 30% водный раствор спирта в количестве, равном объему препарата. Промывают в проточной воде в 10 минут для удаления спущенных мезотелиальных клеток. Фиксируют в формалине, промывают и помещают в 96% спирт на 30 минут для обезжиривания поверхности. Затем сенсибилизируют в 10% растворе азотнокислого серебра в течение 10 минут. Затем импрегнируют серебро выдерживанием препарата в течение 30 минут в аммиачном растворе азотнокислого серебра, промывают 2 минуты в 5 порциях дистиллированной воды для удаления импрегнированного серебра из базальной мембраны, восстанавливают оставшееся импрегнированное серебро в металлическое состояние 1% формалином в течение 30 секунд до придания препарату черного оттенка. Проводят микроскопию на расправленных влажных незаключенных пленочных препаратах с помощью микроскопов плоского поля падающего света, оснащенных объективами для работы без покровных стекол, при одностороннем косом падающем освещении, осуществляя для этого краевое перекрывание половины светового потока табельной эписистемы освещения микроскопа в режиме темного поля непрозрачной шторкой. 2 з.п. ф-лы, 11 ил.

1. Способ исследования рельефообразующих структур биологических оболочек, включающий придание препарату светоотражательной способности импрегнацией серебра в виде азотно-кислой соли с последующим восстановлением его в металлическое состояние, изучение с помощью микроскопов плоского поля в отраженном свете при одностороннем косом падающем освещении, отличающийся тем, что светоотражательную способность придают подпокровным коллагеновым волокнам, для этого препарат предварительно помещают на 6 ч в 30%-ный водный раствор спирта в количестве, равном объему препарата и, встряхивая, промывают в проточной воде в течение 10 мин для удаления спущенных мезотелиальных клеток, фиксируют в формалине, промывают, помещают в 96%-ный спирт на 30 мин для обезжиривания поверхности, после чего препарат сенсибилизируют в 10%-ный растворе азотно-кислого серебра в течение 10 мин с последующей импрегнацией серебра выдерживанием в течение 30 мин в аммиачном растворе азотно-кислого серебра, промывают в течение 2 мин в 5 порциях дистиллированной воды для удаления импрегнированного серебра из базальной мембраны, проводят восстановление оставшегося импрегнированного серебра в металлическое состояние помещением в 1%-ный раствор формалина на 30 с до придания черного оттенка, а микроскопию проводят на расправленных влажных незаключенных пленочных препаратах микроскопами плоского поля падающего света, оснащенных объективами для работы без покровных стекол, причем одностороннее косое падающее освещение препарата осуществляют краевым перекрыванием половины светового потока табельной эписистемы освещения микроскопа в режиме темного поля непрозрачной шторкой.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат после этапа остановки восстановления серебра аммиачной водой для удаления «фонового» серебра помещают на 30 мин в «моющий» раствор, состоящий из 10 мл аммиака, 40 мл спирта, 50 мл дистиллированной воды и 0,5 г детергента с последующей промывкой в проточной воде в течение 10 мин и в 2 порциях дистиллированной воды.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что влажные и незаключенные пленочные препараты хранят в затемненном месте в склянке с дистиллированной водой с добавлением этилового спирта до 40%, а для исследования их временно извлекают из склянки, расправляют в плоской чашке с дистиллированной водой и переносят на предметное стекло.