СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИСОСУДИСТОЙ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам оценки функциональной активности тромбоцитов.

В качестве прототипа выбран способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов, включающий забор крови, ее фиксацию, получение обогащенной тромбоцитами плазмы и оценку степени диск-сферической трансформации тромбоцитов: их общего очертания в фас и профиль, четкости контуров, характера окраски и блеска, наличия отростков, их числа и длины (см. Шитикова А.С., Белязо О.Е., Тарковская Л.Р., Каргин В.Д. Метод определения внутрисосудистой активации тромбоцитов и его значение в клинической практике // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - №2. - С.23-35).

Однако известный способ субъективен, зависит от навыка врача-лаборанта, является качественным и не реализован в аппаратурном исполнении.

Задачей предлагаемого изобретения является объективизация и повышение точности исследования.

Поставленная задача решается за счет того, что кровь фиксируют этилен-диамин-тетрауксусной кислотой, определяют в искусственном сдвиговом потоке агрегацию тромбоцитов и при ее наличии оценивают выраженность внутрисосудистой активации тромбоцитов.

Способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов осуществляют следующим образом. Забирают кровь из вены, фиксируют ее этилен-диамин-тетрауксусной кислотой (ЭДТА) в концентрации 4,8 мкмоль/л, центрифугируют в режиме 1000 об/мин в течение 10 минут и получают обогащенную тромбоцитами плазму. Затем плазму, обогащенную тромбоцитами, помещают в камеру реоскопа и задают скорость сдвига 60 с-1.

Под действием искусственного сдвигового потока рецепторы тромбоцитов, ответственные за их агрегацию (прежде всего - GP IIb/IIIa), переходят из низкоаффинного состояния в высокоаффинное, что дает им возможность взаимодействовать с лигандами, прежде всего с фибриногеном. Этот процесс происходит при наличии в среде двухвалентных ионов кальция, которые поддерживают целостность комплекса интегринов α_IIbβ₃ и стабилизируют рецепторы GP IIb/IIIa в высокоаффинном состоянии. Переход рецепторов тромбоцитов GP IIb/IIIa из низкоаффинного в высокоаффинное состояние в отсутствие в среде ионов кальция невозможен, активация тромбоцитов происходит лишь в присутствии Ca²⁺. Определение агрегации тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме после стабилизации крови ЭДТА дает возможность судить о наличии на мембранах тромбоцитов рецепторов в высокоаффинном (наличие внутрисосудистой активации тромбоцитов) или низкоаффинном (отсутствие внутрисосудистой активации тромбоцитов) состояниях. Затем определяют суммарную оптическую плотность образовавшихся агрегатов и, если агрегация тромбоцитов в сдвиговом потоке не происходит, судят об отсутствии внутрисосудистой активации тромбоцитов, при наличии агрегации тромбоцитов оценивают ее выраженность, которая характеризует степень внутрисосудистой активации тромбоцитов. Степень агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке определяют максимальной величиной интегральной оптической плотности всех образовавшихся агрегатов, которая выражается в условных единицах (усл.ед.) оптической плотности.

Клинический пример 1.

Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов предложенным способом у здорового донора И., 37 лет.

Установлено, что агрегация тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке не происходила, что характеризует отсутствие внутрисосудистой активации тромбоцитов.

Клинический пример 2.

Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов тяжелообожженого больного Т., 31 года (история болезни №241896), в период токсемии (ожог 70% поверхности тела).

Установлено наличие агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке, ее степень составила 159,74 усл.ед.

Результаты исследования свидетельствовали о том, что у данного пациента часть рецепторов клеточных мембран экспрессирована, они находятся в высокоаффинном состоянии и имеется риск тромбоза, связанный с наличием в кровотоке активированных тромбоцитов. Учитывая это, пациенту следует назначать дезагрегантную терапию, прежде всего ингибиторы гликопротеиновых рецепторов.

Клинический пример 3.

Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов у амбулаторной пациентки Г. (24 года), страдающей гидраденитом.

Установлено наличие агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке, ее степень составила 573,84 усл.ед.

Назначение антитромботической терапии не входило в общепринятую схему лечения гидраденита. В данном случае, основываясь на результатах проведенного исследования, пациентка Г. имела достаточно высокий риск тромбоза. Следовательно, она нуждалась в назначении дезагрегационной терапии на фоне общепринятой схемы лечения гидраденита.

Проанализировав результаты исследований приведенных примеров, можно сделать следующие выводы: риск тромбоза у здорового донора И. маловероятен; у ожогового больного Т. существует риск тромбоза; у пациентки Г., страдающей гидраденитом, тромбоопасность состояния выше, чем у ожогового больного Т.

Преимуществами способа определения внутрисосудистой активации тромбоцитов являются объективность, точность исследования и возможность его цифровой реализации. Способ позволяет проанализировать, имеются ли экспрессированные рецепторы на мембранах тромбоцитов, а соответственно исключить либо выявить и спрогнозировать риск тромбоза у пациентов. Это особенно важно при обследовании больных с патологическими состояниями, сопровождающимися высоким риском внутрисосудистого тромбообразования, а также при проведении контроля эффективности проводимой дезагрегационной терапии. Использование ЭДТА для фиксации клеток крови, которая является хелатирующим агентом и, взаимодействуя с ионами кальция, образует растворимые соли. В результате этого связанный кальций не способен выполнять свою функцию агониста тромбоцитарной агрегации, что приводит к блокированию возможности перехода интегринов из низко- в высокоаффинное состояние. Однако если часть рецепторов тромбоцитарных мембран уже активирована, что и происходит при патологических состояниях с предрасположенностью к тромботическим осложнениям, блокада Ca²⁺ не может полностью устранить агрегацию тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке. Поэтому наличие или отсутствие агрегации тромбоцитов, фиксированных ЭДТА, в сдвиговом потоке дает объективное представление о наличии или отсутствии внутрисосудистой активации тромбоцитов.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу определения внутрисосудистой активации тромбоцитов. Способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов включает забор крови, фиксацию клеток крови этилен-диамин-тетрауксусной кислотой, центрифугирование. Затем определяют в полученной плазме активированные тромбоциты по максимальной величине интегральной оптической плотности всех образовавшихся агрегатов и при ее наличии оценивают выраженность внутрисосудистой активации тромбоцитов. Вышеописанный способ повышает точность определения внутрисосудистой активации тромбоцитов.

Способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов, включающий забор крови, фиксацию клеток крови, центрифугирование, получение обогащенной тромбоцитами плазмы и оценку наличия в ней активированных тромбоцитов, отличающийся тем, что клетки крови фиксируют этилен-диамин-тетрауксусной кислотой в концентрации 4,8 мкмоль/л, в полученной плазме определяют активированные тромбоциты в искусственном сдвиговом потоке со скоростью 60 с^-1 по максимальной величине интегральной оптической плотности всех образовавшихся агрегатов и при ее наличии, оценивают выраженность внутрисосудистой активации тромбоцитов.