Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Наиболее распространенным для определения активности панкреатической α-амилазы является метод, одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC), с использованием в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP). Первой стадией реакции является селективное ингибирование активности слюнного изофермента α-амилазы с помощью моноклональных антител (MAT) к слюнной α-амилазе. Оставшаяся активной панкреатическая α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).
Основным недостатком метода является использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.
Наиболее близким к заявленному набору реагентов - прототипом, является набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, имеющих следующий состав компонентов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MAT 5-100 мг/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное; реагент 2 - 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит; GalG2CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).
В основу набора для определения панкреатической α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что на первой стадии слюнной изофермент α-амилазы ингибируется с помощью MAT, на второй стадии - панкреатическая α-амилаза гидролизует GalG2CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце.
Недостатком прототипа является небольшой срок хранения реагентов - 3 месяца при температуре 4°С.
Технической задачей изобретения является повышение стабильности набора реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче и продление срока его хранения при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым набором реагентов, включающим два жидких реагента, готовых к использованию, при этом первый реагент (реагент 1) дополнительно содержит EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и бычий сывороточный альбумин (БСА), а хлорид кальция заменен на ацетат кальция; второй реагент (реагент 2) дополнительно содержит EDTA и азид натрия.
Предлагаемый набор реагентов включает следующие компоненты:
реагент 1, содержащий хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, БСА 0,5-2 мас.%, MAT 12,0-25,0 мг/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное; реагент 2, содержащий азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, GalG2CNP 2,5-20 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное.
Данный набор реагентов характеризуется правильностью определения активности панкреатической α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения набора реагентов при температуре 2-8°С составляет 1 год.
Включение в состав реагента 1 новых компонентов - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, БСА - способствующего стабильности антител, а также замена хлорида кальция на консервант ацетат кальция, позволяет повысить стабильность реагента 1 и продлить срок его годности до 1 года.
Включение в состав реагента 2 нового компонента - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, а также добавление консерванта - азида натрия позволяет повысить стабильность реагента 2 и продлить срок его годности до 1 года.
Определение активности панкреатической α-амилазы осуществляется при температуре реагентов 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента 1, выдерживают 5 минут и добавляют 0,25 мл реагента 2, через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность панкреатической α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:
А=ΔЕ/мин×2757,
Где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту;
2757 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.
Определяющими существенными отличиями предлагаемого набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, по сравнению с прототипом, являются:
- реагент 1 дополнительно содержит EDTA и БСА, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
- в реагенте 1 хлорид кальция заменен на ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
- реагент 2 дополнительно содержит EDTA, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
все компоненты в наборе использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения набора.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Готовят реагент 1 и реагент 2.
Для приготовления реагента 1 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке и доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Для приготовления реагента 2 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят все навески, кроме GalG2CNP, в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке, доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Далее раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают, добавляют навеску GalG2CNP и вновь тщательно перемешивают на магнитной мешалке.
В результате получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0
KSCN, ммоль/л - 400,0
Азид натрия, ммоль/л - 90,0
EDTA, ммоль/л - 0,2
Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7
БСА, мас.% - 2,0
MAT, мг/л-12,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 90,0
EDTA, ммоль/л - 0,2
GalG2CNP, ммоль/л - 2,5
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,9
Пример 2
Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 200,0
KSCN, ммоль/л - 150,0
Азид натрия, ммоль/л - 20,0
EDTA, ммоль/л - 2,5
Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0
БСА, мас.% - 1,0
MAT, мг/л - 25,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 20,0
EDTA, ммоль/л - 2,5
GalG2CNP, ммоль/л - 20,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5.
Пример 3
Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0
KSCN, ммоль/л - 50,0
Азид натрия, ммоль/л - 1,0
EDTA, ммоль/л - 5,0
Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0
БСА, мас.% - 0,5
MAT, мг/л - 20,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 1,0
EDTA, ммоль/л - 5,0
GalG2CNP, ммоль/л - 10,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 6,5.
Пример 4 Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.
К 1 мл реагента 1, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U», выдержали 5 минут при температуре 37°С и добавили 0,25 мл реагента 2. Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в таблице.
Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Использование предлагаемого набора реагентов позволит, по сравнению с прототипом:
- увеличить срок годности набора до 1 года путем обеспечения стабильности реагентов;
- расширить область применения и повысить функциональность набора за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.
Предлагаемый набор реагентов доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОБЩЕЙ α-АМИЛАЗЫ | 2009 |
|
RU2417374C1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ПАНКРЕАТИТА, РАЗВИВШЕГОСЯ НА ФОНЕ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ | 2002 |
|
RU2249433C2 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАННИХ НАРУШЕНИЙ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ПАНКРЕАТИТОМ | 2023 |
|
RU2824803C1 |
| РАСТВОР ДЛЯ БИКАРБОНАТНОГО ГЕМОДИАЛИЗА | 2012 |
|
RU2521361C2 |
| СШИТЫЕ КРИСТАЛЛЫ ЛИПАЗЫ, КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 1998 |
|
RU2380415C2 |
| ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПЛАСТИНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ МОЧЕВИНЫ | 2018 |
|
RU2710268C2 |
| СТАБИЛИЗИРУЮЩАЯ СРЕДА ДЛЯ α-GST В МОЧЕ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА α-GST В МОЧЕ | 1994 |
|
RU2142136C1 |
| СШИТЫЕ КРИСТАЛЛЫ ПРОТЕИНА С КОНТРОЛИРУЕМЫМ РАСТВОРЕНИЕМ | 1998 |
|
RU2241746C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОЛЛАГЕНАЗЫ | 2003 |
|
RU2236460C1 |
| ИЗОТОНИЧЕСКИЙ ИНФУЗИОННЫЙ РАСТВОР | 2020 |
|
RU2744331C1 |
Изобретение относится к области медицины и касается набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающего реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающегося тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при указанном в формуле изобретения соотношении компонентов. Предложенный набор реагентов обладает повышенной стабильностью при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа. 1 табл.
Набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающий реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающийся тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при следующем соотношении компонентов:
при этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5-6,5.
| MORISHITA Y | |||
| et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Мессдоза | 1987 |
|
SU1500886A1 |
| ЯКОВЛЕВА Г.Е | |||
| Набор реагентов «Амилаза-Ново» для определения а-амилазы в сыворотке крови и моче // Новости «Вектор-Бест», 1999 Декабрь, | |||
