РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОБЩЕЙ α-АМИЛАЗЫ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Для определения активности α-амилазы были разработаны различные методы, основанные на способности фермента гидролизовать внутренние α-1,4-гликозидные связи олиго- и полисахаридов.

Наиболее распространенным для определения активности общей α-амилазы является способ, включающий использование в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G₇)-p-nitrophenil-(G₁)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G₇)-п-нитрофенил-(G₁)-α,D-мальтогептазид; Et-G₇PNP), одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC). В процессе реакции α-амилаза расщепляет Et-G₇PNP до G₂PNP, G₃PNP, G₄PNP, Et-G₃, Et-G₄ и Et-G₅. После этого α-глюкозидаза гидролизует G₂PNP, G₃PNP и G₄PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности общей α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G₇)-l-4-nitrophenil-(G₁)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).

Основным недостатком известного способа является двухстадийность реакции и использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.

Наиболее близким к заявляемому реагенту - прототипом, является набор реагентов для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, следующих составов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, вода - остальное, рН реагента 5-8; реагент 2, содержащий: 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид; GalG₂CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, вода-(остальное), рН реагента 5-8. В основу набора для определения активности общей α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что α-амилаза гидролизует GalG₂CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности α-амилазы в образце (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).

Недостатками прототипа являются:

- небольшой срок хранения реагентов: 3 месяца при температуре 4°С;

- трудоемкость при использовании системы из двух реагентов.

Технической задачей изобретения является повышение стабильности реагента для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче с сохранением высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым реагентом, содержащим следующие компоненты: субстрат GalG₂CNP 0,5-20 ммоль/л, хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,2-5,0 ммоль/л, Triton Х-100 0,075 об.%, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, (остальное), рН 5,5-6,5.

Данный реагент характеризуется правильностью определения активности общей α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения реагента при температуре 2-8°С составляет 2 года.

Включение в состав реагента новых компонентов - Triton Х-100, который является неионным поверхностно-активным веществом, EDTA - образующая комплексные соединения с большинством катионов, а также замена кальция хлорида на консервант кальция ацетат позволяет повысить стабильность реагента и продлить срок его годности до 2-х лет.

Определение активности общей α-амилазы осуществляют при температуре реагента 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента и через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность общей α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:

А=ΔЕ/мин×3060, где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту; 3060 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого реагента, по сравнению с прототипом, являются:

- реагент дополнительно содержит Triton Х-100 и EDTA в экспериментально подобранных, оптимальных количествах, что позволяет повысить стабильность последнего при хранении;

- в реагенте кальция хлорид заменен на более подходящий компонент - ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность реагента при хранении;

- жидкий реагент готов к использованию, что позволяет существенно упростить процедуру анализа;

- все компоненты в реагенте использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения реагента.

Предлагаемый реагент прошел клинические испытания и разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской, Федерации. Предлагаемый реагент доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.

Пример 1

Для приготовления реагента делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянные стаканы и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Растворы тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Растворы компонентов, кроме GalG₂CNP, переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр и доводят рН под контролем рН-метра до 5,73. Затем добавляют навеску GalG₂CNP. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. В результате получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0

KSCN, ммоль/л - 400,0

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7

Triton Х-100, об.% - 0,075

GalG₂CNP, ммоль/л - 0,5

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 6,0.

Пример 2

Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1. Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 300,0

KSCN, ммоль/л - 100,0

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0

Triton Х-100, об.% - 0,075

GalG₂CNP, ммоль/л - 10,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 5,5.

Пример 3

Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1.

Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:

Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0

KSCN, ммоль/л - 50,0

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0

Triton X-100, об.% - 0,075

GalG₂CNP, ммоль/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента составляет 6,5.

Пример 4

Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.

К 1 мл реагента, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U». Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в табл.1.

Таблица 1 Контрольная сыворотка Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л Полученный результат, Е/л «Precinorm U» («Roche», Германия) 40,8 (33,6-48,0) 40 «Precipath U» («Roche», Германия) 102 (84-120) 102 «c.f.a.s.» («Roche», Германия) 162 164 «Contornorm» («Biocon», Германия) 40,1 (32,9-47,3) 41 «Contropath» («Biocon», Германия) 102 (84-120) 101 «BioCal E» («Biocon», Германия) 171 177

Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Использование предлагаемого реагента позволит по сравнению с прототипом:

- увеличить срок годности реагента до 2-х лет за счет обеспечения его стабильности;

- расширить область применения и повысить функциональность реагента за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.

Изобретение относится к биохимии и медицине. Реагент для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержит в качестве субстрата 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид (GalG₂CNP), хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, EDTA, ацетат кальция, Triton Х-100, 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду. При этом рН реагента составляет 5,5-6,5. Использование реагента позволяет провести определение α-амилазы с высокой точностью и воспроизводимостью результатов. 1 табл.

Реагент для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, содержащий субстрат 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид (GalG₂CNP), хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит EDTA и Triton Х-100, а в качестве соли кальция - ацетат кальция, при следующем соотношении компонентов:
Хлорид натрия, ммоль/л 50,0-500,0 Калий роданистый, ммоль/л 50,0-400,0 Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0 EDTA, ммоль/л 0,2-5,0 Ацетат кальция, ммоль/л 0,7-10,0 Triton Х-100, об.% 0,075 GalG₂CNP, ммоль/л 0,5-20,0 MES, ммоль/л 50,0 Вода Остальное,