СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЕДНЕННОГО МОЛЕКУЛАМИ СТАБИЛИЗАТОРОВ ВОДНОГО РАСТВОРА АЛЬБУМИНА, АДСОРБЕНТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В СПОСОБЕ, ПРИМЕНЕНИЕ ВОДНОГО РАСТВОРА АЛЬБУМИНА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2011 года по МПК C07K1/22 A61K38/38 A61K9/00 

Настоящее изобретение относится к способу получения водного раствора альбумина из его исходного раствора, содержащего молекулы стабилизаторов, которые способны занимать связывающие участки альбумина и по меньшей мере часть которых для повышения связывающей способности альбумина (ССА), т.е. его способности связывать другие молекулы, например молекулы с тем или иным физиологическим действием, удаляют из альбумина, представленного в виде его исходного раствора, и отделяют от последнего.

Предпосылки создания изобретения

При многочисленных тяжелых заболеваниях, приводящих к развитию функциональной недостаточности тех или иных органов, центральную роль играет диспропорция между емкостью или вместимостью кровеносных сосудов и фактическим объемом их наполнения кровью. Слишком большая емкость кровеносных сосудов или слишком малый объем их наполнения кровью приводит к падению кровяного давления и в результате к недостаточному кровоснабжению органов. И наоборот, слишком малая емкость кровеносных сосудов или слишком большой объем их наполнения кровью приводит к повышению кровяного давления и, как следствие, к развитию сердечной недостаточности и/или отеку легкого.

Падение кровяного давления с сопровождающим его снижением кровоснабжения органов может быть обусловлено и внезапным, и постепенным уменьшением объема проходящей по кровеносным сосудам крови. Внезапное уменьшение объема проходящей по кровеносным сосудам крови может происходить при кровотечениях. Причиной же постепенного уменьшения объема проходящей по кровеносным сосудам крови может являться, например, потеря жидкой части крови в результате ее транссудации из сосудистого ложа в межклеточное пространство из-за снижения концентрации альбумина как обладающего онкотическим действием белка (например, вследствие нарушения его синтеза при заболеваниях печени). Падение кровяного давления может быть также обусловлено внезапным или постепенным увеличением емкости кровеносных сосудов. Внезапное расширение сосудов происходит, например, в результате быстрого массового выброса в кровь сосудорасширяющих тканевых гормонов, таких как гистамин, брадикинин, калликреин, лейкотриены или простагландины, в частности при анафилактическом шоке. Постепенное же расширение сосудов происходит в результате хронического повышения давления в воротной вене в сочетании с повышенным содержанием вазодилататоров в артериолах чревного сплетения и приводит из-за увеличения емкости сосудов к гепаторенальному синдрому с образованием асцита.

В любом случае между емкостью сосудов и объемом их наполнения кровью существует диспропорция, для устранения которой в медицине используются две возможные лечебные концепции.

Обычно сначала предпринимают попытку увеличить объем жидкости внутри сосудов путем введения кристаллоидных или коллоидных кровезамещающих растворов. Если подобная мера не приводит к увеличению среднего артериального давления до уровня, при котором обеспечивается достаточное кровоснабжение всех органов, то в качестве следующей меры начинают применять “вазопрессоры” (“вазоконстрикторы”, например катехоламины) с сосудосуживающим действием. Добиться подобной вазоконстрикции стремятся прежде всего при снижении сосудистого тонуса, встречающемся при заболеваниях печени и сепсисе, с тем, чтобы вновь уменьшить таким путем емкость сосудистой системы.

При заболеваниях, при которых острая или хроническая вазодилатация вызывается повышенным уровнем вазодилататоров, длительное поддержание приемлемого кровяного давления путем инфузий для увеличения объема жидкости внутри сосудов невозможно без применения вазоконстрикторов. К подобным, требующим интенсивного лечения проблемным патологическим состояниям относятся, например, печеночная недостаточность с сопровождающими ее падением кровяного давления и гепаторенальными функциональными нарушениями (развитие почечной недостаточности на фоне печеночной недостаточности из-за нарушения кровоснабжения) или сепсис. При обоих таких патологических состояниях наблюдается высокая смертность, а их лечение связано в медицинской практике с высокими затратами.

Согласно существующим в настоящее время подходам к решению описанных выше проблем рекомендуется введение кровезамещающих жидкостей в сочетании с применением вазоконстрикторов. Однако продолжительность нахождения традиционных кровезамещающих жидкостей в сосудах ограничена. Кристаллоидные (солевые) инфузионные растворы быстро диффундируют в межклеточное пространство. Кровезаменяющие же растворы с полимерами, например крахмальные растворы (растворы гидроксиэтилкрахмала, ГЭК) или желатиновые растворы (Gelafundin®), продолжают действовать и по истечении продолжительного времени их нахождения в сосудах, поскольку они благодаря своему свойству связывать воду удерживают во внутрисосудистом пространстве содержащуюся в плазме воду и таким путем позволяют длительно повышать объем жидкости внутри сосудов. Однако применение искусственных полимеров в кровезамещающих жидкостях связано с проблемой их непереносимости некоторыми людьми.

Особо пригодным для применения в качестве кровезаменителя является раствор природного коллоида - сывороточного альбумина. Сывороточный альбумин на протяжении нескольких десятилетий используется в медицине в качестве плазмозаменителя и считается биологически наиболее переносимым и тем самым наиболее предпочтительным кровезаменителем, хотя и самым дорогим среди всех кровезаменителей.

Растворы человеческого сывороточного альбумина для инфузии имеются на рынке. Однако к таким растворам для их пастеризации и хранения необходимо добавлять стабилизаторы во избежание спонтанной полимеризации альбумина. В качестве таких стабилизаторов чаще всего индивидуально либо в комбинации используют N-ацетилтриптофан и октановую кислоту, соответственно ее натриевые соли. Подобные стабилизаторы, обладая исключительно высоким сродством к молекуле альбумина, легко связываются с ней и при этом занимают и блокируют связывающие участки альбумина, имеющие важное значение для его биологической функции.

По результатам метаанализов было установлено, что при применении растворов сывороточного альбумина в отделении интенсивной терапии отмечалась повышенная смертность по сравнению с применением иных плазмозамещающих растворов (Cochrane Metaanalyse, BMJ 317, 1998, сс.235-240). На основании этих данных можно утверждать, что применение традиционных инфузионных растворов альбумина за исключением небольшого количества определенных показаний не дает никаких клинических преимуществ. В настоящее время не известно, какое именно отрицательное влияние на теоретически идеальные свойства сывороточного альбумина в качестве плазмозаменителя оказывает процесс приготовления традиционных растворов сывороточного альбумина (фракционирование с последующими пастеризацией и стабилизацией). В литературе неоднократно высказывалось предположение, что стабилизаторы - N-ацетилтриптофан и октановая кислота - при определенных условиях могут обладать опасными побочными действиями. По этой причине представляется целесообразным удалять такие стабилизаторы из раствора альбумина перед его введением пациенту, тем более что они также с высоким сродством занимают и блокируют связывающие участки альбумина, необходимые для выполнения им важных функций. Однако после удаления стабилизаторов из растворов альбумина вновь возникает упомянутая выше проблема спонтанной полимеризации альбумина и тем самым ухудшения сохраняемости подобных растворов.

Биологически важная способность человеческого сывороточного альбумина связывать лиганды является предметом разнообразных публикаций. Достаточно обширную информацию по этой тематике можно найти помимо прочего у J. Peters jr., All about Albumin, изд-во Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto, 1996, а также у Pacifici G.M., Viani A., Methods of Determining Plasma and Tissue Binding of Drugs, Clin. Pharmacokinet., 23(6), 1992, cc. 449-468. Однако в связи с огромным разнообразием существующих методов определения связывающей способности альбумина получаемые ими результаты трудно сопоставимы между собой, а их интерпретация применительно к их медицинской значимости практически невозможна.

Одним из новых методов определения связывающих свойств альбумина является анализ способности альбумина связывать дансилсаркозин (Klammt S., Brinkmann В., Mitzner S., Munzert E., Loock J., Stange J., Emmrich J., Liebe S., “Albumin Binding Capacity (ABiC) is reduced in commercially available Human Serum Albumin preparations with stabilizers”, Zeitschrift für Gastroenterologie, дополнение, 39, 2001, cc. 24-27). Этот метод основан на измерении ультрафильтруемой доли тест-маркера - дансилсаркозина - в определенных экспериментальных условиях и соотнесении этой связывающей способности с таковой сравнительного альбумина.

При сравнении здоровых доноров крови с пациентами, страдающими тяжелым заболеванием печени, удалось обнаружить значительное снижение связывающей способности сывороточного альбумина, которое объясняется усиленным занятием связывающих центров сывороточного альбумина эндогенными лигандами вследствие нарушения дезинтоксикационной функции печени у участвовавших в исследовании пациентов. Известно, что способность имеющихся в продаже препаратов человеческого сывороточного альбумина связывать определенные маркеры-модели (например, ибупрофен) также существенно ограничена.

Известно также, что способность альбумина без лигандов связывать дансилсаркозин можно снизить со 100% до примерно 60% путем постепенного добавления N-ацетилтриптофана до молярного соотношения 1:1 (по данным анализа ССА по методу Klammt и др., 2001).

В технической и медицинской литературе существуют многочисленные публикации, посвященные технологии выделения и очистки альбумина из донорской плазмы, соответственно очистки полученного биотехнологическим (рекомбинантным) путем альбумина. Однако все эти публикации относятся преимущественно к получению максимально чистой альбуминовой фракции и к удалению иных белковых компонентов или потенциально токсических компонентов из плазмы крови, соответственно из векторной системы в случае получения альбумина путем рекомбинации.

Для удаления низкомолекулярных лигандов, таких как стабилизаторы в имеющихся в продаже растворах сывороточного альбумина, до 1967 г. использовали метод Гудмана (Goodman D.S., Science, 125, 1957, с.1996), основанный на экстракции смесью из изооктана и уксусной кислоты, соответственно метод Уильямса (Williams E.J. и Foster J.F., J. Am. Chem. Soc., 81, 1959, c.965), основанный на спонтанном образовании липидного слоя в сильно кислой среде. Оба этих метода требуют исключительно высоких затрат времени на их проведение и из-за потенциальной токсичности не пригодны для приготовления терапевтических препаратов. Полученные этими методами растворы альбумина обладают очень плохой сохраняемостью.

Начиная с 1967 г. используемые в качестве стабилизаторов в растворах альбумина свободные жирные кислоты, такие как октановая кислота, удаляют путем сильного подкисления раствора альбумина и последующей его обработки активированным углем. Этот метод впервые был описан у Chen и др. в Journal of Biological Chemistry, т.212, №2, 25 января 1967, сс.173-181. При удалении жирных кислот этим способом раствор альбумина в дистиллированной воде подкисляют с помощью кислоты (HCl) до значения pH 3 или менее для возможности раскручивания или распрямления таким путем молекулы альбумина в результате разрыва водородных мостиковых связей и дополнительно для протонирования соответствующих жирных кислот. За счет этого связь между альбумином и жирной кислотой ослабляется настолько, что жирная кислота может в виде небольшой молекулы диффундировать к активированному углю. После этого раствор альбумина смешивают с активированным углем и в течение 1 часа перемешивают в ледяной бане магнитной мешалкой. Затем активированный уголь отделяют от смеси путем ее 20-минутного центрифугирования при 20200g. Этим способом можно удалять из раствора альбумина различные жирные кислоты. Подобный, используемый до настоящего времени в качестве стандарта способ удаления жирных кислот был разработан в результате тщательных экспериментов с различными условиями его проведения, в частности экспериментов с разными значениями pH и с разными массовыми соотношениями между активированным углем и альбумином, среди которых описанная выше стандартная процедура оказалась наиболее успешной. Отделения стабилизаторов от молекулы альбумина удалось, таким образом, добиться лишь за счет нарушения структуры молекулы альбумина и связанного с этим снижения его связывающей способности в сильно кислой среде. Попытки удаления значительных количеств свободных жирных кислот из человеческого сывороточного альбумина при значениях pH выше 3 оказались неуспешными.

Существенный недостаток описанного выше известного способа состоит в структурном изменении молекулы альбумина из-за значительного подкисления его раствора в водной среде. По этой причине не только разрываются петлеобразующие связи между удаленными друг от друга аминокислотами, но и обнажаются гидрофобные связывающие “карманы”, что приводит к увеличению адсорбции альбумина использованным активированным углем. Согласно приведенным в публикации Chen и др. данным потери альбумина с гранулированным активированным углем при удалении жирных кислот предложенным ими способом составляют 20%. Этот способ не пригоден для первичного получения коммерческих терапевтических растворов альбумина, поскольку из-за структурных изменений молекулы альбумина инициируется спонтанная полимеризация человеческого сывороточного альбумина при его хранении.

Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ, который позволял бы простым, быстрым и экономичным путем в щадящих для альбумина условиях подготавливать стабилизированный, имеющийся в продаже исходный раствор альбумина, например, у постели пациента непосредственно перед введением ему, с удалением из раствора альбумина преобладающей части стабилизаторов и с повышением связывающей способности альбумина без нарушения или повреждения при этом его структуры.

Подобный способ должен прежде всего обеспечивать повышение связывающей способности альбумина на его связывающем участке II Садлоу (Sudlow), что имеет первостепенное значение для эффективной иммобилизации альбумином эндогенных, проявляющих сродство к нему токсинов при любом применении альбумина в кровезамещающей терапии с внутривенным вливанием содержащих его растворов, а также при экстракорпоральной детоксикации, например при плазмообмене с замещением плазмы альбумином или при экстракорпоральном альбуминовом диализе.

Указанная задача решается с помощью способа получения водного раствора альбумина из его исходного раствора, содержащего молекулы стабилизаторов, которые способны занимать связывающие участки альбумина и по меньшей мере часть которых для повышения способности альбумина связывать другие молекулы удаляют из альбумина, представленного в виде его исходного раствора, и отделяют от последнего, для чего

а) исходный раствор альбумина вводят в контакт при значении рН больше 3 с твердым адсорбентом, сродство которого к по меньшей мере части используемых молекул стабилизаторов, предпочтительно ко всем используемым молекулам стабилизаторов, выше, чем сродство альбумина к соответствующим молекулам стабилизаторов, и

б) раствор альбумина отделяют от адсорбента.

Предлагаемый в изобретении способ предпочтительно проводить при значении pH в пределах от 5 до 9, прежде всего от 6 до 8. Наиболее же предпочтительно проводить предлагаемый в изобретении способ при значении pH в пределах от 6,9 до 7,5.

При современном медицинском применении человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в качестве кровезаменителя (в общей сложности около 200 тонн в год) в четверти случаев наряду с его коллоидно-осмотическими свойствами важное значение имеет также наличие у него способности эффективно связывать токсины (например, бензодиазепины), а именно: при показаниях, связанных с заболеваниями печени. Однако в имеющихся в продаже препаратах человеческого сывороточного альбумина подобная его способность ограничена занимающими связывающие участки стабилизаторами (N-ацетилтриптофаном и октаноатом), из-за чего связывающая способность альбумина (ССА) оказывается снижена. Предлагаемый же в изобретении способ позволяет непосредственно по месту применения подготавливать к употреблению имеющийся в продаже, стабилизированный раствор альбумина без нежелательного значительного изменения значения его pH. Подготовленный предлагаемым в изобретении способом раствор содержит альбумин с повышенной ССА.

Благодаря этому свойства человеческого сывороточного альбумина в качестве плазмозаменителя клинически улучшаются настолько, что связывающая способность альбумина сравнивается с физиологической транспортируемостью человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Тем самым оказывается положительное влияние на функцию системы кровообращения, почек и головного мозга пациентов и существенно улучшается соотношение затраты/эффект.

Изобретение основано на том неожиданно установленном факте, что при соответствующем осуществлении предлагаемого в изобретении способа и при использовании приемлемого адсорбента содержащиеся в имеющемся в продаже растворе альбумина и используемые для его стабилизации и для предотвращения его спонтанной полимеризации стабилизаторы, прежде всего жирные кислоты со средней длиной цепи (например, октаноат), можно просто и быстро удалять из раствора альбумина без необходимости существенного снижения его значения pH и без излишне высоких затрат на необходимое оборудование в степени, при которой обеспечивается измеримое повышение связывающей способности альбумина (ССА). Поэтому предлагаемый в изобретении способ особенно пригоден для подготовки к употреблению имеющихся в продаже стабилизированных растворов альбумина по месту их применения или у постели пациента с возможностью их введения пациенту непосредственно после подобной подготовки. Еще одно преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в том, что альбумин в растворе не требуется подвергать воздействию никаких экстремальных условий, как например известное из уровня техники существенное снижение значения pH с целью удаления стабилизаторов из связывающих их участков молекулы альбумина путем разрыва связей между удаленными друг от друга аминокислотами полипептидной цепи альбумина, которыми определяется образование петель в молекуле альбумина и свойства его связывающих участков. Тем самым при осуществлении предлагаемого в изобретении способа не происходит известное из уровня техники как отрицательный фактор структурное изменение молекулы альбумина.

Определения

Связывающая способность альбумина (ССА)

Связывающую способность альбумина (ССА) согласно настоящему изобретению определяют по методу, описанному у Klammt и др., 2001. Для этого сначала путем измерения интенсивности рассеянного света (нефелометрия) определяют концентрацию альбумина в его растворе, концентрацию альбумина в котором затем путем его разбавления доводят до 150 мкмолей/л или 300 мкмолей/л. После этого единичный объем раствора альбумина смешивают в эквимолярном соотношении со взятым в определенной концентрации флуоресцентным индикатором (дансилсаркозин, фирма Sigma Chemical), специфично связывающимся со связывающим участком II альбумина (участком связывания диазепама), и инкубируют в течение 20 мин при 25°С. По завершении инкубации несвязанный флуоресцентный индикатор отделяют от раствора альбумина путем ультрафильтрации (ультрафильтрационная система Centrisart I, фирма Sartorius, Геттинген, Германия, отсечка по молекулярной массе 20000 дальтон) и путем флуоресцентной спектроскопии (система Fluoroscan, фирма Labsystems, Финляндия, возбуждение на длине волны 355 нм, испускание на длине волны 460 нм) определяют количество несвязанного флуоресцентного индикатора в отделенном растворе. Для усиления флуоресценции в раствор несвязанного флуоресцентного индикатора добавляют альбумин без лигандов (альбумин без жирных кислот, фирма Sigma-Aldrich, выпускается в порошковой форме) в концентрации 150 мкмолей/л или 300 мкмолей/л. Параллельно с анализом раствора пробного альбумина таким же путем анализируют соответствующий раствор контрольного альбумина. В качестве контрольного при этом используют очищенный и подвергнутый делигандизации человеческий сывороточный альбумин (BiSeKo, фирма Biotest Pharma GmbH, Драйайх, Германия). В другом варианте можно также использовать альбумин из пула сыворотки, полученной от более чем 50 здоровых доноров крови (в соответствии с критериями Немецкого общества Красного Креста). Связывающую способность альбумина (ССА) вычисляют по следующей формуле:

Примечание: связывающая способность альбумина (ССА), измеренная по методу Klammt и др. и вычисленная по приведенной выше формуле, не отражает абсолютную связывающую способность альбумина во всех его связывающих участках, а представляет собой относительную, выраженную в пересчете на связывающую способность контрольного альбумина способность альбумина связывать лиганды на своих связывающих участках II Садлоу (участках связывания диазепама). Поэтому определяемая описанным выше путем связывающая способность альбумина может также принимать значения, превышающие 100%. Однако измерение этого показателя подобным специальным методом позволяет также выявлять минимальные изменения связывающей способности альбумина, поскольку флуоресцентный индикатор может особо легко вытесняться из своего связанного состояния.

Связывающая способность альбумина в его имеющихся в продаже растворах, стабилизированных N-ацетилтриптофаном и/или октановой кислотой, соответственно ее натриевыми солями, при ее определении описанным выше методом обычно составляет менее 60%. Настоящее изобретение основано на применении адсорбционного метода с использованием адсорбента, который при значении pH более 3, предпочтительно при значении pH в пределах от 5 до 9, обладает более высоким сродством к используемым стабилизаторам (например, октановой кислоте и/или N-ацетилтриптофану), чем сам альбумин. Предлагаемый в изобретении способ позволяет в течение 30 мин повысить связывающую способность альбумина в его имеющихся в продаже стабилизированных растворах без их подкисления до значений, превышающих 100% (в пересчете на контрольный альбумин).

Существенное преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в том, что альбумин при этом не подвергается воздействию экстремальных условий, таких как сильное подкисление или применение денатурирующих средств, и поэтому не претерпевает никаких значительных структурных изменений, а в основном сохраняет свою нативную конформацию. Благодаря этому и благодаря лучшей связывающей способности после удаления стабилизаторов альбумин после инфузии пациенту проявляет гораздо более высокую активность, чем альбумин в имеющихся в продаже препаратах. Еще одно преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в возможности удаления им стабилизаторов из содержащих их растворов альбумина с высокой скоростью, а также в использовании для его реализации недорого оборудования и в предъявлении низких требований к последующей переработке обедненного стабилизаторами раствора альбумина. Так, в частности, альбумин после удаления стабилизаторов не требуется ренатурировать, например, путем спонтанного образования внутренних петель его полипептидной цепи, что сопряжено также с риском спонтанного образования молекул альбумина с неправильной конформацией или полимеризованных молекул альбумина. Обычно приготовленный предлагаемым в изобретении способом раствор альбумина после удаления из него стабилизаторов необходимо лишь пропустить через фильтр с размером пор более 65000 дальтон для удаления из раствора, возможно, присутствующих в нем крупных частиц. После этого раствор альбумина непосредственно готов к применению для инфузии пациенту. Благодаря этому раствор альбумина можно подготавливать к употреблению предлагаемым в изобретении способом непосредственно по месту применения (например, у постели пациента).

Поскольку альбумин обычно вводят человеку, например, в качестве плазмозаменителя, согласно изобретению целесообразно использовать человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Хотя предлагаемый в изобретении способ можно использовать для удаления из растворов альбумина самых разнообразных стабилизаторов или иных лигандов, он наиболее пригоден для удаления молекул стабилизаторов - N-ацетилтриптофана и/или октановой кислоты либо ее анионов. Предлагаемый в изобретении способ можно эффективно использовать для удаления лигандов с показателем К_а (константой ассоциации) более 10⁴.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления предлагаемого в изобретении способа исходный раствор альбумина вводят в контакт с адсорбентом на указанной выше стадии а), пропуская исходный раствор альбумина через колонку с адсорбентом (хроматографическую колонку).

В другом варианте исходный раствор альбумина вводят в контакт с адсорбентом на указанной выше стадии а), пропуская исходный раствор альбумина через образованный адсорбентом слой. Наиболее предпочтительно при этом пропускать исходный раствор альбумина через псевдоожиженный слой адсорбента, постоянно поддерживаемый в слабоинтенсивном движении, например, медленно вращающейся мешалкой или путем встряхивания либо пропускания через него разнонаправленных потоков. Подобная мера позволяет предотвратить образование из частиц адсорбента уплотненного слоя и закупоривания в нем путей прохождения потока, соответственно проточных каналов мельчайшими частицами, затрудняющими или даже полностью блокирующими прохождение раствора альбумина через слой адсорбента.

Как уже указывалось выше, раствор альбумина целесообразно отделять от адсорбента на указанной выше стадии б) путем фильтрации раствора альбумина через фильтр для улавливания частиц, который должен пропускать молекулы альбумина и задерживать твердые частицы адсорбента.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа используют адсорбент, частицы которого присутствуют на или в матрице в связанном с ней виде. Для применения в качестве образующих подобную матрицу материалов пригодны выполняющие функцию носителя частиц адсорбента ткани (например, ткани из полимерных волокон) или открытопористые пенополимеры (например, открытопористые пенополиуретаны). В другом варианте частицы адсорбента можно также просто помещать в смеси с высокопористыми частицами в качестве “распорок” в своего рода реакторы с неподвижным слоем, обеспечивающие расположение частиц адсорбента достаточно близко друг к другу и наличие между ними проточных каналов приемлемой ширины. При фиксации частиц адсорбента в высокопористых, открытопористых пенополимерах в них можно также одновременно или в последующем выполнять каналы, например, сверлением. В этих вариантах предпочтительна достигаемая с использованием ткани, соответственно полимера-носителя "рыхлая" упаковка или укладка частиц адсорбента, создающая малое гидравлическое сопротивление сравнительно высоковязким растворам альбумина. Помимо этого таким путем можно существенно снизить при фильтрации затраты на задерживание микрочастиц по сравнению с описанными выше вариантами.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа многократно, предпочтительно от 2 до 6 раз, повторяют стадии а) и б), каждый раз возвращая при этом полученный на стадии б) обработанный раствор альбумина на стадию а). Для повышения полноты удаления стабилизаторов из раствора альбумина предпочтительно при этом использовать при каждом выполнении стадии а) регенерированный путем удаления молекул стабилизаторов и/или свежий адсорбент. Для этого можно просто заменять адсорбент в содержащем его устройстве, однако более предпочтительно использовать несколько последовательно соединенных адсорбционных устройств (адсорберов) с адсорбентом и последовательно пропускать через них раствор альбумина.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа соотношение между количеством используемого адсорбента и концентрацией альбумина в его исходном растворе и/или продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) задают с таким расчетом, чтобы связывающая способность альбумина (ССА) в полученном растворе альбумина, измеренная по методу Klammt и др., составляла по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, особенно предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%. Необходимые для этого количество адсорбента и продолжительность контактирования с ним исходного раствора альбумина зависят от используемого исходного альбумина и выбранного аппаратурного оформления адсорбционного процесса и могут быть легко определены специалистом в данной области.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа соотношение между количеством используемого адсорбента и концентрацией альбумина в его исходном растворе и/или продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) задают с таким расчетом, чтобы концентрация связанных и концентрация несвязанных молекул стабилизаторов, прежде всего N-ацетилтриптофана и/или октановой кислоты либо ее анионов, в исходном растворе альбумина снижалась до уровня менее 70%, предпочтительно менее 50%, особенно предпочтительно менее 30%, наиболее предпочтительно менее 10%, от их исходных концентраций. Необходимые для этого количество адсорбента и продолжительность контактирования с ним исходного раствора альбумина зависят от используемого исходного альбумина и выбранного аппаратурного оформления адсорбционного процесса и могут быть легко определены специалистом в данной области.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа соотношение между количеством используемого адсорбента и концентрацией альбумина в его исходном растворе и/или продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) задают с таким расчетом, чтобы концентрация связанных и концентрация несвязанных молекул стабилизаторов, прежде всего N-ацетилтриптофана и/или октановой кислоты либо ее анионов, в исходном растворе альбумина снижалась до уровня менее 3,5 моля на моль альбумина, предпочтительно менее 2,5 моля на моль альбумина, особенно предпочтительно менее 1,5 моля на моль альбумина, наиболее предпочтительно менее 0,5 моля на моль альбумина.

В качестве адсорбента при осуществлении предлагаемого в изобретении способа наиболее предпочтительно использовать сыпучий или зернистый (дисперсный) материал, который набит в колонку или насыпан в виде слоя либо который внедрен в матрицу-носитель с образованием в результате между частицами адсорбента проточных для жидкости каналов, средний диаметр которых в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента, составляет от более 100 нм до менее 1000 мкм, предпочтительно менее 500 мкм, особенно предпочтительно менее 300 мкм, наиболее предпочтительно менее 200 мкм, прежде всего менее 100 мкм.

Чем меньше диаметр каналов, тем выше вероятность, соответственно частота, с которой молекулы альбумина будут соприкасаться со стенками образованных частицами адсорбента каналов, и тем выше скорость удаления стабилизаторов из раствора альбумина предлагаемым в изобретении способом. Очевидно, однако, что каналы не должны также иметь слишком маленькие размеры, поскольку в противном случае скорость протекания через них раствора альбумина упадет до слишком низкой. Поэтому особенно предпочтительны каналы, средний диаметр которых в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента, составляет от более 100 нм до менее 60 мкм, наиболее предпочтительно менее 10 мкм.

В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления предлагаемого в изобретении способа минимальную продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) выбирают в следующих пределах:

dm [мкм]/10 [мкм/мин]≤продолжительность контактирования [мин]≤dm [мкм]/0,1 [мкм/мин],

где dm означает средний диаметр каналов в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента.

Еще более эффективное удаление стабилизаторов из раствора альбумина достигается в том случае, когда минимальную продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) выбирают в следующих пределах:

dm [мкм]/4 [мкм/мин]≤продолжительность контактирования [мин]≤dm [мкм]/0,3 [мкм/мин],

где dm означает средний диаметр каналов в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления предлагаемого в изобретении способа в качестве адсорбента используют активированный уголь. Активированный уголь целесообразно использовать в виде суспендируемого материала или же в виде сыпучего материала, например, в набитом в колонку виде или в виде слоя адсорбента. При этом частицы активированного угля в насыпном слое должны образовывать между собой каналы, которые, с одной стороны, должны быть достаточно широкими для того, чтобы раствор альбумина мог протекать через адсорбент с достаточно высокой скоростью, а с другой стороны, должны быть достаточно узкими для того, чтобы молекулы альбумина, содержащиеся в его растворе, при его протекании через адсорбент с высокой частотой входили в непосредственный поверхностный контакт с частицами активированного угля. Особенно предпочтителен при этом насыпной слой активированного угля, частицы которого образуют между собой каналы, диаметр которых лежит в указанных выше предпочтительных пределах. С учетом этого средний диаметр каналов, образованных между частицами активированного угля, должен составлять в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами активированного угля, от более 100 нм до менее 1000 мкм, предпочтительно менее 500 мкм, особенно предпочтительно менее 300 мкм, наиболее предпочтительно менее 200 мкм, прежде всего менее 100 мкм.

В другом варианте активированный уголь можно также использовать в качестве адсорбента во внедренном в твердую пористую матрицу виде, например, в полимерную матрицу из целлюлозных, смоляных либо иных полимерных волокон или из открытопористых пеноматериалов. При внедрении активированного угля в матрицу необходимо учитывать, что она должна обеспечивать протекание через нее раствора альбумина и в то же время должна обеспечивать возможность контактирования раствора альбумина с находящимися в ней частицами активированного угля. Помимо этого образующий матрицу материал должен обладать определенной пористостью, чтобы поры в нем образовывали каналы указанного выше диаметра для протекания по ним раствора альбумина.

Предпочтительно далее использовать матрицу-носитель с гидрофильными свойствами, которые способствуют смачиванию адсорбента раствором альбумина. Подобная матрица-носитель может содержать, например, целлюлозу или иные гидрофильные природные либо синтетические полимеры.

Активированный уголь как таковой представляет собой пористый материал с макропорами (порами размером более 25 нм), мезопорами (порами размером в пределах от 1 до 25 нм) и микропорами (порами размером менее 1 нм) внутри его частиц и поэтому обладает очень большой (развитой) внутренней поверхностью. Размер таких пор активированного угля обычно измеряют путем определения мелассового числа (в случае макропор), по адсорбции метиленового голубого (в случае мезопор) и путем определения йодного числа (в случае микропор). Внутреннюю (удельную) поверхность определяют БЭТ-методом (удельная поверхность, определяемая методом Брунауэра-Эммета-Теллера по адсорбции азота) и выражают в м²/г активированного угля. Активированный уголь широко применяется в качестве адсорбента, который захватывает молекулы своими порами и удерживает в них, соответственно иммобилизует вещества за счет их связывания на своей поверхности или поверхности своих пор. Благодаря своим высокой пористости и большой внутренней поверхности активированный уголь обладает исключительно высокой адсорбционной емкостью в пересчете на его массу, соответственно на его объем. Очевидно, однако, что наличие у активированного угля высокой адсорбционной емкости предполагает возможность диффузии молекул в его поры.

Из всех известных из уровня техники публикаций, посвященных проблеме подготовки к употреблению имеющихся в продаже растворов альбумина, со всей очевидностью следует, что одного только применения активированного угля как такового недостаточно для удаления из молекулы альбумина очень прочно связанных с ней стабилизаторов, присутствующих в стабилизированном ими растворе альбумина, и прежде всего их удаления с приемлемой скоростью. Сказанное подтверждается и имеющимися сведениями об используемых в настоящее время способах удаления стабилизаторов из растворов альбумина, при осуществлении которых в качестве адсорбента хотя и применяют активированный уголь в виде взвеси, однако при повышенных значениях pH, превышающих 3, его использование оказывается неэффективным. Лишь после сильного подкисления раствора альбумина и связанного с этим структурного изменения или денатурирования альбумина при реализации известных способов удается отделить молекулы стабилизаторов от альбумина, которые после этого могут связываться активированным углем.

При создании изобретения было установлено, что при определенном расположении частиц адсорбента, прежде всего активированного угля, с образованием между ними каналов предпочтительных размеров молекулы альбумина в мягких условиях, например при значениях pH более 3, легче и быстрее высвобождают прочно связанные с ними молекулы стабилизаторов, чем это было известно ранее. При этом средний диаметр указанных каналов для возможности беспрепятственного прохождения через них молекул альбумина должен превышать 100 нм. Иными словами, такие каналы должны быть гораздо больше мезо- или микропор активированного угля, которыми обычно определяется его адсорбционная способность. Вместе с тем средний диаметр каналов между частицами адсорбента по возможности не должен также превышать 1000 мкм. При создании изобретения было установлено, что скорость удаления стабилизаторов из молекул альбумина тем выше, чем меньше средний диаметр каналов между частицами адсорбента, который при этом должен быть больше 100 нм. Частицы адсорбента предпочтительно должны занимать друг относительно друга такое положение, в котором между ними образуются сквозные каналы, т.е. каналы, каждый из которых имеет по меньшей мере по одному входу и одному выходу, чтобы попавшие в каналы молекулы альбумина не застревали в них, а могли вновь выходить из них.

Помимо этого при создании изобретения было установлено, что скорость удаления стабилизаторов из молекул альбумина при применении активированного угля в качестве адсорбента можно дополнительно повысить, если из всего многообразия имеющихся в продаже и выпускаемых типов активированного угля с самыми разнообразными показателями пористости и величинами внутренней поверхности использовать в качестве адсорбента те из них, у которых мелассовое число (согласно ИЮПАК - IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии)) составляет от 100 до 400, предпочтительно от 200 до 300. Помимо этого предпочтительно использовать активированный уголь, у которого показатель адсорбции метиленового голубого (согласно ИЮПАК) составляет от 1 до 100 г/100 г активированного угля, предпочтительно от 10 до 30 г/100 г активированного угля, йодное число (согласно ИЮПАК) составляет от 500 до 3000, предпочтительно от 800 до 1500, и/или общая внутренняя поверхность (определяемая БЭТ-методом) (согласно ИЮПАК) составляет от 100 до 5000 м²/г активированного угля, предпочтительно от 800 до 1400 м²/г активированного угля.

Объектами изобретения являются также адсорбент с описанными выше свойствами и особенностями, а также его применение для осуществления предлагаемого в изобретении способа. Объектом изобретения является далее применение водного раствора альбумина, полученного предлагаемым в изобретении способом, для приготовления средства, предназначенного для лечения гипоальбуминемии, средства, предназначенного для применения в качестве кровезаменителя, соответственно плазмозаменителя, и/или средства, предназначенного для улучшения функции системы кровообращения, почек и/или головного мозга пациента. Действие подобного средства основано на повышенной способности иммобилизовать физиологически активные вещества, обладающие сродством к альбумину.

Еще одним объектом изобретения является применение водного раствора альбумина, полученного предлагаемым в изобретении способом, для приготовления средства, предназначенного для очищения крови, в качестве плазмозаменителя или в качестве диализата для альбуминового диализа. Полученный предлагаемым в изобретении способом раствор альбумина прежде всего при его применении по указанному последним назначению оказывается значительно дешевле сопоставимых с ним растворов альбуминов с малым содержанием лигандов, например раствора полученного рекомбинантным путем человеческого сывороточного альбумина.

Предлагаемый в изобретении способ, соответственно полученный им раствор альбумина, обедненный стабилизаторами, имеет важное значение в медицине. Для организма пациентов с тяжелыми заболеваниями печени и гипотоническими и гипердинамическими нарушениями кровообращения характерна ограниченная связывающая способность альбумина (ССА), которую невозможно улучшить имеющимися на сегодняшний день стандартными препаратами альбумина. Несмотря на то что в настоящее время все еще не имеется экспериментального подтверждения этой взаимосвязи, теория дает все основания предполагать, что подобная ограниченная связывающая способность альбумина является следствием эндогенного накопления обладающих сродством к альбумину токсинов, физиологическое разложение которых поврежденная печень более не способна обеспечивать в достаточной степени. Все попытки устранения такой ограниченной связывающей способности альбумина и ее восстановления до нормального уровня с использованием имеющихся в продаже препаратов человеческого сывороточного альбумина оказываются неудачными из-за обусловленного технологическими особенностями излишне высокого содержания стабилизаторов в таких препаратах. Использование подобных стабилизаторов, однако, является обязательным для пастеризации растворов альбумина в целях их защиты от вирусов и для исключения спонтанной полимеризации альбумина при хранении его растворов. До настоящего времени удаление таких стабилизаторов требовало экстремального подкисления раствора альбумина и/или было связано с высокой потерей альбумина. В отличие от этого предлагаемый в изобретении способ позволяет получать раствор альбумина с повышенной связывающей способностью последнего непосредственно по месту применения такого раствора без значительного предварительного его подкисления.

Полученный предлагаемым в изобретении способом раствор альбумина можно помимо прочего использовать в качестве кровезаменителя с альбумином без стабилизаторов, обладающим высокой способностью связывать вазоактивные вещества и токсины, обладающие сродством к связывающему диазепам участку альбумина (так называемому связывающему участку II Садлоу). Предлагаемый в изобретении способ экономичен в осуществлении и требует малых аппаратурных затрат на его реализацию, и поэтому его без всяких затруднений можно, например, проводить непосредственно у постели пациента незадолго до инфузии ему раствора альбумина.

Благодаря повышенной согласно изобретению связывающей способности альбумина действие его раствора при его применении в качестве кровезаменителя основано не только, как это считалось ранее, на повышенном коллоидно-осмотическом, т.е. связывающем воду, действии в кровеносном сосуде, но и на активной иммобилизации сосудорасширяющих и иных токсичных веществ. Подобный эффект приводит к уменьшению вазодилатации и тем самым к сверхаддитивному воздействию кровезаменителя на режим наполнения сосудистого ложа кровью. Последний из указанных параметров в простейшем случае определяют измерением диастолического кровяного давления, которое оказывает существенное влияние на среднее артериальное давление и тем самым на кровоток в сосудистой системе. Помимо этого полученный предлагаемым в изобретении способом раствор альбумина предпочтительно использовать также для повышения эффективности связывания лигандов при альбуминовом диализе.

Преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в удалении стабилизаторов из раствора альбумина с высокой скоростью, т.е. в возможности удаления стабилизаторов из раствора альбумина за сравнительно короткое время. Так, в частности, предлагаемый в изобретении способ позволяет подготавливать к применению имеющийся в продаже раствор альбумина в течение 10-30 мин и значительно повышать при этом связывающую способность альбумина. Поэтому предлагаемый в изобретении способ помимо прочего идеально пригоден для подготовки стабилизированных, имеющихся в продаже растворов альбумина непосредственно у постели пациента, хотя в принципе изобретение не ограничено только подобным его применением. Предлагаемым в изобретении способом можно также удалять стабилизаторы из растворов альбумина в аптеках при клиниках или в иных учреждениях либо организациях.

Предлагаемый в изобретении способ позволяет снижать концентрацию стабилизаторов в имеющемся в продаже, стабилизированном октановой кислотой (октаноатом) и/или N-ацетилтриптофаном (N-ацетилтриптофанатом) растворе альбумина до уровня менее 5 молей на моль альбумина, предпочтительно до уровня менее 1 моля на моль альбумина, наиболее предпочтительно до уровня менее 0,2 моля на моль альбумина.

Ниже изобретение поясняется на примерах.

Примеры

Пример 1: Насыпной слой адсорбента в колонке

В эксперименте по сравнению эффективности удаления молекул стабилизаторов из стабилизированного ими раствора альбумина приготавливали и испытывали различные адсорбирующие материалы.

Для приготовления двух предлагаемых в изобретении адсорбирующих материалов определенный активированный уголь, а именно: активированный уголь Norit GAC 830 (фирма Norit) перерабатывали путем его размола в обычной промышленной мельнице до частиц разного размера. Размеры частиц размолотых продуктов затем определяли микроскопически, а также с помощью имеющегося в продаже анализатора размера частиц. Для приготовления первого предлагаемого в изобретении адсорбирующего материала (А1) активированный уголь Norit GAC 830 размалывали до частиц размером 1 мм (значение D50), а для приготовления второго предлагаемого в изобретении адсорбирующего материала (А2) активированный уголь Norit GAC 830 размалывали до частиц размером 0,1 мм (значение D50). Показатель D50 соответствует 50-му процентилю (см. также ниже). В качестве сравнительного адсорбирующего материала (V) использовали экструдированный активированный уголь Norit ROX в виде гранул цилиндрической формы (фирма Norit).

По 100 г каждого активированного угля набивали в снабженные сетчатым дном колонки диаметром 6 см и высотой 10 см и смачивали водой. После этого через каждый из адсорбирующих материалов в колонках по замкнутому контуру пропускали по раствору 20 г имеющегося в продаже альбумина в 330 мл раствора поваренной соли (фирма ZLB Behring, pH 7,2) с расходом 170 мл/мин. В начальный момент, а также через 20, 30, 60 и 120 мин определяли концентрацию октаноата, N-ацетилтриптофаната (N-AT) и альбумина, а также связывающую способность альбумина (по методу Klammt и др., 2001). Для сравнительного адсорбирующего материала указанные параметры дополнительно определяли также через 240, 1440 и 2880 мин после начала эксперимента. Полученные результаты приведены ниже в таблице 1.

При заполнении колонки экструдированным активированным углем Norit ROX его гранулы (частицы) из-за своей цилиндрической формы образуют между собой исключительно широкие промежутки, соответственно каналы, диаметр которых отчасти превышает 1 мм, что предпочтительно для поддержания необходимого напора, особенно при высоком расходе перерабатываемого раствора альбумина, составляющем от 100 до 250 мл/мин. Однако сравнение с предлагаемыми в изобретении адсорбирующими материалами А1 и А2, представляющими собой размолотый активированный уголь, свидетельствует о том, что подобный адсорбирующий материал, частицы которого образуют между собой каналы соответственно большой ширины, практически не пригоден для повышения связывающей способности альбумина за короткое время.

Для насыпных слоев из адсорбирующих материалов А1 и А2, представляющих собой размолотый активированный уголь и набитых в колонки, диаметр образуемых между их частицами каналов можно с достаточно хорошим приближением рассчитать по следующей формуле (I):

,

где R_K обозначает средний радиус каналов между частицами, a R_P обозначает средний радиус самих частиц.

При расчете по этой формуле полученные размолом частицы адсорбирующего материала А1 со средним диаметром 1 мм, т.е. с радиусом R_P 500 мкм, образуют между собой каналы со средним радиусом R_K, равным 77 мкм, т.е. каналы со средней шириной (также со средним диаметром), равной примерно 150 мкм. Полученные же размолом частицы адсорбирующего материала А2 со средним диаметром 0,1 мм, т.е. с радиусом R_p 50 мкм, образуют между собой каналы со средним радиусом R_k, равным 7,7 мкм, т.е. каналы со средней шириной (также со средним диаметром), равной примерно 15 мкм.

Результаты таких вычислений ширины каналов по приведенной выше формуле подтверждали также путем фиксации образцов материалов из колонок в смоле и путем последующего микроскопического исследования тонких срезов.

Таблица 1 Продолжительность контактирования Адсорбирующий материал Средняя ширина каналов [мкм] Октаноат/альбумин [моль/моль] N-AT/альбумин [моль/моль] ССА [%] 0 V 1000 5,2 5,2 45 А1 150 5,2 5,2 45 А2 15 5,2 5,2 45 20 V 1000 1,05 <0,2 48 А1 150 0,9 <0,2 63 А2 15 0,4 <0,2 82 30 V 1000 0,96 <0,2 51 А1 150 0,9 <0,2 65 А2 15 0,3 <0,2 95 60 V 1000 0,69 <0,2 56 А1 150 0,4 <0,2 80 А2 15 0,2 <0,2 100 120 V 1000 0,36 <0,2 75 А1 150 0,2 <0,2 95 А2 15 0,1 <0,2 110 240 V 1000 0,23 <0,2 81 1440 V 1000 0,07 <0,2 96 2880 V 1000 0,05 <0,2 103

Результаты, полученные в экспериментах с активированным углем Norit ROX, подтверждают тот описанный выше факт, что в физиологических условиях, прежде всего при нейтральном значении pH, удаление существенной части стабилизаторов за 60 мин в использовавшихся до настоящего времени экспериментальных условиях, т.е. при использовании насыпных слоев или взвесей активированного угля с большой шириной образуемых между его частицами каналов, невозможно, по крайней мере не в той степени, которая приводит к значительному повышению связывающей способности альбумина.

Однако увеличение продолжительности контактирования раствора альбумина с активированным углем до указанных в настоящем описании значений неожиданно позволило даже при применении подобного активированного угля обеспечить удаление октаноата из раствора альбумина в степени, приводящей к повышению связывающей способности альбумина. Согласно рекомендациям по оценке минимально необходимой продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом в зависимости от ширины образованных между его частицами каналов при их средней ширине (Dm), равной 1000 мкм, продолжительность контактирования раствора альбумина с адсорбентом требуется увеличивать до значений, превышающих 250 мин. Приведенные выше результаты экспериментов свидетельствуют о том, что при продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом, равной 240 мин, ССА повышается до значений, лишь немного превышающих 80%, тогда как приемлемых значений, превышающих 90%, ССА достигает лишь по истечении одного дня (через 1440 мин).

При исследовании поверхностной структуры испытывавшихся активированных углей было установлено, что непосредственно с поверхностью активированного угля фактически могла контактировать лишь очень малая доля молекул альбумина, поскольку только макропоры вообще обеспечивают определенный доступ молекул альбумина внутрь частиц активированного угля, в то время как мезопоры в своем большинстве оказываются уже слишком малы для прохождения через них молекул альбумина. Однако в распределении пор по размерам на долю макропор приходится лишь очень малое количество от всего количества пор, и макропоры очень быстро и непосредственно под наружной поверхностью частиц активированного угля разветвляются на мезопоры, через которые молекулы альбумина проходить уже не могут. В тех местах, где макропоры все еще обеспечивают доступ молекул альбумина внутрь частиц активированного угля, молекулы альбумина помимо этого большей частью “застревают” в порах, что прежде всего при использовании макропористых активированных углей приводит к значительной потере альбумина.

Результаты, полученные в экспериментах с адсорбирующими материалами А1 и А2, свидетельствуют о том, что эту проблему можно решить за счет уменьшения средней ширины каналов, например, за счет использования в насыпном слое частиц с меньшим средним диаметром. Полученные результаты подтверждают тем самым, что определенное расположение частиц адсорбента друг относительно друга при определенных их размерах имеет важное значение для обеспечения высокой эффективности удаления стабилизаторов, которой невозможно автоматически добиться только за счет выбора типа адсорбента.

Поэтому при осуществлении предлагаемого в изобретении способа используют адсорбент, частицы которого образуют между собой каналы с размерами, согласованными с молекулой альбумина. Речь при этом идет о каналах, через которые молекула альбумина может проходить по всей их длине, т.е. насквозь, и которые имеют такие размеры, при которых молекулы альбумина очень часто и плотно контактируют с поверхностью адсорбента. Такие каналы характеризуются их средней шириной в свету, соответственно их средним диаметром.

Пример 2: Взвеси частиц активированного угля в реакторах с псевдоожиженным слоем

С целью продемонстрировать, что решающее значение для получения соответствующего изобретению результата имеет не увеличение наружной поверхности активированного угля путем его размола, а образование между частицами активированного угля каналов с оптимизированным средним диаметром, в следующем эксперименте исследовали адсорбенты с одинаковой наружной поверхностью, варьируя только ширину каналов, образуемых между частицами адсорбента. Для подобного эксперимента целесообразно использовать так называемый псевдоожиженный слой, в котором высокодисперсный адсорбент путем перемешивания, встряхивания или же создания конвективных, соответственно турбулентных потоков удерживается во взвешенном состоянии.

В псевдоожиженном слое каналами для прохождения потока раствора альбумина служат промежутки между равномерно распределенными во взвеси частицами адсорбента. Диаметр таких каналов в псевдоожиженном слое можно с достаточно хорошим приближением рассчитать по следующей формуле (II):

,

где D_K обозначает средний диаметр каналов между частицами, D_P обозначает средний диаметр самих частиц, n обозначает количество частиц, a V_WB обозначает объем псевдоожиженного слоя.

Объем псевдоожиженного слоя, который он должен иметь для образования каналов с требуемым средним диаметром, можно вычислить, решив уравнение формулы (II) относительно объема, по следующей формуле (IIа):

Для регулирования диаметра каналов и получения каналов требуемого диаметра необходимо тем самым согласовывать между собой объем псевдоожиженного слоя, количество частиц и их размер. Средний диаметр частиц D_P, а также насыпная плотность, необходимая для определения количества частиц из расчета на одну навеску, либо указываются производителем адсорбента, либо эти параметры можно определить простыми стандартными методами.

Количество частиц n в порции сухого сыпучего материала можно вычислять с приемлемым для практических целей приближением на основании насыпной плотности (в уплотненном состоянии) и размера частиц по следующей формуле (III):

,

где n обозначает количество частиц в объеме сухого сыпучего материала, V_TS обозначает объем уплотненного сухого сыпучего материала, a D_P обозначает средний диаметр частиц. Если для определенного адсорбента известна насыпная плотность в сухом состоянии, то объем V_TS можно также вычислить, разделив величину навески на насыпную плотность в сухом состоянии.

Поскольку на практике частицы адсорбента не всегда имеют идеальную сферическую форму и часто также не всегда имеют постоянные размеры, при наличии массы частиц с широким распределением по размерам на практике следует исходить из того, что распределение промежутков между частицами, находящимися во взвешенном состоянии в псевдоожиженном слое адсорбента, зависит от распределения частиц адсорбента по размерам. Обычно для адсорбентов и особенно для порошковых адсорбентов (например, для активированного угля Norit С Extra USP) принято указывать показатели гранулометрического состава, т.е. процентили распределения частиц по размерам, например показатели D10 и D90. Величины D10 и D90 позволяют описать интервал распределения частиц по размерам, в пределы которого попадают примерно 80% всех частиц. Таким путем удобно ограничивать величину объема, по которому в водном псевдоожиженном слое для образования каналов требуемого диаметра с достаточно хорошим приближением необходимо распределить определенную навеску, соответственно объем сухого сыпучего материала.

В этом случае в расчетах объема псевдоожиженного слоя необходимо использовать величину D10 вместо величины D_P, а затем величину D90 вместо величины D_P для определения таким путем верхнего и нижнего предельных значений объема псевдоожиженного слоя, в интервале между которыми соответствующее изобретению расстояние между частицами адсорбента (ширина каналов) является согласно изобретению оптимальным. Расчеты на основании величины D90 приведут к экстремальному варианту, в котором при сохранении предлагаемых в изобретении параметров возможна надежная делигандизация с эффективным повышением связывающей способности альбумина (ССА).

Влияние ширины каналов на делигандизацию альбумина и повышение его связывающей способности подтверждали следующим путем. Смесь из активированного угля и альбумина, взятых по 1 г каждого (активированный уголь Norit-C Extra USP фирмы NORIT Nederland BV, Нидерланды; имеющийся в продаже альбумин, стабилизированный октаноатом и N-ацетилтриптофанатом в количестве по 5,2 ммоля на ммоль альбумина), в различных объемах псевдоожижали в растворе NaCl и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. По завершении такой обработки частицы активированного угля отделяли от раствора альбумина путем центрифугирования. После этого определяли концентрацию альбумина, октаноата и N-ацетилтриптофаната, а также ССА и полученные значения соотносили с рассчитанной шириной каналов. Полученные результаты приведены в ниже в таблице 2.

Таблица 2 Опыт Навеска [г] n50 n10 n90 Объем псевдоожи-
женного
слоя [мл] D_K50 [мкм] D_K10 [мкм] D_K90 [мкм] Окт./альб. N-AT/альб. ССА [%] 1 0,5 3×10⁸ 2,94×10¹⁰ 6,7×10⁶ 3,25 5,2 1,2 17,2 <0,2 <0,2 110 2 0,5 1,5×10⁸ 1,48×10¹⁰ 3,36×10⁶ 7,5 12,3 2,8 42,4 0,20 <0,2 83,2 3 0,5 1,5×10⁸ 1,48×10¹⁰ 3,36×10⁶ 10 15,9 3,6 54,8 0,22 <0,2 79,9 4 0,5 1,5×10⁸ 1,48×10¹⁰ 3,36×10⁶ 12,5 18,8 4,2 65,3 0,27 <0,2 70,3 5 0,5 1,5×10⁸ 1,48×10¹⁰ 3,36×10⁶ 22,5 27,8 6,2 96,8 0,43 <0,2 67,5 6 0,5 1,5×10⁸ 1,48×10¹⁰ 3,36×10⁶ 32,5 34,3 7,6 119,8 0,58 <0,2 63,3

В приведенной выше таблице величины n50, n10, n90 означают количества частиц, рассчитанные по формуле (III) с использованием процентилей D50, D10, соответственно D90 в качестве значений среднего диаметра частиц, величины D_K50, D_K10, D_K90 означают средний диаметр каналов, рассчитанный по формуле (II) с использованием процентилей D50, D10, соответственно D90 в качестве значений среднего диаметра частиц, отношение “Окт./альб.” означает молярное соотношение между октаноатом и альбумином, а отношение “N-AT/альб.” означает молярное соотношение между N-ацетилтриптофанатом и альбумином.

Из приведенных в таблице результатов со всей очевидностью следует, что с увеличением среднего диаметра каналов (D_k50) в псевдоожиженном слое, который (диаметр) согласно приведенной выше формуле (II) при постоянном типе и количестве частиц прямо пропорционален объему псевдоожиженного слоя, эффективность удаления октаноата и N-ацетилтриптофана и результирующая связывающая способность альбумина вне зависимости от площади наружной поверхности адсорбента снижаются.

Из приведенных в таблице данных следует также, что с учетом условия, согласно которому продолжительность контактирования раствора альбумина с адсорбентом в предпочтительном варианте осуществления изобретения должна лежать в следующих пределах:

dm [мкм]/4 [мкм/мин]≤продолжительность контактирования [мин]≤dm [мкм]/0,3 [мкм/мин], оптимальное удаление стабилизаторов за 30 мин возможно в том случае, когда ширину каналов выбирают с таким расчетом, чтобы верхнее предельное значение минимально необходимой продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом составляло менее 30 мин (опыт 1). В этом случае верхнее предельное значение минимально необходимой продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом в пересчете на средний диаметр каналов, равный 5,2 мкм, составило бы 17,3 мин, в связи с чем степень удаления N-AT и октаноата достигала максимальной, а ССА достигала значения, равного 110%. В опытах 2-6 это верхнее предельное значение минимально необходимой продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом не превышалось. Поэтому в этих опытах хотя и наблюдались исключительно высокая степень удаления стабилизаторов и значительное повышение ССА, тем не менее эти параметры не достигали оптимальных значений, полученных в опыте 1.

Описанные выше примеры 1 и 2 подтверждают, что необходимая для эффективного удаления стабилизаторов продолжительность контактирования раствора альбумина с адсорбентом существенно зависит от среднего диаметра каналов в адсорбенте. Путем соответствующего согласования среднего диаметра каналов в адсорбенте можно, таким образом, влиять также на необходимую продолжительность контактирования раствора альбумина с адсорбентом, а тем самым и, например, при пропускании раствора альбумина через набитую адсорбентом колонку на скорость прохождения через нее раствора альбумина.

Пример 3: Фиксация адсорбентов на тканях, в открытопористых пеноматериалах или в смесях с сыпучими материалами

В описанном ниже примере предлагаемые в изобретении расстояния между частицами адсорбента, т.е. образование каналов необходимой ширины, обеспечивали путем “фиксации” частиц адсорбента в проницаемой для раствора альбумина сетчатой структуре.

Частицы адсорбента, например активированного угля, можно при этом фиксировать на выполняющих функцию их носителя тканях (например, тканях из полимерных волокон), в открытопористых пенополимерах (например, открытопористых пенополиуретанах) или же можно также просто помещать в смеси с высокопористыми частицами в качестве “распорок” в своего рода реакторы с неподвижным слоем, обеспечивающие расположение частиц адсорбента достаточно близко друг к другу и тем самым наличие между ними каналов приемлемой согласно изобретению ширины. При фиксации частиц адсорбента в высокопористых, открытопористых пенополимерах в них можно также одновременно или в последующем выполнять каналы, например, сверлением. Ширина таких каналов также соответствует условиям, которыми согласно изобретению определяется взаимосвязь между шириной каналов и минимально необходимой продолжительностью контактирования раствора альбумина с адсорбентом.

В этих вариантах предпочтительна достигаемая с использованием ткани, соответственно полимера-носителя “рыхлая” упаковка или укладка частиц адсорбента, создающая малое гидравлическое сопротивление сравнительно высоковязким растворам альбумина. Помимо этого таким путем можно существенно снизить при фильтрации затраты на задерживание микрочастиц по сравнению с описанными выше примерами.

При фиксации адсорбентов на тканях, в открытопористых пеноматериалах или в смесях с сыпучими материалами средний диаметр каналов также можно с достаточно хорошим приближением рассчитать по следующей формуле (IV):

,

где D_K обозначает средний диаметр каналов, образованных между частицами адсорбента, D_P обозначает средний диаметр самих частиц, n обозначает количество частиц, а V обозначает объем ткани, смеси частиц адсорбента с сыпучим материалом или пеноматериала в конечном состоянии. Каналы требуемого диаметра можно получить, вычислив необходимый для этого объем ткани, смеси частиц адсорбента с сыпучим материалом или пеноматериала при известном количестве частиц адсорбента и при известном их диаметре по следующей формуле, полученной путем соответствующей перестановки переменных в формуле IV:

.

Основы расчета для целесообразного сочетания из навески адсорбента и конечным объемом соответствуют при этом всем основам расчета, рассмотренным в примере 2.

В одном из экспериментов 2 г активированного угля (Norit-C Extra USP фирмы NORIT Nederland BV, Нидерланды) со средним размером его частиц, равным 23 мкм (значение D50) (D10=5 мкм, D90=82 мкм), перемешивали в водной суспензии/водном растворе волокнообразующего полимера (в данном случае целлюлозы) и полимера со склонностью к сшиванию (например, смол, полиуретанов, полиакрилметакрилатов или иных полимеров), задавая при этом ширину каналов равной 3,6 мкм для обеспечения надежной делигандизации при продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом, равной 12 мин. С учетом соответствующего изобретению условия, согласно которому продолжительность контактирования раствора альбумина с адсорбентом должна лежать в следующих пределах:

dm [мкм]/4 [мкм/мин]≤продолжительность контактирования [мин]≤dm [мкм]/0,3 [мкм/мин], верхнее предельное значение минимально необходимой продолжительности контактирования раствора альбумина с адсорбентом составляет, таким образом, 12 мин. В соответствии с приведенной выше формулой (IVa) для навески активированного угля, равной 2 г, вычисляли требуемый объем ткани, смеси частиц адсорбента с сыпучим материалом или пеноматериала, составивший 12,5 мл, что соответствовало последующему общему объему смеси. Смесь подавали на мелкоячеистую сетку с площадью примерно 25 см² и с порами достаточно малых для прохождения через них частиц адсорбента и сшитых полимеров-носителей размеров (например, с размером пор 5 мкм). Смесь распределяли по сетке таким образом, что после удаления воды путем создания градиента давления (1 атм) получали слой сухого адсорбирующего материала толщиной 5 мм. Тем самым окончательный объем приготовленного таким путем адсорбента составлял в общей сложности 12,5 мл. Средний диаметр каналов D_K, рассчитанный в соответствии с приведенной выше формулой (IV) исходя из размера частиц D50=23 мкм, составил 3,6 мкм.

Через эту сетку с адсорбентом, закрепленную в имеющемся в продаже приспособлении для крепления фильтров, перпендикулярно ее поверхности в том же направлении, в котором при сушке создавали градиент давления, пропускали 10 мл 20%-ного, имеющегося в продаже стабилизированного раствора альбумина с расходом 1 мл/мин. Связывающая способность альбумина в его обработанном таким путем растворе после этой процедуры повысилась в результате удаления стабилизаторов в течение 10 мин с 45% до более 100%. Соотношение между количествами октаноата и N-ацетилтриптофаната и количеством альбумина составляло менее чем по 0,2 ммоля/ммоль.

Пример 4: Клиническое применение

Влияние полученных предлагаемым в изобретении способом растворов альбумина с повышенной связывающей способностью альбумина проверяли в клинических исследованиях. Для участия в проспективном рандомизированном исследовании отбирали 30 пациентов с печеночной недостаточностью при хроническом алкогольном циррозе и сопровождающем гепатите С2 с уровнем билирубина более 20 мг/дл и ограниченным синтезом белков (повышенное международное нормализованное отношение (MHO, англ. INR - International Normalized Ratio)) и с гипотоническими и гипердинамическими нарушениями кровообращения, которых распределяли по двум группам. Пациентам одной группы вводили, а пациентам другой - контрольной - группы не вводили полученный предлагаемым в изобретении способом раствор альбумина с повышенной связывающей способностью альбумина. На протяжении всего времени исследования и наблюдения, длившегося 2 недели, у всех пациентов регулярно проверяли параметры кровообращения и функцию конечных органов - почек и головного мозга.

Полученные результаты в графическом виде представлены на прилагаемых к описанию диаграммах.

На фиг.1 показана диаграмма, отражающая концентрацию альбумина в крови пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

На фиг.2 показана диаграмма, отражающая связывающую способность альбумина в крови пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

На фиг.3 показана диаграмма, отражающая изменение среднего артериального давления наполнения у пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

На фиг.4, 5, 6 показаны диаграммы, отражающие систолическое кровяное давление, диастолическое кровяное давление и частоту сердечных сокращений у пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

На фиг.7 показана диаграмма, отражающая действие на функцию почек, измеренное путем определения содержания креатинина, у пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

На фиг.8 показана диаграмма, отражающая действие на печеночную энцефалопатию, обусловленную проходящими через гематоэнцефалический барьер, обладающими сродством к альбумину токсинами и изменениями кровообращения, у пациентов обеих исследуемых групп перед терапией и по истечении двух недель.

Результаты клинических исследований свидетельствуют о том, что с повышением связывающей способности альбумина (ССА) улучшается также среднее артериальное давление, что, по-видимому, обусловлено скорее повышением диастолического кровяного давления, а не увеличением частоты сердечных сокращений. С медицинской точки зрения этот факт указывает на сниженную вазодилатацию, которая при заболеваниях печени часто обусловлена действием сосудорасширяющих веществ, обладающих сродством к альбумину. Благодаря их иммобилизации альбумином с повышенной связывающей способностью улучшается также функция системы кровообращения, почек и головного мозга. Подобный эффект помимо улучшения ситуации с кровяным давлением может быть также обусловлен более эффективным связыванием обладающих непосредственно нейротоксическим действием веществ, которые точно так же связываются с альбумином с повышенной ССА.

Изобретение относится к медицине. Исходный раствор альбумина при значении рН от 5 до 9 вводят в контакт с твердым адсорбентом, сродство которого к, по меньшей мере, части используемых молекул стабилизаторов выше, чем сродство альбумина к соответствующим молекулам стабилизаторов, и отделяют от адсорбента. Осуществляют применение водного раствора альбумина для приготовления средства, предназначенного для лечения гипоальбуминемии, в качестве кровезаменителя, соответственно плазмозаменителя, для экстракорпорального очищения крови путем афереза или альбуминового диализа, для улучшения функции системы кровообращения, почек и/или головного мозга пациента. Изобретение позволяет получить раствор альбумина с уменьшенным содержанием стабилизатора и с повышенной связывающей способностью. 7 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 ил.

1. Способ получения водного раствора альбумина из его исходного раствора, содержащего молекулы стабилизаторов, которые способны занимать связывающие участки альбумина, путем снижения содержания молекул стабилизатора в указанном исходном растворе альбумина для повышения способности альбумина связывать другие молекулы, и отделения альбумина, заключающийся в том, что
а) исходный раствор альбумина при значении рН от 5 до 9 вводят в контакт с твердым адсорбентом, сродство которого к, по меньшей мере, части используемых молекул стабилизаторов выше, чем сродство альбумина к соответствующим молекулам стабилизаторов, и
б) раствор альбумина отделяют от адсорбента.

2. Способ по п.1, заключающийся в том, что его проводят при значении рН в пределах от 6 до 8, предпочтительно от 6,9 до 7,5.

3. Способ по п.1 или 2, заключающийся в том, что альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).

4. Способ по п.1, заключающийся в том, что удаляемые молекулы стабилизаторов представляют собой молекулы N-ацетилтриптофана и/или октановой кислоты либо ее анионов.

5. Способ по п.1, заключающийся в том, что исходный раствор альбумина вводят в контакт с адсорбентом на стадии а), пропуская исходный раствор альбумина через (хроматографическую) колонку с адсорбентом или через образованный адсорбентом слой.

6. Способ по п.1, заключающийся в том, что раствор альбумина отделяют от адсорбента на стадии б) путем фильтрации раствора альбумина через фильтр для улавливания частиц, который пропускает молекулы альбумина и задерживает твердые частицы адсорбента.

7. Способ по п.1, заключающийся в том, что стадии а) и б) повторяют многократно, предпочтительно от 2 до 6 раз, каждый раз возвращая при этом полученный на стадии б) обработанный раствор альбумина на стадию а) и используя при каждом выполнении стадии а) регенерированный путем удаления молекул стабилизаторов и/или свежий адсорбент.

8. Способ по п.1, заключающийся в том, что соотношение между количеством используемого адсорбента и концентрацией альбумина в его исходном растворе и/или продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) задают с таким расчетом, чтобы связывающая способность альбумина (ССА) в полученном растворе альбумина, измеренная по методу Klammt и др., составляла по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, особенно предпочтительно, по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%.

9. Способ по п.1, заключающийся в том, что соотношение между количеством используемого адсорбента и концентрацией альбумина в его исходном растворе и/или продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) задают с таким расчетом, чтобы концентрация связанных и концентрация несвязанных молекул стабилизаторов, прежде всего N-ацетилтриптофана и/или октановой кислоты либо ее анионов, в исходном растворе альбумина снижалась до уровня менее 70%, предпочтительно менее 50%, особенно предпочтительно менее 30%, наиболее предпочтительно менее 10%, от их исходных концентраций.

10. Способ по п.1, заключающийся в том, что в качестве адсорбента используют сыпучий или зернистый (дисперсный) материал, который набит в колонку или насыпан в виде слоя либо который внедрен в матрицу-носитель с образованием в результате между частицами адсорбента проточных для жидкости каналов, средний диаметр которых в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента, составляет от более 100 нм до менее 1000 мкм, предпочтительно менее 500 мкм, особенно предпочтительно менее 300 мкм, наиболее предпочтительно менее 200 мкм, прежде всего менее 100 мкм.

11. Способ по п.10, заключающийся в том, что средний диаметр каналов в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента, составляет от более 100 нм до менее 60 мкм, наиболее предпочтительно менее 10 мкм.

12. Способ по п.1, заключающийся в том, что минимальную продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) выбирают в следующих пределах:
dm [мкм]/10 [мкм/мин]≤продолжительность контактирования [мин]≤dm [мкм]/0,1 [мкм/мин],
где dm означает средний диаметр каналов в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента.

13. Способ по п.1, заключающийся в том, что минимальную продолжительность контактирования исходного раствора альбумина с адсорбентом на стадии а) выбирают в следующих пределах:
dm [мкм]/4 [мкм/мин]<продолжительность контактирования [мин]<dm [мкм]/0,3 [мкм/мин], где dm означает средний диаметр каналов в пересчете на всю длину каналов, образованных между частицами всего используемого адсорбента.

14. Способ по п.1, заключающийся в том, что в качестве адсорбента используют активированный уголь.

15. Способ по п.14, заключающийся в том, что используют активированный уголь с мелассовым числом (согласно номенклатуре IUPAC) в пределах от 100 до 400, предпочтительно от 200 до 300.

16. Способ по п.14, заключающийся в том, что используют активированный уголь с показателем адсорбции метиленового голубого (согласно номенклатуре IUPAC) в пределах от 1 до 100 г/100 г активированного угля, предпочтительно от 10 до 30 г/100 г активированного угля.

17. Способ по п.14, заключающийся в том, что используют активированный уголь с йодным числом (согласно номенклатуре IUPAC) в пределах от 500 до 3000, предпочтительно от 800 до 1500.

18. Способ по п.14, заключающийся в том, что используют активированный уголь с общей внутренней поверхностью, определяемой методом Брунауэра-Эммета-Теллера (согласно номенклатуре IUPAC) в пределах от 100 до 5000 м²/г активированного угля, предпочтительно от 800 до 1400 м²/г активированного угля.

19. Твердый адсорбент для получения водного раствора альбумина при осуществления способа по одному из пп.1-18.

20. Применение адсорбента по п.19 для осуществления способа по одному из пп.1-18.

21. Применение водного раствора альбумина, полученного способом по одному из пп.1-18, для приготовления средства, предназначенного для лечения гипоальбуминемии.

22. Применение водного раствора альбумина, полученного способом по одному из пп.1-18, для приготовления средства, предназначенного для применения в качестве кровезаменителя, соответственно плазмозаменителя, или раствора для экстракорпорального очищения крови путем афереза или альбуминового диализа.

23. Применение водного раствора альбумина, полученного способом по одному из пп.1-18, для приготовления средства, предназначенного для улучшения функции системы кровообращения, почек и/или головного мозга пациента.

24. Водный раствор альбумина, полученный способом по одному из пп.1-18.