СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКА РЕКОМБИНАНТНОЙ СТАФИЛОКИНАЗЫ Российский патент 2011 года по МПК C07K1/18 C07K1/22 C07K14/00 C12N9/70 

Изобретение относится к области хроматографической очистки белков и может быть использовано в фармацевтической промышленности для создания рекомбинантных форм стафилокиназы.

Стафилокиназа (Sak) - белок, секретируемый некоторыми штаммами Staphylococcus aureus. Клинический интерес к данному бактериальному белку вызван его способностью превращать плазминоген, неактивный профермент системы фибринолиза, в плазмин. В настоящее время стафилокиназа находится в процессе клинических испытаний, направленных на изучение механизма лизиса кровяного сгустка в лечении тромбо-васкулярных заболеваний. В частности, препарат стафилокиназы используют для комплексного лечения пациентов с острым инфарктом миокарда, периферической артериальной окклюзией и другими патологиями, сопровождающимися нарушением реологических и свертывающих свойств крови. Ряд клинических экспериментов убедительно продемонстрировал, что стафилокиназа обладает более высоким, чем у широко применяемых сегодня фибринолитических факторов (например, урокиназы, активатора плазминогена /t-РА/ или стрептокиназы), сродством к фибрину. Кроме того, в условиях пастеризации стафилокиназа более термостабильна, чем вышеуказанные аналоги, поэтому ее использование в качестве фармацевтического препарата более чем оправдано.

В связи с вышеописанными свойствами стафилокиназы многими исследователями разработаны штаммы-продуценты для наработки рекомбинантного аналога данного белка.

Одной из проблем при получении фармацевтических препаратов является получение чистой субстанции. Наиболее перспективными методами для решения этой задачи являются хроматографические методы выделения и очистки.

Известен штамм Е.coli SA 9325 - продуцент рекомбинантного белка, содержащего полную последовательность стафилокиназы из S.aureus, и лидерный пептид с блоком из 6 гистидиновых остатков (RU 2156299, 2000). Известное решение позволяет получить высокоактивный белок, обладающий фибринолитической активностью с выходом рекомбинантного белка, составляющим 20-26% от общего количества белков. Однако чистота продукта является недостаточной, а возможные методы очистки рекомбинантного белка в патенте не указаны.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ очистки рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы, который предусматривает суспендирование клеток, продуцирующих рекомбинантную стафилокиназу, в фосфатном буферном растворе, гомогенизацию, центрифугирование и хроматографию полученного супернатанта последовательно на колонках Sephadex G-10 и S-Sepharose FF, причем рекомбинантное производное стафилокиназы характеризуется тем, что один или более аминокислотных остатков между аминокислотными остатками 104 и 113 стафилокиназы дикого типа замещены другими аминокислотами с образованием последовательности RGD или последовательности KGD (RU 2283863, 2006).

Чистота продукта, полученного известным способом, составляет более 95%, однако использование известного способа для очистки белка, имеющего лидерный пептид из 6 гистидиновых остатков не приводит к получению продукта с приемлемой чистотой и выходом.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа очистки белка рекомбинантной стафилокиназы, обеспечивающего высокую чистоту целевого продукта.

Поставленная задача решается описываемым способом очистки белка рекомбинантной стафилокиназы, включающим суспендирование клеток, продуцирующих рекомбинантный белок, в фосфатном буферном растворе, гомогенизацию, центрифугирование и хроматографию полученного супернатанта, причем используют клетки штамма E-coli MZ08 - продуцента рекомбинантной стафилокиназы, характеризующейся аминокислотной SEQ ID NO:1, а хроматографию осуществляют в два этапа, на первом этапе проводят ионообменную хроматографию на колонке, заполненной DE-целлюлозой с получением фракции, обогащенной стафилокиназой, полученную фракцию разбавляют раствором хлорида натрия и осуществляют второй этап с помощью металлхелатирующей аффинной хроматографии.

Ниже приведен конкретный пример осуществления очистки наработанных клеток белка рекомбинантной стафилокиназы.

Пример

Клетки (50-70 г) суспендировали в 150 мл буфера 20 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 150 мМ NaCl, 100 мкМ FMSF. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе «MSE» (Англия) при максимальном режиме в течение 12 мин (40-60 сек - импульс, 5-7 мин - охлаждение) при 4°С. Клеточные обломки осаждали центрифугированием в течение 1 ч при 20000 об/мин в роторе Ja-20 центрифуги J2-21 фирмы «Весkman» (США) при 4°С. Полученный супернатант наносили со скоростью 100 мл/ч на колонку с сорбентом DE52, предварительно уравновешенную буфером. Объем сорбента 600 мл. Стафилокиназа выходила в 200 мл проскока. Раствор доводили до 300 мМ NaCl и наносили на колонку с сорбентом NI-NTA (25 мл) фирмы «Qiagene» (США). После промывания колонки 10 объемами буфера связавшиеся белки элюировали линейным градиентом концентрации имидазола (0-500 мМ) того же буфера со скоростью 40 мл/ч. Общий объем градиента 400 мл. Фракции, содержащие стафилокиназу, определяли методом электрофоретического контроля. Концентрацию белка определяли на спектрофотометре Beckman DU700. Выход очищенного белка при чистоте 98% составил 40-50 мг на 1 л культуральной жидкости.

Таким образом, целевой продукт получен из штамма-продуцента гибридного белка E-coli MZ08, обладающего стафилокиназной активностью.

Белок может быть легко выделен с использованием металлхелатирующей аффинной хроматографии. Кодирующая последовательность стафилокиназы характеризуется SEQ ID NO:1.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки белка рекомбинантной стафилокиназы. Предложенное изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности. Способ включает суспендирование клеток штамма Е.coli MZ08 - продуцента рекомбинантной стафилокиназы, характеризующейся аминокислотной SEQ ID NO:1, в фосфатном буферном растворе. Проводят гомогенизацию и центрифугирование полученного супернатанта, затем хроматографию в два этапа, на первом этапе осуществляют ионообменную хроматографию на колонке, заполненной DE-целлюлозой с получением фракции, обогащенной стафилокиназой. Затем полученную фракцию разбавляют раствором хлорида натрия и осуществляют второй этап с помощью металлхелатирующей аффинной хроматографии. Предложенное изобретение позволяет осуществлять очистку белка рекомбинантной стафилокиназы с высокой чистотой.

Способ очистки белка рекомбинантной стафилокиназы, включающий суспендирование клеток, продуцирующих рекомбинантный белок, в фосфатном буферном растворе, гомогенизацию, центрифугирование и хроматографию полученного супернатанта, отличающийся тем, что используют клетки штамма Е. coli MZ08 - продуцента рекомбинантной стафилокиназы, характеризующейся аминокислотной SEQ ID NO:1, а хроматографию осуществляют в два этапа, на первом этапе проводят ионообменную хроматографию на колонке, заполненной DE-целлюлозой с получением фракции, обогащенной стафилокиназой, полученную фракцию разбавляют раствором хлорида натрия и осуществляют второй этап с помощью металлхелатирующей аффинной хроматографии.