СПОСОБ СОЗДАНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО СО СТАБИЛЬНЫМ И ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСГЕННОГО БЕЛКА Российский патент 2011 года по МПК C12N15/06 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к методам производства в биореакторах, основанных на культурах клеток и животных высших эукариот, лекарственных препаратов и биологических добавок нового поколения, таких как антитела и сложные белковые молекулы.

В биотехнологической промышленности все больше лекарственных препаратов и биологических добавок производятся в биореакторах, основанных на культурах клеток высших эукариот. Биореакторами для производства белков могут быть любые живые организмы - бактерии, грибы, растения, животные и клеточные культуры. В современном производстве наиболее широко используются бактерии и дрожжи, которые можно эффективно и экономично размножать в промышленных биотехнологических установках. Однако для нормального функционирования многих белков человека очень важны те изменения, которые происходят на посттрансляционном уровне: гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, карбоксилирование и некоторые другие преобразования. В настоящее время многие антитела к белкам, нарушающим правильное развитие клеток, используются для лечения болезней, связанных с такими нарушениями. Большая часть антител производится в культурах клеток. Поэтому для производства многих белков используют культуры клеток млекопитающих, в которых происходят правильные модификации белков. Однако невысокий уровень продуктивности, сложности в организации промышленного производства и высокая цена производства ограничивают распространение этого метода.

В течение последних 10 лет в качестве биореактора часто используют трансгенных животных, у которых чужой ген экспрессируется в клетках эпителия молочной железы, а его продукт секретируется в молоко. Этот ген может экспрессироваться только в молочной железе и только во время лактации, не оказывая побочных воздействий на организм трансгенного животного. Кроме этого, в молочной железе трансгенных животных выполняется большинство посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков и происходит правильная укладка белков, необходимая для проявления их биологической активности. В настоящее время дано разрешение на производство первых двух продуктов, синтезируемых в молочной железе: человеческий антитромбин III, полученный из трансгенных коз (фирма GTC Biotherapeutics), и рекомбинантный С1 ингибитор (Pharming Group NV), продуцируемый трансгенными кроликами.

Существует несколько основных схем получения стабильных трансгенных культур клеток и трансгенных животных. Для трансформации клеток (при получении клеточных культур) или для микроинъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку (при получении трансгенных животных) используют линейную ДНК, содержащую генную конструкцию. Этот метод позволяет встраивать в геном большие фрагменты ДНК, по размерам превышающие 20 т.п.н., что имеет большое значение, так как для эффективной экспрессии многих генов помимо кодирующих участков необходимо присутствие интронов и протяженных 5'- и 3'- нетранслируемых областей. Однако данный метод имеет ряд недостатков. При получении трансгенов с помощью линейной ДНК обычно наблюдаются многокопийные тандемные интеграции конструкций в геном, что приводит к формированию районов, содержащих множественные повторы конструкции. Известно, что повторяющиеся последовательности ДНК часто формируют неактивный хроматин, негативное действие которого усиливается в ряду поколений. В результате, через несколько генераций после получения исходного трансгенного животного или линии клеток, может происходить затухание экспрессии трансгенов. Одновременно формирование на повторах трансгенов зоны гетерохроматина может негативно влиять на активность хозяйских генов, расположенных рядом, что с высокой степенью вероятности будет приводить к снижению выживаемости продуцента. Снижение выживаемости является особенно значимым негативным фактором в случае использования в качестве биореактора крупных трансгенных животных, стоимость получения которых крайне высока (от 20000 $ до 300000 $) и занимает несколько лет.

В последние годы появилась новая схема получения трансгенных животных и клеточных культур с помощью ретровирусов, в первую очередь лентивирусов. Одним из преимуществ ретровирусных векторов является значительное увеличение эффективности получения трансгенных клеточных линий и животных. При использовании ретровирусных векторов наблюдаются единичные или низкокопийные интеграции в транскрибируемые или содержащие активный хроматин области генома. В результате это позитивно сказывается на уровне транскрипции трансгена. Однако, с другой стороны, низкая копийность трансгена не позволяет получать значительный уровень экспрессии. Кроме того, даже при наличии только двух-трех копий трансгена часто наблюдается эффект ко-репрессии, что приводит к постепенному метилированию ДНК и модификациям гистонов, характерных для неактивного хроматина и, как следствие, репрессии трансгена (Yao et al., 2004 [4]). Нужно отметить, что емкость ретровирусных векторов составляет всего 7-9 т.п.н., что определяется размером вирусной частицы, в которую пакуется инфекционная ДНК. Таким образом, вирусный вектор позволяет использовать преимущественно только кДНК генов, которые экспрессируются намного менее эффективно, чем гены, содержащие интроны. Кроме этого, накладываются большие ограничения на размеры регуляторных элементов, которые можно использовать для увеличения уровня экспрессии трансгена.

Исследования по усовершенствованию трансгенных векторов ведутся во многих лабораториях и фирмах мира, прежде всего в Западной Европе и США. В последнее время работы по созданию новых векторов стали активно проводиться в Китае и Индии. В Российской Федерации пока не существует развитой биотехнологической промышленности и поэтому разработки таких векторов почти не проводятся. Исключением могут являться работы по заказу от иностранных биотехнологических компаний. Несомненным является тот факт, что усовершенствование векторов может на порядки сократить затраты на создание эффективного продуцента и промышленного производства самого продукта.

Основная проблема на пути достижения эффективной экспрессии белков в культуре клеток и молочных железах млекопитающих - это неустойчивая, низкая экспрессия трансгена при его интеграции в геном реципиента. Такая репрессия является следствием негативного влияния окружающего хроматина и регуляторных элементов, что в целом можно считать следствием защитной реакции генома на интеграцию чужеродной информации, экспрессию которой надо подавить. Таким образом, крайне актуальной задачей является использование в экспрессионных векторах регуляторных элементов, способных поддерживать эффективную работу гена, кодирующего целевой белок.

С целью увеличения эффективности трансформации и повышения стабильности экспрессии трансгена с начала 90-х годов широко используются последовательности ДНК, обычно А/Т-богатые, которые, как было показано в экспериментах in vitro, взаимодействуют с фракцией ядерного матрикса (MAR, matrix attachment region). Существующая модель предполагает, что MAR, взаимодействуя с белками ядерного скелета, снижает зависимость экспрессии генов, фланкированных MAR, от негативного эффекта окружающего хроматина.

Также для защиты транскрипции трансгена от репрессии и негативного эффекта окружающего генома применяются известные инсуляторы (Recillas-Targa et al., 2004 [3]; Kwaks and Otte, 2006 [2]). Так, в компании Invitrogen был применен куриный HS4 инсулятор (1.2 т.п.н.), найденный на границе β-глобинового домена. Обычно перед геном ставят две копии HS4 инсулятора. В некоторых случаях используют комбинации известных MAR и HS4 инсулятора либо мультимеризации его коровой последовательности (500 п.н.) (Recillas-Targa et al., 2004). Такие элементы увеличивали как эффективность получения трансгенов, так и уровень экспрессии самого трансгена. Однако далеко не во всех исследованных культурах клеток и организмах HS4 инсулятор эффективно работает.

В компании Millipore-Bioprocess были разработаны регуляторные элементы из промоторов генов «домашнего хозяйства», которые должны эффективно работать на всех стадиях развития и во всех клетках организма. Было показано, что такие элементы улучшают эффективность получения трансгенных культур клеток и делают более стабильным уровень экспрессии трансгенов. Однако размер таких элементов достаточно большой и может достигать 2.5 т.п.н., что снижает эффективность их использования. Кроме того, пока не известно, насколько эффективно действуют эти элементы в различных клеточных культурах и организмах.

Наконец, с помощью оригинальной тест-системы были обнаружены элементы размером от 500 п.н. до 2000 п.н., названные STAR, которые обладали способностью блокировать распространение гетерохроматина (Kwaks et al., 2003 [1]). Однако информация о дальнейшем исследовании найденных элементов для защиты трансгенов отсутствует.

Известны методы получения трансгенов: для трансформации клеток при получении клеточных культур используют линейную ДНК, содержащую генную конструкцию. Этот метод позволяет встраивать в геном большие фрагменты ДНК, по размерам превышающие 20 т.п.н. Однако при получении трансгенов с помощью линейной ДНК происходят многокопийные тандемные интеграции конструкций в геном, что приводит к формированию районов, содержащих множественные повторы конструкции. Такие повторяющиеся последовательности ДНК часто формируют неактивный хроматин, негативное действие которого усиливается в ряду поколений. В результате, через несколько генераций после получения трансгенной линии клеток, может происходить затухание экспрессии трансгенов. Одновременно формирование зоны гетерохроматина может негативно влиять на активность генов, расположенных рядом, что с высокой степенью вероятности будет приводить к снижению выживаемости продуцента. Существует схема получения трансгенных клеточных культур с помощью лентивирусных векторов (RU 2305708, опубл. 10.09.2007). Одним из преимуществ таких векторов является значительное увеличение эффективности получения трансгенных клеточных линий и животных. Однако при их использовании происходят единичные интеграции в транскрибируемые или содержащие активный хроматин области генома. Кроме этого в промоторной области самого вектора обычно встраивают активирующие регуляторные последовательности, которые повышают уровень экспрессии трансгена. В результате это позитивно сказывается на уровне наработки гетерологичного белка. Однако, с одной стороны, низкая копийность трансгена не позволяет получать значительный выход продукта. С другой стороны, даже при начальном высоком уровне экспрессии трансгена впоследствии наблюдается эффект ко-репрессии, вызванной транскрипцией из активных областей генома через трансгенную конструкцию, встроенную в геном, что приводит к постепенной репрессии трансгена. Таким образом, основная проблема на пути достижения эффективной экспрессии белков в культуре клеток - неустойчивая, низкая экспрессия трансгена при его интеграции в геном реципиента - остается нерешенной,

Крайне актуальной задачей является использование в экспрессирующих векторах регуляторных элементов, способных поддерживать эффективную работу гена, кодирующего целевой белок. К настоящему моменту не известен универсальный регуляторный элемент, который бы эффективно работал в разнообразных клеточных культурах, с разными типами промоторов и т.д. Описанные зарубежные аналоги созданы из инсуляторных регуляторных элементов (US 5610053, опубл. 11.03.1997) либо из активаторных элементов, способствующих открытию хроматина в точке интеграции трансгена (US 6949361, опубл. 27.09.2005). Однако способность некоторых инсуляторов взаимодействовать с ядерным матриксом не нужна для создания транскрипционно независимых доменов и для формирования барьера между активным и неактивным хроматином. В то же время часто репрессионные эффекты при встройке трансгена связаны с транскрипцией, проходящей через трансген. Инсуляторы и активаторные регуляторные элементы не способны останавливать такую транскрипцию. Таким образом, использование терминаторов транскрипции в экспрессионных векторах должно помочь в защите трансгена от негативных транскрипционных эффектов генома.

Экспрессирующие конструкции, включающие в себя ген зеленого флуоресцентного белка в плазмиде pEGFP - N 1 (Clontech), промотор транскрипции CMV млекопитающего (цитомегаловирусный промотор), часто используют для трансфекции клеток млекопитающих (RU 2234530, опубл. 20.08.2004). Однако все эти плазмиды обеспечивают экспрессию репортерного гена на высоком уровне только при кратковременном культивировании, а при длительном культивировании происходит быстрое затухание экспрессии трансгена.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание экспрессирующих векторов для культур клеток млекопитающих, в которых для поддержания высокого и стабильного уровня наработки целевого белка будут использованы терминатороы транскрипции, обрывающие геномные траснкрипты в местах встройки трансгена в геном.

Поставленная задача решается созданием трансгенных линий клеток млекопитающего, продуцирующих белок со стабильным и высоким уровнем экспрессии, включающим трансформацию клеток млекопитающего экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемые выше последовательности цитомегаловирусного промотора.

Предлагаемое изобретение может быть использовано для конструирования трансгенных конструкций, содержащих эффективно работающие регуляторные элементы, в биотехнологии, молекулярной биологии и представляет интерес для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы в медицинских и исследовательских целях.

Сущность описываемого изобретения поясняется чертежом, на котором представлены схемы конструкций для тестирования ДНК-элементов в культурах клеток млекопитающих, где

А - контрольная pEGFP_N1, в которой тестируемые ДНК-элементы отсутствуют;

Б - контрольная 2xIns_pEGFP, в которой выше цитомегаловирусного промотора встроен инсулятор из β-глобинового локуса кур;

В, Г - конструкции SV-40_pEGFP и β_pEGFP с ДНК-элементами - терминаторами транскрипции, встроенными выше цитомегаловирусного промотора.

Пример 1. Конструирование рекомбинантных плазмид.

В качестве репортерного гена использовался ген зеленого флуоресцентного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), находящийся под контролем цитомегаловирусного промотора. Известно, что данный промотор обеспечивает высокий уровень транскрипции целевого гена в большинстве известных культур клеток млекопитающих. Перед промотором гена помещались ДНК-элементы, способные терминировать транскрипцию (терминаторы).

Для оценки эффективности применения терминаторов транскрипции для поддержания стабильного и высокого уровня наработки целевого белка использовались следующие плазмиды (см. чертеж).

А) В качестве отрицательного контроля использовался коммерческий вектор pEGFP_N1 (Clontech), содержащий ген зеленого флуоресцентного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), находящийся под контролем цитомегаловирусного промотора. Данная плазмида содержит ген устойчивости к неомицину, который использовался в качестве маркерного для последующего отбора рекомбинантных клеток.

Б) Для сравнения эффективности использования терминаторов транскрипции с известными на данный момент элементами, способными поддерживать транскрипцию гена на высоком уровне, была сконструирована плазмида 2xIns_pEGFP.

Для получения данной плазмиды в вектор pEGFP_N1 по сайту рестрикции Pci I, находящемуся перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора на расстоянии 640 п.н. от точки старта транскрипции, встраивалась последовательность длиной 2427 п.н., содержащая две тандемные копии инсулятора из бета-глобинового локуса курицы. Данная последовательность была получена из коммерческой плазмиды рВС 1 (Invitrogen). Этот элемент в настоящее время широко используется для повышения уровня экспрессии целевого гена, так как считается, что он обладает способностью изолировать трансген от влияния окружающих цис-регуляторных последовательностей.

В) Плазмида SV-40_pEGFP, содержащая последовательность терминатора транскрипции вируса обезьян 40 (SV-40, simian virus 40) перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора, была получена путем встраивания данного фрагмента ДНК длиной 868 п.н., по сайту рестрикции Pci I.

Г) Плазмида β_pEGFP, содержащая последовательность терминатора транскрипции из β-глобинового локуса человека перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора, была получена путем встраивания данного фрагмента ДНК длиной 868 п.н. по сайту рестрикции Pci I.

Пример 2. Получение трансфицированных клеточных линий.

Анализ экспрессии репортерного гена проводился на культуре клеток яичников китайского хомячка (СНО-К1), как наиболее широко применяемой в биотехнологической практике для наработки целевых белков.

Линия клеток СНО-К1 культивировалась на среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 35 мг/л L-пролина, а также коммерческий антибиотик Mycokill-AB (PAA Laboratories) в рабочей концентрации. Пересев клеток производился 1 раз в 5 дней при концентрации клеток 10⁵ клеток на 1 см², с разведением 1:20. Клетки культивировали при температуре 37°С, в атмосфере 5%-ного СО₂ и высокой влажности.

1. Трансфекция клеток.

Данная культура клеток была трансфицирована полученными рекомбинантными плазмидами. Для более эффективной интеграции трансгенной конструкции в геном плазмиды были линеаризованы при помощи рестриктазы ApaLI. Трансфекция проводилась согласно следующему протоколу.

A) Клетки в количестве 70-80% от монослоя (8*10⁴ клеток на 1 см²) промывались культуральной средой, не содержащей сыворотки.

Б) Подготавливалась трансфекционная смесь: 3-4 мкг линеаризованной плазмидной ДНК смешивались с 375 мкл культуральной среды, не содержащей сыворотки. В отдельной пробирке с таким же количеством аналогичной среды смешивался коммерческий трансфицирующий реагент Lipofectamine 2000, количество которого определялось соотношением 3 мкл реактива на 1 мкг плазмидной ДНК. После этого полученные растворы объединялись и инкубировались при комнатной температуре в течение 30-40 минут.

B) Полученная трансфекционная смесь наслаивалась на промытые клетки.

Г) Через 4-6 часов после начала трансфекции трансфекционная смесь заменялась на культуральную среду DMEM с сывороткой.

Анализ уровня экспрессии репортерного гена оценивался по интенсивности флуоресценции на вторые сутки после трансфекции (36-48 часов) при помощи проточной цитофлуориметрии. В качестве отрицательного контроля использовались нетрансфицированные клетки линии СНО-К1.

2. Цитофлуориметрический анализ.

Для проведения цитофлуориметрического анализа клетки промывали фосфатно-солевым буфером, трипсинизировали и снимали с чашек Петри. Затем дважды отмывали от трипсина и тщательно ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Полученную суспензию (10⁶ клеток в 1 мл буфера) переносили в 5 мл круглодонные пробирки.

Напряжение каналов проточного цитофлуориметра подбиралось таким образом, чтобы аутофлуоресценция нетрансфицированных клеток не учитывалась при проведении измерений. Для этого напряжение в каналах FL1 (в котором и детектируется флуоресценция eGFP) и FL2 (который использовали в качестве контрольного пустого канала) изменяли так, чтобы в процессе измерений подавляющее большинство клеток, не содержащих ген eGFP, оказалось в области, не превышающей значение «10» на логарифмической шкале, отложенной для каналов FL1 и FL2.

После проведения калибровки все образцы измерялись при постоянных значениях напряжений по каналам FL1 и FL2. Так, если в клетках детектировалась флуоресценция eGFP, на логарифмической шкале по каналу FL1 фиксировалось появление клеток в области, превышающей значение «10», и все количественные значения уровня экспрессии гена измерялись именно в этой области.

3. Поддержание пулов трансфицированных клеток.

После проведения трансфекции полученные пулы культивировались согласно описанному выше протоколу.

Для того чтобы избавиться от клеток, не содержащих трансген, производилась селекция полученных пулов трансфицированных клеток при помощи коммерческого антибиотика Geneticin (Invitrogen), вводимого в концентрации 800 мкг/мл. Так как в результате подавления транскрипционной активности трансгена наработка продукта гена устойчивости к антибиотику с течением времени снижается, после 77 суток культивирования концентрация антибиотика была постепенно снижена до 200 мкг/мл.

4. Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в пулах трансфицированных клеток.

Для определения степени подавления трансгена в пулах клеток, трансфицированных контрольными (pEGFP_N1 и 2xIns_pEGFP) и экспериментальной (SV-40_pEGFP, β_pEGFP) конструкциями, каждые 10-14 суток при помощи проточной цитофлуориметрии производился анализ уровня экспрессии репортерного гена.

Средний уровень экспрессии гена EGFP в пуле клеток в определенный момент времени оценивался по процентному содержанию клеток, характеризующихся значением интенсивности флуоресценции больше «10» по логарифмической шкале, то есть нарабатывающих значимое количество данного белка.

Показателем эффективности использования встраиваемого перед геном ДНК-элемента для высокого уровня наработки белка служило отношение количества клеток, экспрессирующих EGFP, в пуле клеток, несущих конструкцию с данным элементом, к количеству экспрессирующих EGFP клеток с контрольной плазмидой (pEGFP_N1).

Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в пулах трансфицированных клеток приведены в таблице 1.

Таблица 1   Время культивирования, сут 2 16 27 39 56 68 77 91 103 114 128 конструкция 2xIns_pEGFP 0,49 2,17 1,43 1,27 1,75 1,50 1,37 1,83 2,36 2,61 4,78 SV-40_pEGFP 0,69 2,24 1,36 1,42 1,66 1,22 1,21 1,78 1,32 1,99 3,16 β_peGFP 0,73 2,86 1,43 1,74 1,77 1,39 1,61 2,56 1,06 2,13 5,83

Результаты анализа уровня экспрессии EGFP на протяжении 128 суток культивирования тотальной популяции трансфицированных клеток (что соответствует примерно 30 пассажам) свидетельствуют о том, что использование последовательности терминатора транскрипции перед промотором целевого гена значительно повышает эффективность наработки белка в культуре клеток в ходе длительного культивирования - более чем в три раза в конце периода испытаний.

Пример 3. Получение и анализ стабильных клеточных линий.

Анализ разнородных клеточных пулов может приводить к отклонениям, связанным с тем, что трансген при липофекции многокопийно встраивается в разные участки генома, в результате чего клетки могут обладать разной жизнеспособностью, скоростью деления, устойчивостью к антибиотику и другими характеристиками, важными для эффективной экспрессии трансгена.

Поэтому на практике наработка рекомбинантных белков осуществляется путем отбора стабильных клеточных линий, полученных из одной трансфицированной клетки и, таким образом, характеризующихся однородным генотипом, что позволяет исключить влияние вышеописанных факторов и отобрать наиболее эффективный клон.

Индивидуальные клеточные клоны были получены из тотальных клеточных популяций методом лимитирующих разведений после 50 и 75 суток культивирования.

1. Получение индивидуальных клонов.

Культивируемые пулы снимались с планшетов и разводились в 10 мл культуральной среды. После этого концентрация клеток подсчитывалась при помощи камеры Гаряева и производились дополнительные разведения таким образом, чтобы концентрация клеток составляла 2-3 клетки на миллилитр среды. Полученная суспензия переносилась в 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку.

После 2 недель культивирования на среде DMEM, содержащей антибиотик Geneticin в концентрации 800 мкг/мкл, производился цитофлуорометрический анализ выживших клонов. Дальнейшее поддержание полученных линий и анализ уровня экспрессии EGFP производились согласно методике, описанной для пулов трансфицированных клеток (см. пример 2).

2. Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в индивидуальных клеточных клонах.

Основным количественным показателем экспрессионной активности репортерного гена в данном случае служила медиана распределения клеток по интенсивностям флуоресценции.

Исходно было получено 10 индивидуальных клонов с конструкцией pEGFP_N1, 17 индивидуальных клонов с конструкцией 2xIns_pEGFP и 10 клонов с конструкцией SV-40_pEGFP. Из них достаточно высоким уровнем экспрессии EGFP характеризовались 2 клона с конструкцией pEGFP_N1, 5 клонов с конструкцией 2xIns_pEGFP, 5 клонов с конструкцией SV-40_pEGFP и 6 клонов с конструкцией β_peGFP.

Необходимо отметить, что клоны с контрольной конструкцией исходно экспрессировали белок EGFP значительно слабее, чем клоны с конструкциями 2xIns_pEGFP, SV-40_pEGFP, β_peGFP (см. таблицу 2).

После двух с половиной месяцев культивирования уровень экспрессии EGFP в стабильных клеточных клонах с конструкциями pEGFP_N1 и 2xIns_pEGFP снизился приблизительно в 10 раз. При этом экспрессионная активность клонов, содержащих конструкции SV-40_pEGFP и β_peGFP, составила в среднем около 75% от исходной.

Таблица 2   Исходная активность (медиана распределения) Активность через два месяца культивирования (медиана распределения) Снижение экспрессионной активности Среднее значение pEGFP_N1 #6 23,71 2,35 0,1 0,10 pEGFP_N1 #8 16,11 1,70 0,11 2xIns_pEGFP #1 69,78 9,73 0,14 0,13 2xIns_pEGFP #6 116,52 3,59 0,03 2xIns_pEGFP #8 103,66 16,60 0,16 2xIns_pEGFP #12 33,08 5,99 0,18 2xIns_pEGFP #14 77,74 10,55 0,14 SV-40_pEGFP #2 67,93 13,10 0,19 0,76 SV-40_pEGFP #3 339,82 82,79 0,24 SV-40_pEGFP #4 50,25 134,45 2,68 SV-40_pEGFP #7 7,04 2,37 0,34 SV-40_pEGFP #11 3,31 1,24 0,37 β_pEGFP #1 78,44 15,54 0,2 1,76 β_pEGFP #3 79,86 19,63 0,25 β_pEGFP #4 76,35 14,46 0,19 β_pEGFP #5 2,19 13,34 6,09 β_pEGFP #10 15,75 56,74 3,6 β_pEGFP #11 11,34 2,41 0,21

Таким образом, последовательности терминаторов транскрипции, обрывающие геномные транскрипты и изолирующие трансген от транскрипционных сигналов, обладают способностью поддерживать уровень транскрипции трансгена на стабильно высоком уровне на протяжении достаточно долгого времени. Полученные результаты демонстрируют, что терминатор является более эффективным по сравнению с инсулятором в поддержании стабильного уровня экспрессии трансгена в клонах, что свидетельствует о возможности использования терминатора в экспрессирующих векторах для защиты трансгена от негативного влияния генома.

Источники информации

1. Kwaks Т. H.J., Bamett P., Hemrika W. et al. Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nature Biotechnology, 2003, 21; 553-558.

2. Kwaks T.H.J. and Otte A.P. Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends in Biotechnology, 2006, 24:137-142.

3. Recillas-Targa F., Valadez-Graham V., Farrell С.М. Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. BioEssays, 2004, 26:796-807.

4. Yao S., Sukonnik Т., Kean T., Bharadwaj R.R., Pasceri P., Ellis J. Retrovirus Silencing, Variegation, Extinction, and Memory Are Controlled by a Dynamic Interplay of Multiple Epigenetic Modifications. Mol Ther. 10:27-36.

Изобретение относится к области биотехнологии. Клетки млекопитающего трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемый выше последовательности цитомегаловирусного промотора. Способ может быть использован для получения культур клеток млекопитающих с высоким и стабильным уровнем наработки целевого белка для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы в медицинских и исследовательских целях. 1 ил., 2 табл.

Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего, продуцирующих белок со стабильным и высоким уровнем экспрессии, включающий трансформацию клеток млекопитающего экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемый выше последовательности цитомегаловирусного промотора.