АЦЕТИЛГИДРАЗОН 1-ЦИАНО-19β,28-ЭПОКСИ-2,3-СЕКО-18α-ОЛЕАН-3-АЛЯ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИНГИБИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА ШТАММ "ИНДИАНА" Российский патент 2011 года по МПК C07C243/32 A61P31/12 

Изобретение относится к новому химическому соединению класса 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секотритерпеноидов, конкретно к ацетилгидразону 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля, который проявляет ингибирующую активность в отношении вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм «Индиана».

Описания заявляемого соединения и его свойств в источниках информации не обнаружено.

Ближайший аналог описываемого соединения по структуре - 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аль [Толмачева И.А., Назаров А.В., Майорова О.А., Гришко В.В. Синтез лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секопроизводных на основе бетулина. // Химия природных соединений. - 2008. - №5. - С.491-494] указанной активности не проявляет.

Несмотря на создание вакцины против вируса везикулярного стоматита, остается актуальным использование противовирусных агентов и поиск новых вирусингибирующих соединений.

Так, известен широко применяемый для профилактики и лечения широкого спектра вирусных инфекций препарат Интерферон человеческий лейкоцитарный, который обладает профилактической активностью в отношении ВВС [Basu M., Maitra R.K., Xiang Y., Meng X., Banerjee A.K., Bose S. Inhibition of vesicular stomatitis vims infection in epithelial cells by alpha interferon-induced soluble secreted proteins. // Journal of General Virology. - 2006. - V.87. - P.2653-2662]. Однако этот препарат не оказывает вирусингибирующего эффекта в условиях первичного инфицирования клеток вирусом ВВС.

Среди анти-ВВС активных соединений описаны полициклические тритерпеноиды, проявляющие in vitro вирусингибирующее действие в условиях первичного ВВС-инфицирования клеток млекопитающих.

Известна тритерпеновая глицирретовая кислота [Патент US №4891221, А61К 35/14 Whole blood antiviral process and composition, опубл. 02.01.1990], подавляющая репродукцию ВВС. Недостатком данного соединения является высокая вирусингибирующая доза (от 0,1 до 0,7 вес.%) и необходимость подкисления среды культивирования клеток до уровня рН 6,5-7,4 для проявления тритерпеноидом анти-ВВС активности.

Известна также динатриевая соль полусинтетического олеананового производного циклоксолона [Dargan D.J., Galt C.B., Subak-Sharpe J.H. Effect of cicloxolone sodium on the replication of vesicular stomatitis virus in BSC-1 cells. // Journal of General Virology. - 1992. - V.73. - P.397-406], характеризующаяся вирулицидной активностью в отношении ВВС и ингибирующим действием в отношении всех стадий репликационного цикла ВВС. Основной недостаток динатриевой соли циклоксолона - высокая (300 µM) вирусингибирующая доза препарата.

Ближайшим аналогом заявляемого соединения по противовирусному действию является бетулиновая кислота [Kaminska Т., Kaczor J., Rzeski W., Wejksza К., Kandefer-Szerszen M., Witek M. A comparison of the antiviral activity of three triterpenoids isolated from Betula alba bark. // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska: Sectio C. Biologia. - 2004. - V.LIX. - P.1-7], которая in vitro наряду с ВВС-ингибирующей активностью проявляет вирулицидное действие (ЕС₅₀ 26,8 мкг/мл) в отношении ВВС.

В указанной публикации приведены данные по противовирусному (ЕС₅₀ 1,0 мкг/мл, TI-20) действию коммерческого реактива 90% бетулиновой кислоты Sigma Aldrich (США). По нашим экспериментальным данным противовирусная активность 95% бетулиновой кислоты значительно ниже. Таким образом, в качестве недостатка бетулиновой кислоты можно отметить ее невысокую вирусингибирующую активность. Кроме того, не обнаружено сведений о профилактических свойствах бетулиновой кислоты в отношении ВВС.

Задачей изобретения является синтез новых тритерпеновых производных, проявляющих профилактическую анти-ВВС активность и ингибирующих репродукцию ВВС в первично инфицированных клетках млекопитающих.

Для решения поставленной задачи синтезирован ацетилгидразон 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля формулы I.

Ацетилгидразон 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля формулы I проявляет ингибирующую активность в отношении вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана».

Синтезированное соединение представляет собой мелкокристаллическое вещество белого цвета, хорошо растворимое в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде. Указанное соединение плохо растворимо в гексане и не растворимо в воде.

Синтез соединения формулы I проводили способом, включающим взаимодействие гидразида уксусной кислоты с 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18β-олеан-3-алем в этаноле в присутствии каталитических количеств ледяной уксусной кислоты.

Получение ацетилгидразона 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля I

К раствору 0,44 ммоль 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля в 15 мл этанола добавляли 0,44 ммоль гидразида уксусной кислоты и 2 капли ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре в течение 7 часов. Контроль за ходом реакции проводили с помощью метода ТСХ. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. После очистки выход полученного соединения составил 0,23 г (45%); R_f 0,12 (хлороформ: этилацетат - 10:1); т. пл. 65-67°С (хлороформ: этилацетат - 10:1);

[α]²¹ _D+30,0° (с 0,5; CHCl₃).

Найдено, %: С 75,26; Н 9,85; N 8,47. C₃₂H₅₁N₃O₂.

Вычислено, %: С 75,40; Н 10,08; N 8,24.

Структура соединения формулы I подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. ИК спектр регистрировали на спектрофотометре SPECORD М80 (Германия) в пасте с вазелиновым маслом. Спектры ¹Н- и ¹³С-ЯМР записывали для растворов в CDCl₃ на спектрометре «Varian Mercury+» (США) при рабочей частоте прибора 300,0 или 75,5 МГц, внутренний стандарт - ГМДС. Температуру плавления измеряли на приборе для определения температуры плавления ПТП (Россия). Величину удельного оптического вращения регистрировали для растворов в CHCl₃ на поляриметре 341 модели Perkin-Elmer (США) при длине волны 589 нм. Элементный анализ (С, Н, N) выполняли с помощью элементного анализатора Leco CHNS-9321P (Нидерланды), данные элементного анализа соответствовали расчетным.

Спектральные характеристики соединения формулы I представлены в таблице 1.

Исследование противовирусной активности ацетилгидразона 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля I

Цитотоксичность соединений оценивали in vitro в отношении перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) по известной методике [Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений. Методические рекомендации. /Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В., Карако Н.И., Галегов Г.А., Леонтьева Н.А. Минск, 1986. - 25 с.]. Соединение I растворяли в 10% этаноле (концентрация маточного раствора - 5 мг/мл) и затем в среде поддержки - до требуемых концентраций (концентрация маточного раствора бетулиновой кислоты в 10% ДМСО составляла 2,667 мг/мл). Через 48 часов инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток и определяли токсичную концентрацию (ЦД₅₀), вызывающую гибель 50% клеток СПЭВ. Оценивали также максимальную из исследованных доз вещества (МПК), не вызывающую морфологических изменений ткани. Установлено, что показатели ЦД₅₀ и МПК соединения I составляют 31,25 и 1,95 мкг/мл соответственно. По показателю ЦД₅₀ соединение I более чем в 16 раз уступает интерферону. В то же время по уровню цитотоксического действия соединение I в 6 раз менее токсично по сравнению с бетулиновой кислотой (таблица 2).

Противовирусные свойства соединения I исследовали in vitro с использованием методик, соответствующих двум моделям инфицирования клеток млекопитающих.

Согласно методике 1 [Отраслевой стандартный образец активности лейкоцитарного интерферона альфа типа. Инструкция по применению. - М.: ФГУН ГНИИСК им. Л.А.Тарасовича, 2008], демонстрирующей защиту клеточной системы от поражения вирусом, клетки СПЭВ до внесения ВВС предварительно инкубировали с исследуемыми соединениями в течение 24 часов. В условиях данной модели (таблица 2) среднеэффективная концентрация (ИД₅₀) соединения I, на 50% подавляющая развитие ВВС, составляет 0,0001589 мкг/мл, что значительно превышает аналогичные показатели интерферона (ИД₅₀ 0,689 мкг/мл) и бетулиновой кислоты (ИД₅₀ 62,55 мкг/мл) (таблица 2). При этом химиотерапевтический индекс (ХТИ) соединения I, рассчитываемый как отношение ЦД₅₀ к ИД₅₀, составил 196665. Отношение МПК к ИД₅₀ для соединения I достигает 12272, что превышает аналогичные показатели интерферона и бетулиновой кислоты в 52 и 306800 раз соответственно.

Исследование противовирусной активности соединений в условиях методики 2 [Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений. Методические рекомендации. / Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В., Карако Н.И., Галегов Г.А., Леонтьева Н.А. Минск, 1986. - 25 с.], демонстрирующей подавление размножения вируса в первично инфицированных клетках, свидетельствует (таблица 3), что соединение I, несмотря на более низкую (по сравнению с первой моделью) вирусингибирующую активность (ИД₅₀ 0,21 мкг/мл), имеет высокий показатель ХТИ 149, который в 2129 раз превышает такой бетулиновой кислоты. Интерферон в условиях данной модели противовирусной активности не проявил.

Результаты исследования противовирусной активности соединения формулы I в сравнении с аналогами представлены в таблицах 2 и 3.

Заявляемое соединение формулы I обладает высокой профилактической активностью ИД₅₀ 0,0001589 мкг/мл и эффективно ингибирует репродукцию вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана» в первично инфицированных клетках ИД₅₀ 0,21 мкг/мл. При этом уровень противовирусной активности и величина ХТИ соединения I значительно превосходят аналогичные показатели известных анти-ВВС активных аналогов интерферона и бетулиновой кислоты.

Таблица 2 Цитотоксическое и профилактическое анти-ВВС действие исследованных соединений Соединение ЦД₅₀ МПК ИД₅₀ ХТИ МПК/ИД₅₀ Соединение формулы I 31,25 1,95 0,0001589±0,000025 196665 12272 Бетулиновая кислота (90%)* 20,0 ** 1,0 20 ** Бетулиновая кислота (95%) 5,2 2,6 62,55±12,04 0,08 0,04 Интерферон >500,00 163,00 0,689±0,127 >727 237 Примечание. * Приведены данные статьи [Kaminska Т., Kaczor J., Rzeski W., Wejksza К., Kandefer-Szerszen M., Witek M. A comparison of the antiviral activity of three triterpenoids isolated from Betula alba bark. // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska: Sectio C. Biologia. - 2004. - V. LIX. - P. 1-7]. ** Данные отсутствуют.

Таблица 3 Противовирусная активность исследованных соединений в условиях первичного ВВС-инфицирования клеток СПЭВ Соединение ИД₅₀ ХТИ МПК/ИД₅₀ Соединение формулы I 0,21±0,03 149 9 Бетулиновая кислота (95%) 72,98±10,43 0,07 0,04 Интерферон Не активен - -

Ацетилгидразон 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля формулы I:

обладает высокой профилактической активностью ИД₅₀ 0,0001589 мкг/мл и эффективно ингибирует репродукцию вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана» в первично инфицированных клетках ИД₅₀ 0,21 мкг/мл. 1 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Ацетилгидразон 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля формулы I

2. Ацетилгидразон 1-циано-19β,28-эпокси-2,3-секо-18α-олеан-3-аля формулы I по п.1, проявляющий ингибирующую активность в отношении вируса везикулярного стоматита штамм «Индиана».