3-ГИДРОКСИМИНОПРОИЗВОДНЫЕ 2,3-СЕКОЛУПАНОВОГО ТИПА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА А И ВИЧ-1 Российский патент 2013 года по МПК C07C251/14 A61P31/12 

Изобретение относится к новым химическим соединениям класса лупановых 2,3-секотритерпеноидов, которые проявляют ингибирующую активность в отношении вируса гриппа A (H7N1) и ВИЧ-1.

Известно, что при разработке новых противовирусных агентов в качестве базовых платформ активно используются природные полициклические терпеноиды. Например, на основе лупановых тритерпеноидов (бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты), в нативном виде проявляющих умеренные противовирусные свойства, получен широкий спектр полусинтетических производных с высокой ингибирующей активностью в отношении оболочечных вирусов (ВИЧ-1, вирусы гриппа А, герпеса простого и Эпштейна-Барра) [Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 2. Полусинтетические производные лупана / Т.Г.Толстикова, И.В.Сорокина, Г.А.Толстиков, А.Г.Толстиков, О.Б.Флехтер // Биоорганическая химия. - 2006. - Т.32. - №3. - С.291-307]. А-Секопроизводные лупанового типа, по сравнению с исходными тритерпеноидами обладающие более высокой биологической активностью, могут рассматриваться в качестве альтернативных базовых соединений для синтеза новых противовирусных агентов [Microbial transformations of two lupane-type triterpenes and anti-tumor-promoting effects of the transformation products / T.Akihisa, Y.Takamine, K.Yoshizumi, H.Tokuda, Y.Kimura, M.Ukiya, T.Nakahara, T.Yokochi, E.Ichiishi, H.Nishino // Journal of Natural Products - 2002. - V.65. - P.278-282; Synthesis of dammarane-type triterpene derivatives and their ability to inhibit HIV and HCV proteases / Y.Wei, C.-M.Maa, M.Hattori // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2009. - V.17. - P.3003-3010].

Ближайшие аналоги описываемых соединений по структуре - 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овая кислота [Синтез и противовирусная активность 2,3-секопроизводных бетулоновой кислоты / И.А. Толмачева, В.В.Гришко, Е.И.Бореко, О.В.Савинова, Н.И.Павлова // Химия природных соединений. - 2009. - №5. - С.566-568; 2,3-Секопроизводные бетулиновой кислоты / И.А.Толмачева, В.В.Гришко, Е.И.Бореко, О.В.Савинова, Н.И.Павлова // Патент №2410390. - 03.08.2009], проявляющая слабую активность в отношении вируса гриппа А и неактивная в отношении ВИЧ-1, и метиловый эфир 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты [Синтез лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секо-производных на основе бетулина / И.А.Толмачева, А.В.Назаров, О.А.Майорова, В.В.Гришко // Химия природных соединений. - 2008. - №5. - С.491-494], противовирусные свойства которого не описаны.

Задачей изобретения является синтез новых 2,3-секотритерпеновых производных с ингибирующей активностью в отношении вируса гриппа А и ВИЧ-1, перспективных для расширения сырьевой базы противовирусных средств и в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений.

Для решения поставленной задачи синтезированы

1. 3-Гидроксиминопроизводные 2,3-секолупанового типа общей формулы:

где R=H или СН₃.

2. Соединения по п.1, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса гриппа А.

3. Соединение по п.1, где R=H, проявляющее ингибирующую активность в отношении ВИЧ-1.

Получены соединения общей формулы, где R=Н (соединение I); R=СН₃ (соединение II).

Синтезированные соединения представляют собой мелкокристаллические вещества белого цвета, хорошо растворимые в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде. Указанные соединения плохо растворимы в гексане и не растворимы в воде.

Синтез соединений общей формулы проводили способом, включающим взаимодействие 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты или ее метилового эфира с гидрохлоридом гидроксиламина в этаноле в присутствии пиридина.

Структура соединений I, II подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. Спектральные характеристики соединений I, II приведены в табл.1. ИК-спектр (ν, см^-1) регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре IFS 66/S Bruker (Германия) в пасте с вазелиновым маслом. Спектр ¹Н- и ¹³С-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) записывали для раствора в CDCl₃ на спектрометре «Varian Mercury+» (США) при рабочей частоте прибора 300 или 75.5 МГц, внутренний стандарт - гексаметилдисилоксан. Пороговое значение температуры в точке плавления определяли на приборе OptiMelt МРА100 (США) со скоростью 1°С в мин. Величину удельного оптического вращения измеряли для раствора в хлороформе на поляриметре 341 модели Perkin-Elmer (США) при длине волны 589 нм. Вещество обнаруживали 5% серной кислоты при нагревании (100-120°С) в течение 1 мин. Для колоночной хроматографии использовали силикагель марки «Merck» (60-200 µm), соотношение вещества и сорбента ≈ 1:50, элюент смесь гексан:этилацетат (7:1).

Противовирусная активность соединений в отношении репродукции вируса гриппа A (H7N1) и вируса иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1) изучена на культурах клеток.

Описания заявляемых соединений и их свойств в источниках информации не обнаружено.

Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1-4 и результатами исследований, приведенными в таблицах 1 и 2.

Пример 1. Получение 3-гидроксимино-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение I).

Смесь 1 ммоль 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты и 3 ммоль гидрохлорида гидроксиламина растворяли в 50 мл смеси этанол-пиридин (5:1). Реакционную смесь кипятили в течение 2-3 ч. Ход реакции контролировали методом ТСХ. По окончании реакции растворитель упаривали, остаток разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом, органический слой отделяли, сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии, выход полученного соединения составил 63%; R_f 0,44 (гексан:этилацетат - 7:3); т.пл. 208,7°С (гексан:этилацетат - 7:1); (с 0,25; CHCl₃).

Пример 2. Метиловый эфир 3-гидроксимино-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (соединение II) получали по методике, описанной в примере 1. Выход 52%; R_f 0,3 (гексан:этилацетат - 7:3); т.пл. 109,6°С (гексан:этилацетат); (с 0,3, CHCl₃).

Пример 3. Исследование противовирусной активности в отношении вируса гриппа А.

При проведении испытаний использовали культуру клеток первичных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), а также вирус гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1). Исследования проводили методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывали от ростовой среды, инфицировали различными разведениями вируса в пределах 0,01-0,0001 БОЕ/клетка путем нанесения на клетки вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляли и клетки покрывали расплавом питательной среды на основе концентрата среды 199 с добавлением 1% бактагара и 0,005% нейтрального красного (все реактивы - Sigma) и различных концентраций исследуемых соединений. После застывания покрытия флаконы помещали в термостат на 36 ч и затем подсчитывали количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя.

Титр вируса в присутствии исследуемого вещества и в контроле рассчитывали в lg БОЕ (бляшкообразующих единиц) в 1 мл. Первичным критерием противовирусного действия считали наличие различий в сравнении с контролем вируса. Обработку полученных данных (вычисление титра вируса и средней ошибки средней арифметической, Sx) выполняли методами статистики для малых значений n в несгруппированном ряду данных. Концентрации веществ, подавляющих размножение вируса на 50% (среднеэффективная концентрация, ЕС₅₀), определяли на основе пробит-анализа и взвешенной линейной регрессии [A computer program in BASIC for estimation of ED₅₀ and LD₅₀ / K.P.Fung. // Computers in Biology and Medicine. - 1989. - V.19. - №2. - P.131-135]. Вычисляли также отношения максимальной переносимой концентрации (МПК) веществ к ЕС₅₀. МПК определяли как максимальную концентрацию вещества, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток и нарушения поглощения ей витального красителя (нейтрального красного).

Пример 4. Методика исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ-1.

Испытания проводили на перевиваемой суспензионной T-лимфо-бластоидной линии клеток человека МТ-4 (плотность 4-5×10⁵ клеток/мл) на питательной среде RPMI-1640 Sigma-Aldrich (США). В качестве инфекционного агента использовали высокорепликативный изолят ВИЧ-1_zmb с титром 6,0 lg ТЦД₅₀. Определение наличия анти-ВИЧ активности проводили с помощью формазанового теста в МТТ-варианте. Исходный раствор препарата (5,0 мг/мл) готовили ex tempore путем растворения в 10% этаноле. Базовый раствор титровали в лунках 96-луночной панели с 5-кратным шагом, после чего в лунки последовательно вносили клетки и вирус (терапевтическая схема). Конечный объем реакционной смеси составлял 200 мкл/лунку. Контролями служили необработанные препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировали в атмосфере, содержащей 5% СО₂ при 37°С. Учет результатов осуществляли через 72 ч. В качестве позитивного контроля на анти-ВИЧ активность в каждой серии экспериментов использовали коммерческий препарат азидотимидина, который титровали параллельно с исследуемым образцом.

Методика базируется на определении интенсивности образования формазанового продукта при внесении в клеточную культуру реагента МТТ (3-(4,5-диметил-тиазол-2)-2,5-дифенал-тетразолиум-бромида). После 3-часовой экспозиции при 37°С надосадок удаляли, а образовавшийся формазановый продукт растворяли в диметилсульфоксиде, затем проводили измерение интенсивности развившегося окрашивания на спектрофотометре Plate Reader DAS A3 (Италия) при длине волны 550/630 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты клеток, который в положительных случаях должен быть не ниже 50%. Вычисляли ЕС₅₀ препарата и соотношение MПK/EC₅₀, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций.

Установлено, что соединение I сочетает два вида противовирусной активности и обладает способностью подавлять репродукцию вируса гриппа А и ВИЧ-1 в диапазоне концентраций 50-12,5 и 1,5-0,016 мкг/мл соответственно. Соединение II обладает способностью подавлять репродукцию вируса гриппа А в диапазоне концентраций 24-11 мкг/мл. Вычисленные значения ЕС₅₀ и отношения МПК/ЕС₅₀ приведены в таблице 2.

Таблица 1 Данные ИК, ЯМР ¹Н и ¹³С спектров соединений I, II Соедине-
ние ИК спектр (ν, см^-1) Спектр ¹Н-ЯМР (300,0 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): Спектр ¹³С-ЯМР (75,5 МГц, CDCl₃, δ, м.д.) I 1688 (C=N), 1720 (C=O), 2237 (C≡N), 3188 (NOH) 0,90, 0,95, 1,00, 1,13, 1,17 (15Н, 5с, 5СН₃), 1,67 (3Н, с, СН₃), 2,48 и 2,59 (2Н, 2д, J=18,2, СН₂), 3,01 (1Н, тд, J=10,8, 4,5, CH), 4,57 и 4,69 (2Н, 2с, СН₂), 7,74 (1Н, с, CH), 10,26 (1H, c, NOH), 11,63 (1Н, ш.с, СООН) 13,31, 14,74, 16,85, 18,15, 18,90, 20,68, 21,03, 24,47, 27,77 (2С), 28,20, 28,43, 29,33, 30,86, 32,12, 35,71, 36,95, 39,76, 41,19, 41,60, 43,49, 45,59, 47,73, 50,34, 54,76, 108,49, 117,42, 149,27, 156,95, 176,87 II 1644 (C=N), 1728 (СООСН₃), 2244 (C≡N), 3388 (NOH) 0,89, 0,92, 1,00, 1,13, 1,18 (15Н, 5с, 5СН₃), 1,67 (3Н, с, СН₃), 2,44 и 2,57 (2Н, 2д, J=18,6, CH₂), 2,93-3,10 (1Н, м, CH), 3,65 (3Н, с, СООСН₃), 4,60 и 4,72 (2Н, 2с, СН₂, 7,53 (1Н, с, CH), 10.56 (1Н, с, NOH) 14,56, 15,80, 18,11, 19,21, 20,05, 21,90, 21,94, 25,55, 28,59, 29,50, 29,62, 30,46, 31,91, 33,27, 36,82, 38,26, 40,64, 41,01, 42,46, 42,79, 44,66, 46,88, 49,18, 51,28, 51,48, 56,51, 109,83, 118,42, 150,26, 160,08, 176,62

Таблица 2 Противовирусные свойства соединений I, II Соедине-
ние Токсичность для культур клеток, МПК (RD/MT-4), мкг/мл Противовирусные свойства вирус гриппа А ВИЧ-1 EC₅₀, мкг/мл отношение МПК/ЕС₅₀ ЕС₅₀, мкг/мл отношение МПК/ЕС₅₀ I 50/1,5 8,8 5,7 0,03 50 II 400/10 11,3 35,4 Н.а. Н.а. Н.а. - соединение не активно.

Описываются 3-гидроксиминопроизводные 2,3-секолупанового типа общей формулы

где R=H или CH₃, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса гриппа A. Соединение с R=H сочетает противовирусную активность в отношении вируса гриппа А с анти-ВИЧ активностью. Соединения перспективны для разработки противовирусных средств и в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. 3-Гидроксиминопроизводные 2,3-секолупанового типа общей формулы:

где R=H или СН₃.

2. Соединения по п.1, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса гриппа А.

3. Соединение по п.1, где R=H, проявляющее ингибирующую активность в отношении ВИЧ-1.