Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 C12N7/00 C12R1/91 

1 1

Мг. обретепие относится к вирусо.по- гни и может 6I..1TJ.. использовано для специфической лаборлторной диат Нос- тики геморрагической лт1хорадки с почечным синдромом ia Дальнем Востоке СССР.

Целью изобретения является получение нового, штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом -(ГЛПС) 1-го серотипа.

Штамм получают следующим образом.

Используют легочную ткань самца восточ о-азиатско й мыши в возрасте 8-10 месяцев.

Перед исследованием легкие трижды отмывают в физиологическом растворе (0,85%-ном NaCl), содержащем пени- Ц1ШЛИ1 (500 ед/мл), стрептомицин (250 мкг/мл) и кпнаминин (500 ед/мл)/ Затем лег кис помещают в стерильную ступку и TmarejJbirp растирают в при

сутствии небольшого кол1-гчества стерильного .:1. Лобавляют физиологически растнор с 2% нормальной телячьей -сыворотки IIS такого расчета; гтобы получ1ггь 10 v-Hyio суспензию легочной ткани (на i иг легких ляют соответстпенио 1,0 мл физиологического раствора). Лег очную суспензию отсасывают стерильной пипеткой, переносят в 11ису.,1Й (шакои и цеитрифугирхпот при 6.000 об/мин п течение 30 . Налос, доч}{ую жидкость осторожно изв:тс к,.1 1т и используют для заражения клеточкой культур,.

гг

Для заражения используют клетки VERO-E6, которые выращивают в 50 мл флаконах до образования полного монослоя. Осветленную 10%-нуто суспензию легочной ткани вносят в f (Ьлакона по 0,2 мл в каждый. После контакта }шокулята с. клетками при в течение 40 мин монослой клеток дважды отмывают средой Ili Jia и во флаконы добавляют средг л.ля поддержания роста .клеток (среда Игла 2-ЬШМ с 2% нормальной телячьей сыворотки). Инкубирование Ш ф11цированных культуф клеток проводят при .

. Через 12 дней с момента инокуляции клеток культуральную ЖИДКОСТЬ сливают, клеточньш монослой дван лы отмывают раствором Хенкса и обрабатывают последовательно О,25А-ным.раствором трипсина (2 мл на флакон) и 0,02%-ным раствором версена (2 мл на флакон) по 2 МИ1-1 . После удаления вер- сена флаконы с клетками инкубируют

fO

195532

при ЗУС; Д(; появлонип причнако разрыхления монослоя. Затем ио флаконы добавляют 1 мл свежей питательной среды с 1 ОХ нормально телячьей сы5 воротки (НТС) и прогзодят FJ зтом объеме сусиенд фопание . Развесь инфицированных клеток в o6iieMe 0,2 мл сме 1ивают с paBFibiM объемом суспензии свежих нормальных клеток VERO-E6, обеспечивая необходимую ко 1центрацию клеточной суспензии (50000-60000 клеток в 1. мл) добавлением среды Иг- ла-2 MEM с 10% НТС. Через 2 суток инкубирования- при ЗУС во флаконах заменяют среду роста на среду поддержа- роста клеток и продолжают и -1куби- р.овать клетки при в течение 10 дней. Субкультивирован 1е инфициро- клеток VERO-E6 проводят в дальнейшем по аналогич - ой методике с 12-дневнь м интервалом.

J5

20

25

Начиная со 2-го пассажа, часть инфицирован Н1.Х клеток наносят на предметные стекла и исследуют методом фокусирующих антител (МФЛ) ма присутствие спеиифическот о ант 1гена вируса ГЛПС. На уровне 2-го пассажа специфическое свечение антигена вируса

30 ГЛПС обнаруживается лтнь в единичных клетках. Отмечается ци топлазматичес- кая локализация антигена вируса ГЛПС преиму иественно в перинуклеарной .зоне И 1фицированнь х клеток. По мере

35 a;j.nTaunii вируса в пассажах наблюдается образова {ие более крупных гранул, которые равномерно заполняют всю цитоплазму клеток. Специфическое све- ченне определяется как ярко-зеленая

40 люми1 есценция на фоне непораженных кирпит 1 ого цвета. Количество антигейцоложительных клеток заметно возрастает от пассажа к пассажу и составляет 90-100% к 5-6 пассажу. Ци45 топатического эффекта в илфицирован- ньгх купьтурак. не отмечается в течение всего периода наблюдения. На уровне 6 пассажа суспензии мнфшдированных клеток разливают по 0,5 мл во флаконы

50 и хранят при минус 6()°С. В дальнейшем зти суспензии используют в качестве посевного Birpyca и обозначают как штамм Уссури 4590,

5 1Итамм Уссури 4590 хранится в

Государственной коллек 1ии вирусов Института вирусологии им, Л.; . Ивановского АМН СССР под № ГКЕ-710 н характеризуется следующими пр.знаками.

Морфолог-цчот:кие признакг).

При г)лектронио-мик-рог:кппическом изучер{ии к-леток ЕКО-Е6, инфицированных uiraMMOM Уссури-4590 вируса ПШС,. ПРОЯВЛЯЮТСЯ чя.стицы округлой ил овальной формы с дргаметром к срел1 е.м 100 им, окруженные хороиго контуриру- ющейся липопротеииовон оболочкой. Морфология частиц сходна с таковой вирусов семейства Буньявириде,

Культуральиые признаки.

Оптимальная множественность заражения клеток VERO-E6 штаммом Уссури 4590 cocTaahHe.T не менее О, 1 вирусной частшц.1 на клетку. Оптгшаль- ной температурой размножения штамма является . Вирус стабилен в интервале рН 7, 2-7, 8.

Максимальный титр вируса в инфицированных клетках обнаружипается на день после за15ажения и составляет 4,0-4,3 logUDjp/мл,

JO

Инфекционные признаки.

При введении штамма Уссури 4590 вируса ГЛПС лабораторным -животным (взрослые белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики) клинических проявлений заболевания и их гибели не обнаруживается в течение всего срока наблюдения за животными (до 3-х месяцев с момента инокулирования ви- руса). Вместе с тем, начиная с 10дня после заражения в их крови обнаружи- вается накопление специфических антител к вирусу ГЛПС. Оптимум накопления антител определяется к 25-.ЗОдню с момента их заражения. Таким образом-, экспериментальные животные могут быть использованы для ит-шуниза- ции и получения иммунных антиГЛПС сывороток, но не для -пассирования животного вируса.

35 -

Полная инактивация инфекционной активности штамма Уссури 4390 вируса ГЛПС происходит при его нагревании при бО.С в течение 30 мин и при обработке ультрафиолетовым облучением (бактерицидные лампы) в течение 2 ч. Антигенная активность в первом случае снижается в 4 раза, а во втором случае остается без изменения.

Q промывают 0,01 М фосфатным буферньгм раствором и сушат при комнатной температуре. На препарать наносят люми- несцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведе({ии,

Хранение вирусного штамма осуществляется в виде суспензии инфицирован-,j которое определяют в предварительном ных клеток VERO-E6 с добавлением 5% опыт.е. В качестве контрастера исполь- НТС при минус 60 С. При таком режиме зуют раствор Голубого Эванса в конеч- хранения вирусньш штамм не теряет ной концентрации 1; 10000. Препараты своей инфекционной и ант 1генной ак- вновь во влажной камере

и

fO

f5

JO

319355 4

т I ll нос ти к течение t года блюдеимя),

Использование гят:1мма Уссури- 1590 для специфической лабораторной диагностики иллюстрируется следуюпигм приме poN.

Для заражения вирусом ГЛПС (штамм Уссури-4590) используют суспензию клетрк V ERO-E6. После внесения ви- руссодержащей суспензии во флаконы со взвесью клеток их помещают в термостат при . Культивирование вируса ГЛПС в клетках осуществляют в течение 12-14 суток.

1л 12-14 сутки с начрла инфицирования клеток VERO-E6 вирусом ГЛПС мокослой клеток послсдопательно обрабатывают раствором т ипсинл и ве.рсе- на, после чего проводят суспенднро- ванис инфицированных клеток в небольшом количестве физиoлoг тчecкoгo раствора. Конечная концентрация клеток лолжна составлять 300-400 тысяч в 1 мл.

Аналог ичным образом готовят суспензию нормальн(,1х нeин(ициpoвaинb x клеток УЕКО-Е6. Суспензии инф щиро- ванных и нормальных клеток смешивают в равньгх объемах и раскапывают на предметные стекла по 3-3 мкл на каждый мазок. После полно1 о высыхания суспензий препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 15-20 мин и затем обрабатывают ультрафиолетовым 35 облучением для инактивации инфекцион- - ной активности вируса. Приготовленные таким образом антиг-енные препараты до использования хранят при ми- .

нус

Для выявления специфическюс антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном Bi-фуса

j ГЛПС. Сыворотки обследуют в МФА в разведениях 1:16 и выше.

Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при 37°С в течение 30 мин и затем стекла 3-кратно

Q промывают 0,01 М фосфатным буферньгм раствором и сушат при комнатной температуре. На препарать наносят люми- несцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведе({ии,

,j которое определяют в предварительном опыт.е. В качестве контрастера исполь- зуют раствор Голубого Эванса в конеч- ной концентрации 1; 10000. Препараты вновь во влажной камере

Заказ 2491Тираж 494. .Подписное

ВИНИЛИ Государственного комитета СССР

по .делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35,- Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является -получение нового штамма .вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа. fflfaMM Уссури- 4590 В1фуса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспензии легочной ткани восточно-азиатской лесной мьппи, отловленной в природном очаге ГЛПС в Приморском крае, на культур клеток VERO-E6. Штамм храВСЕСОЮЗНАЯ lUrZi rHJ-TEXHIiVim БИБЛИОТЕКА нится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии нм. Д.И.Ивановского под Ь ГКВ-710 и характеризуется следующими признаками. При электронно-микроскопическом изучении инфицированных клеток VERO-E6 выявляются частицы округлой формы с диаметром окбло 10 нм, окруженные ли- попротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток VERO-E6 при 37 С, рН 72-78, множественность заражения составляет не ме.нее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день после заражения и составляет 40-45 log UDjg /мл. В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфические антитела к вирусу ГЛПС, для выявле- . ния которых исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса Уссури-4590. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. 1 табл. B Cf3 X ел ел ел