Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 C12N7/00 C12R1/91 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано длп лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Целью изобретения является получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-ОГО серотипа.

Данный штамм получают следующим образом..

.Легочную ткань самца рыжей полевки возраста 11-12 месяцев трижды отмывают в физиологическом растворе (0,85% NaCI), содержащем антибиотики пенициллин, стрептомицин, канамицин в Концентрации 500 ЕД/мп, 230 мкг/мл и 500 ЕД/мл соответственно), Затем ткань, помещают в стерильную ступку и тщательно растирают в присутствии небольшого количества стерильного песка. Добавляют физиологический раствор с 2% нормальной телячьей сыворотки из такого расчета, чтобы получить 10%-ную суспензию легочной ткани (на 1 г легких добавляют соответственно 1,0 МП физиологического раствора) . Легочйую суспензию отсасывают стерильной пипеткой и переносят в ин сулиновый флакон, которьга помещают в низкоскоростную центрифугу. После иептрифугирования при 6000 об./мин в течение 30 мин надосадочную жидкость осторожно извлекают и используют для заражения .клеточной культуры.

Для заражения используют клетки VERO-E6, которые выращивают в 50 мл флаконах до образования полного монослоя „ Осветленную 10%-ную суспензию лёгочной ткани вносят в 4 флакона по 0,2 мл в каждый. После контакта ино- кулята с клетками при З7 с в течение . 40 мин. м,онослой клеток дважды отмывают средой Игла и во флаконы добавляют среду для поддержания роста клеток (среда Игла 2-МЕМ с 2% нормальной телячьей сыворотки). Инкубирование инфицированных культур клеток проводят в термостате при 37 С.

Через 12 дней с момента инокуля- .ции клеток культуральную жидкость сливают, клеточный монослрй дважды отмьшают раствором Хенкса и обрабатывают последовательно О,25%-ным раствором трипсина (2 мл на флакон).и .0,02%-ньП 1 раствором версеиа (Z мл. на флакон) пс 2 мин каждым. После удаления версена флаконы- с клетками инкубируют в термостате при 37 С до появления признаков разрыхления моиослоя. Затем во флаконы добавляют 1 мл свежей питательной среды с 10% нормальной телячьей сыворотки. (НТС) fi проводят в этом объеме суспендиро- вание клеток о Взвесь инфицированных клеток в объеме 0,2 мл смепщвают с . равным объемом суспензии свежих нормальных клеток VERO-E6, обеслечивая необходимую концентрацию клеточной

суспензии (50000-60000 клеток в 1 мп) добавлением среды Игла 2-МЕМ с 10% НТС. Через 2 сут. инкубирования при во флаконах заменяют среду роста на среду поддержания роста клеток

и продолжают инкубировать клетки при 37 С в течение еще 10 дней. Субкультивирование инфицированных клеток VERO-E6 проводят в дальнейшем по -аналогичной методике с 12-дневйым интервалом.

Начиная со 2 пассажа часть инфицированных клеток наносят на предметные стекла и исследуют их на присутствие специфического флурресцирующего антигена вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом (.ГЛПС) . На уровне 2-го пассажа специфическое свечение антигена вируса ГЛПС обнаруживается лишь в отдельных единичных

кле-тках в поле зрения. Отмечается цитоплазматическая локализация антигена вируса ГЛПС, преимущественно в перинуклеарной зоне инфицированных клеток, для которого характерно нежное желто-зеленое мелкозернистое све- чение. По мере адаптации вируса в пассажах наблюдается образование более крупных гранул, равномерно заполняющих всю цитоплазму клеток. Специфическое свечение определяется как ярко-зеленая люминесценция на фоне . непораженных клеток кирпичного цвета. Количество антигенположительных клеток заметно возрастает от пасса-..

жа к пассажу и составляет 90-100% к 5-6 пассажу. Цитопатического эффекта в инфицированных культурах не наблюается. На уровне 6 пассажа суспензии инфицированных клеток разливают

о 0,5 МП во флаконы и хранят при . В дальнейшем эти суспензии спользуют в качестве посевного ни- : уса и обозначают как штамм УФА-СС- 1820.

Штамм УФА CG-1820 хранится в Го- ударственной коллекции вирусов Ин-г титута вирусологии им. Д.И. Ивановкого АМН под номером ГКВ-706 и хаактеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

При электронно-микроскопическом изучении клеток VERO-E6, инфицированных штаммом УФА CG-1820 вируса ГШС, выявляются частицы округлой или овальной формы с диаметром в среднем 100 нм, окруженные хорошо контуриру- ющейся липопротеиновой оболочкойоМор фология частиц сходна с морфологией вирусов семейства Буньявириде. Вмес- те с тем очевидно, что некоторые особенности морфологии и морфогенеза свидетельствуют об его определен- таксономической обособленности о вирусов известных четырех родов этого семейства,

Биологические признаки.

Оптимальная множественность заражения клеток штаммом УФА CG-1820 составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку. Оптималь- 1НОЙ температурой размножения штамма в культуре клеток VERO-E6 является t + . Вирус стабилен в интервале ;рН от 7,2 до 7,8. Максимальный титр вируса, при заражении культуры клеток VERO-E5 составляет 5,0-6,0 log НЦуоу д ; сроки максимального на- коапения флуоресцирующего антигена вируса ГЛПС составляют 12-14 дней.

Инфекционные признаки.

При введении штамма УФА CG-1820 вируса ГЛПС лабораторным животньм (взрослые белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики) клинических проявлений заболевания и их гибели не наблюдается -в течение всего срока наблюдения за животными (до 3-х месяцев с момента инокулирования вируса) . Вместе с тем, начиная с 10 дня после заражения, в их крови обнаруживается накопление специфических антител к вирусу ГЛПС. Оптимум накопления антител определяется к 25-30 дню с момента их заражения. Та КИМ образом, экспериментальные животные могут быть использованы для иммунизации и получения иммунных анти- ГЛПС сывороток, но не для пассирования живого вируса.

Полная.инактивация инфекционной актийности штамма УФА CG-1820 вируса ГЛПС происходит при его нагревании при в течение 30 мин и при обработке ультрафиолетовьм облучением (бактерицидные лампы) в течение 2ч. Аитигеииая активность в первом случае снижается в 4 раза, а во втором случае остается без изменения.

10

20

25

.,

Хранение вирусног(1 штамма осуществляется в виде суспензии инфицированных клеток VERO-E6 с добавлением 5% НТС при температуре . При таком режиме хранения пирусньй штамм Hfe теряет своей инфекционной и антигенной активности в течение 1 года (срок наблюдения).

Использование штамма УФА OG-1820 для специфической лабораторной диагностики, иллюстрируется следующим примером.

Для заражения вирусом используют суспензию клеток VERO-E6. После вне- J5 сения вируссодержащей суспензии во флаконы с взвесью клеток их помещают в термостат при 37 С. Культивирование вируса ГЛПС в клетках осуществляют в течение 12-14 суток.

На 12-14 сутки с начала инфицирования клеток VERO-E6 вирусом ГЛПС , монослой клеток последовательно обрабатывают раствором трипсина и вер- сена, после чего проводят суспендиро- вание инфицированных клеток в неболь- шом количестве физиологического раствора. Конечная концентрация клеток должна состалять 300-400 тысяч в 1,0 мл.

Аналогичным образом готовят суспензию нормальных неинфицированных клеток VERO-E6. Суспензии инфицированных и нормальных клеток смеТииза- ют в равных объемах и раскапывают на предметные стекла по 3-5 мкл на каждый мазок. После полного высыхания суспензий препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 15- г- 20 мин и затем обрабатывают ультрафиолетовым облучением для инактива- ции инфекционной активности вируса. Приготовленные таким образочм антигенные препараты до использования хранят при - .

Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса ГЛПС. Сыворотки обследуют методом флуоресцирующих антител в разведениях 1:16 и выше. Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при . ,в течение 30 мин, и затем стекла трехкратно промывают 0,01 М фосфатным буферным раствором и :ушат при комнатной температуре. На препараты наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведении, которое оп-

30

35

0

0

5

. 513

ределяют в предварительном опыте, В качестве контрастера используют раст .вор Голубого Эвапса в конечной концентрации 1:10 000. Препараты вновь инкубируют во влажной камере при тем пературе в течение 30 мин, затем промывают их, высушивают и реги- .стрируют е помощью люминесцентного микроскопа

Для вируса ГЛПС характерна локали- эация флуоресцирующего антигена с четкой гранулярной структурой в цитоплазме клеток„ Яркое изумрудно-зеленое гранулярное свечение антигена ви руса ГЛПС просматривают на фоне кир- пичного окрашивания структуры нормальных неинфицированных клеток. -Такой же .кирпично-красный фон отмечают и на мазках с нормальной сывороткой, используемой в качестве контроля.

Титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, способное егце выявлять специфический антиген вируса ГЛПСо Для постановки серологического диагнсза обследуют две сыворотки крови, от калодого больного. Первую сыворотку получают тотчас же после выявления заболевания, а вторую - через 3-5 дней после забора первой. Основанием для постановки лабораторного диагноза.служат результаты полученные с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА), указывающие на четы- рехкрат ное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках.

Результаты МФА представлены в таб- лице.

.Форм ула и

об р е т е .н и я

Штамм вируса геморрагической ли- хорадки с почечным си1гдромом 2-- го серотипа, ГКВ № 706 (Государственная коллекция вирусов Института виру- 700047 сологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР), ,рея) используемый для специфической лабо- i раторной диагностики. . .

Составитель М. Серова

Редактор М. КузнецоваТехред Л.ОлийныкКорректор М.Демчик

Ц- «т гУгтттгт,.иг----.--.- «.- «---.-«.-. -- ---

Заказ 2489Тираж 494Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.

Выявление антител к вирусу ГЛПС в сыворотках крови больных с помощью вирусного антигена штамма УФА CG- 1820 2-ого серотипа методом МФА

16 58

1:512

1:2048

1:16384

1837 (УФА)

1842 (УФА)

Ю 5

20

1865 (Устинов)

3

7

30

1:256 1:1024 1:4096

16

40

1:16

17

1:64

37

1:16

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа.Штамм УФА CG-1820 вируса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспензии легочной ткани рыжей - полевки, отловленной в природном очаге ГЛПС в г. Уфе, rta культуре клеток VERQ-E6. . Штамм-хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером ГКВ-706 и характеризуется следукщи- ми признаками. При электронно-микро скопическом изучении инфицированных клеток УЕЕО- Еб выявляются частицы округлой формы с диаметром около 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток VERO-E6 при 37°С, рН - 7,2-7,8, множественность заражения составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день заражения и составляет 3,0-6,0 log ИДу,,, . В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфические антитела к вирусу ГЛПС. Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стёкла с антисеном вируса УФА CG-18 0. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. 1 табл. Ф (У) с оэ со СП ел |ib