Способ определения неспецифической антибактериальной реактивности у детей Советский патент 1986 года по МПК G01N1/30 A61B10/00 

Изобретение относится к мед ицине, именно к педиатрии.

Целью изобретения является повыение точности способа за счет отутствия влияния загрязненности другими форменными элементами крови на конечный результат определения экзо- цитоза и отсутствие повреждения нейт- рофилов, вызываемого их очисткой.

Способ осуществляют следующим образом

При подозрении на нарушение ,экзо- цитоза нейтрофнлов у исследуемого из пальца в микропипетку набирают 0,2 мл крови и переносят в пробирку с 0,05 мл гепарина, предварительно разведенного до 100 ед./мп О,1 М сфатным буфером (рН-7,2), приготовленном на физиологическом растворе (ФБФ). Кро вь смешивают с гепарином и переносят по О,1 мл в две силиконированные пробирки. В одну добавляют 0,1 МП ФБФ - контрольная проба, в другую - 0,1 мл рпсонизи- рованного зимозана - опытная проба (стимулируют нейтрофилы). Заранее приготовленный замозан хранят при -20 С. Перед употреблением его о.псо- низируют пулом.свежей сьшоротки при 37°С 30 мин. Отмывают в ФБФ и доводят этим же буфером до концентрации 4 мг/мп. Обе пробы тщательно перемешивают и помещают |ia 1 ч в термостат при . Перемешивание повторяют через каждые 15 мин. После стимуляции нейтрофилов зимозаном из обеих проб готовят мазки крови, высушивают на воздухе, фиксируют 1 мин 5%-ным раствором сульфосалици- ловой кислоты. После фиксации тщательно промывают дистиллированно: водой и окрашивают 30 мин 0,1%-ным раствором примулина на 0,1М боратнрм буфере (ББ) - рН- 8,2. Затем мазки промывают в трех сменах ББ по 1 мин в- каждой, высушивают и помещают под иМмерсионшой объектив люминесцентно- гй микроскопа

Специфичноеtb окраски неферментных катионных белков (НКБ) в нейтро- филах выборочно контролдауют после обработки мазков 0,02%-«ьв 1 раствором трипсина на 0,05 М ВБ (рН-8,2) в течение 30 мин при ЗУ С. Исчезновение флюоресцирующих гранул после такой обработки подтверяодает специ чность окраски.

Подсчитывают по 100 нейтро4вшов в обоих мазках (из контрольной и опыт.1239549

10

IS

20

25

30

35

40

4S

М

SS

ной дер выч сре фил

ПИ

где нич ют фил час ные ней меж бам от мал аль нии в н ляю бак

9 ны Пе

но ри сш Со оп оп ро и му ко им но ни

со пр ко 0, в ны да вы ны ет СО со че Ре .ле

S

0

5

0

5

0

S

S

ной проб)j учитывают 4 степени содержания НКБ .и их отсутствие, затем вычисляют цитохимический индекс (ЦИ) - среднее содержание НКБ на один нёйтро- фил по формуле.

ПИ 1хБ-н2хВ+ЗхГ-+4хД

где А - отсутствие гранул, Б - единичные гранулы, В - гранулы занимают до половины цитоплазмы нейтро- фила, Г - гранулы занимают большую часть цитоплазмы, Л - плотноупакован- ные гранулы занимают всю датоплазму нейтрофила. Затем вычисляют разность между ЦИ контрольной и опытной пробами. Если она заключена в интервале от 0,45 до 1,31 ед. определяют нормальную н еспецифическую антибактери- альную реактивность, а при содержании экзоцированных катионных белков в нейтрофилах от 0,44 и ниже определяют сниженную неспецифическую антибактериальную реактивность,

П Р и М е р 1. Больной. Возраст. , 9 мес. Диагноз: острьй обструктив- ный броюдат, экссудативный диатез. Перинатальная гипоксия. Рахит I ст.

Из пальца берут 0,2 мл капиллярной крови, смешивают с 0,05 мл гепарина (100 ед./мл) и переносят в две сшшконированные пробирки по 0,1 мп Сопытная и контрольная пробы).В опытной пробе проводят стимуляцию опсонизированным зимозаном. Из контрольной и опытной проб готовят мазки и окрашивают О,1%-ньм раствором примулина. В 100 нейтрофилах обоих мазков (контрольного и опытного) под иммерсионным объективом лнаганесцент- ного микроскопа определяют содержание НКБ. .

После стимуляции количество НКБ составляет Т,85, и его уменьшение против содержания катионных белков в контрольной пробе (2,30) составляет 0,45 ед., т.е. функция экзоцитоза в данном случае не нарушена. Нормальный зкзоцитоз нейтрофилов сопровождается острым началом заболеваний, высокой лихорадкой, кардиореспиратор- ными расстройствами. В крови наблюдается лейкоцитоз без нейтрофилеза, СОЭ - 26. Лечение антибиотиками спо-в собствует быстрой нормализации клинических и лабора торных показателей. Ребенок выписан через 17 дней в удов- .летворительном состоянии.

Очевидно, нормальная функция экзо цитоза нейтрофилов способствовала . благоприятному течению заболевания.

П р и м е р 2. Больной. Возраст 6 мес. Диагноз: острый обструктивный бронхит. .

Из пальца берут 0,2 мл капиллярной крови, смешивают с 0,05 мл гепарина (100 ед./мл) и переносят в две силиконированные пробирки по 0,1 мл (опытная и контрольная пробы). В , опытной пробе проводят стимуляцию опсонизированным зимозаном. Из контрольной и опытной проб готовят мазки и окрашивают О,1%-ным раствором при- мулина. В 100 нейтрофилах обоих маз,- ков (контрольного и опытного) под иммерсионным объективом лнминесцен т- ного микроскопа определяют содержани НКБ.

После стимуляции количество НКТ составляет 1,37, и его уменьшение против содержания катионных белков в контрольной пробе (2,71) составляет f,31 ед., что является максималь- ным пограничньм показателем при изучении экзотоза Предлагаемым способом

На фоне высокого зкзоцитоза нейтрофилов заболевание протекает остро, с высокой лихорадкой, лейко- 4HTO3oMj нейтрофилезом, СОЭ - 28. Лечение антибиотиками в течение 7 дней приводит к полному выздоровлению на 10-е сутки после поступления. Высокая способность к экзоцитозу нейтро- филов этого больного, по-видимому, была важны фактором, который способствовал эффективной борьбе с бактериями в участках воспаления, быстро- му разрешению воспаления и выздрров- ;лению ребенка. .

Прим ер 3. Больной. Возраст 1 год 8 мес. Диагноз: затяжной бронхит, анемия.

Из пальца берут 0,2 мл капиллярной крови, смешивают с 0,05 мл гепарина (тор ед/мл) и переносят в две силиконированные пробирки по 0,1 мл (опытная и контрольная пробы). В опытной пробе проводят стимуляцию опсонизированным зимозаном. Из контрольной и опытной проб готовят йазки и окрашивают 0,1%-ным раствором при- мулина. В 100 нейтрофила:х обоих маз- ков (контрольного и опытного) под иммерсионным объективом лютганесцент- кого микроскопа определяют содержание НКБ.

После стимуляции НКБ- составляет

2,54 ед., и его уменьшение против содержания катионных белков в контрольной пробе (2,60) составляет 0,06 ед.

Функция экзоцитоза полностью нарушена. Практически отсутствует разница между содержанием НКБ в нейтрофилах контрольной пробы и после стимуляции известили инициатором экзоцитоза.

У этого больного заболевание началось остро, но затем перешло в затяжное течение после проведенного курса антибиотикотерапии. Через неделю после отмены антибиотиков вновь наблюдалось обострение с высокой лихорадкой, высоким СОЭ, лейкоцитозом № 14800, но нормалЬ|Ными показателями форйулы крови. Назначение антибиотиков вновь не привело к выздоровлению, а только к уменьшению клинических проявлений заболевания с сохранением диффузных изменений и легких. Отсутствие экзоцитоза нейтрофилов, очевидно, обусловило малую эффективность действия - нейтрофилов в воспалительных очагах против бактериальной флоры. IV П р и м е р 4. Больной возраст 10 мес. Диагноз: острый обструктив- ных бронхит.

Из пальца берут 0,2 мл капиллярн крови, смешивают с 0,05 мл гепарина (100 ед. /мл) и переносят в две сили конированныё пробирки по 0,1 мл (опытная и контрольная пробы).В опытной пробе проводят стимуляцию опсонизированным зимозаном. Из контрольной и опытной проб готовят мазки и окрашивают О,1%-ным раствором при- мулина. В 100 нейтрофилах обоих мазков (контрольного и опытного) под иммерсионным объективом лкиданесценТ- ногр микроскопа определяют содержание НКБ.

После стимуляции количество НКБ составляет 1,96, и его уменьшение против содержания катионных белков в контрольной пробе (2,58) составляет 0,62 ед. Экзоцитоз нейтрофилов у этого ребенка был близок к средним показателям, найденным у здоровых детей.

При этом заболевание протекает остро, с лейкоцитозом, нейтрофилезом, кардиореспираторным синдромом. Назначение антибиотиков, анальгетиков, антигистаминных препаратов приводит к быстрой нормализации клини-. ческих и лабораторш 1х показателей и выздоровлению.

По-видимому, нормальный экзоци- тоз нейтрофилов Способствовал благоприятному течению заболевания.

Диагностика нарушений защитных реакций организма ребенка предлагаемым способом по зволила в 86% случаев прогнозировать затяжное течение заболевания, в то время как при использовании извест|в 1Х способов не выше, чем в 60% случаев.

Формула ИЗО б р е т е ни

Способ определения неспецифической антибактериальной реактивности

Редактор В. Иванова .

Составитель М . Лозняк Техред И.Попович

Заказ 3387/41 Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,

детей путем исследования нейтроилов , их стимуляции опсони- зированным зимозаном, отл и. чающий с я тем, что, с целью.повышения точности способа, в нейтрофилах определяют содержание экзоцирован- ных катионшлх белков, при этом после стимуляции нейтрофилов зимозаном

готовят мазки и окрашивают их О,1%-ным раствором примулина, при содержании экзо1р1рованных катионных белков в нейтрофилах от 0,45 до 1,31 ед. определяют нормальную неспецифическую антибактериальную реактивность, а при содержании экзоциро- ванных катионных белков в нейтрофилах от 0,44.ед. и ниже определяют сниженную неспецифическую антибактериальную реактивность.

Корректор С. Черни

Изобретение относится к педиатрии. Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения содержания экзоцированных катион- ных белков. Берут из пальца 0,2 мл крови, смешивают с 0,05 мл гепарина