СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ИЗ РЕПЕЙНИЧКА АПТЕЧНОГО, ОБЛАДАЮЩЕГО ДИУРЕТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОМИКРОБНЫМ, АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2011 года по МПК A61K36/73 B01D11/02 A61P13/00 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способов получения лекарственного средства из растительного сырья. Одной из актуальных проблем медицинской науки и практического здравоохранения является профилактика и лечение заболеваний мочевыводящих путей, которые по распространенности занимают второе место после ОРЗ в России. Течение таких заболеваний часто имеет хронический характер и требует длительного применения лекарственных препаратов. Социальная значимость этой проблемы обусловлена широким распространением и тяжестью заболеваний. В связи с этим, поиск и разработка новых эффективных и безопасных лекарственных средств и субстанций из растительного сырья, обладающих малой токсичностью, является актуальной задачей.

Известен способ получения отвара толокнянки обыкновенной, применяющегося в качестве мочегонного средства (ГФ XI, вып.2, С.147-148).

Известен способ получения средства, обладающего диуретической активностью, характеризующийся тем, что измельченные до 5 мм корневища с корнями сабельника болотного экстрагируют при температуре 55-65°С 40-45%-ным этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагента 1:(10-15) трехкратно по 2,5 ч, далее извлечения объединяют, фильтруют, упаривают, очищают сепарированием и высушивают в вакуумной сушилке с последующим измельчением, при этом конечный продукт содержит не менее 35% суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин (Патент RU №2318531).

Известен способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью, включающий экстракцию растительного сырья - листьев земляники садовой, измельченного от 1,0 мм до 3,0 мм, методом дробной мацерации водой очищенной в соотношении сырье-экстрагент 1:10, в реакторе из нержавеющей стали с ложным дном вместимостью 100 л, снабженным якорной мешалкой, паровой рубашкой и гильзой для термометра, при времени настаивания 90 мин (трехкратное настаивание по 30 мин); объединение водных извлечений, фильтрацию, сепарирование, упаривание в циркуляционном вакуум-выпарном аппарате и высушивание на распылительной сушилке (патент RU №2342945).

Технической задачей предлагаемого изобретения является увеличение специфической активности и расширения спектра действия предлагаемого средства из травы репейничка аптечного.

Поставленная задача достигается способом получения средства из репейничка аптечного, который заключается в следующем:

Измельченную траву репейничка аптечного, собранную в фазе цветения, просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм, и измельченное лекарственное растительное сырье заливают водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения, в соответствующей емкости и настаивают на кипящей водяной бане при частом помешивании при соотношении сырье-экстрагент 1:(5-8) в течение 15 мин с добавлением твина 80 в количестве 0,3%. После чего выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят водой до первоначального объема и вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема, упаривают до получения сухого остатка.

Пример конкретного выполнения №1.

100 г измельченной травы репейника аптечного просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм и заливают водой при соотношении сырье-экстрагент 1:5 и с учетом коэффициента водопоглощения 650 мл воды, с добавлением 1,95 мл твина 80, настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при частом перемешивании.

Снимают, выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят до первоначального объема, затем вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема и упаривают до получения сухого остатка.

Пример конкретного выполнения №2

200 г измельченной травы репейника аптечного просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм и заливают 1560 мл воды при соотношении (1:6) с коэффициентом водопоглощения 1,3, с добавлением 4,68 мл твина 80, настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при частом перемешивании.

Снимают, выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят до первоначального объема, затем вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема и упаривают до получения сухого остатка.

После проведения цианидовой реакции извлечение приобретало оранжево-красное окрашивание с 5% раствором алюминия хлоридом, имело желто-зеленую флуоресценцию в УФ свете при длине волны 356 нм.

Анализ на содержание флавоноидов

Качественное обнаружение

К 0,5 мл раствора субстанции (раствор А), полученного для количественного определения, прибавляют 1 мл 5%-ного спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желтое окрашивание.

Ультрафиолетовый спектр раствора Б, приготовленного для количественного определения, в области от 380 до 450 нм имеет максимум поглощения при длине волны 405±2 нм (см. чертеж).

Количественное определение флавоноидов

Около 0,15 г (точная навеска) сухого экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 25 мл воды очищенной (70°С), доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).

2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 5%-ного спиртового раствора алюминия хлорида, 1 мл 3%-ной уксусной кислоты и доводят 70%-ным спиртом до метки (раствор Б).

Измеряют оптическую плотность раствора Б через 30 минут с помощью спектрофотометра при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А и 1 мл 3%-ной уксусной кислоты, доведенных до метки 70%-ным спиртом в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора, содержащего 1 мл 0,05%-ного раствора рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

В качестве раствора сравнения при этом используют 1 мл 0,05%-ного раствора рутина и 1 мл 3%-ной уксусной кислоты, доведенных до метки 70%-ным спиртом в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

;

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца рутина;

m₀ - точная масса рутина, взятого для приготовления раствора рабочего стандартного образца, г;

m - точная масса препарата, г;

W - потеря в массе при высушивании субстанции, %.

Найдено 5,62±0,13%.

В качестве оптимального экстрагента мы выбрали воду, так как в нее лучше переходят окисляемые вещества, кислота аскорбиновая и другие водорастворимые компоненты (гликозиды флавоноидов, полисахариды, микроэлементы, аминокислоты).

Определение фармакологической активности предлагаемого средства проводилось на белых беспородных крысах-самцах средней массой 170 г. Экстракт вводили однократно подкожно в дозе 20,0 мг/кг массы, а контрольным животным - физиологический раствор в соответствующем объеме (1,0 мл) предварительно, голодавшим до этого в течение 6 часов животным, давали через зонд 5% водную нагрузку. Крыс помещали в камеры с мочеприемниками. Мочу собирали в градуированные пробирки в течение 5 часов. Результаты эксперимента статистически обработаны и представлены в таблице.

В контрольной группе максимум интенсивности диуреза приходился на первые два часа опыта. В дальнейшем он резко снижался и конечный объем мочи за весь срок наблюдения составлял 78% всей водной нагрузки (8,5 мл). В экспериментальной группе диурез был выше во все сроки наблюдения, а конечный объем мочи 12,9 мл почти в два раза превышал величину контрольного показателя.

В контрольной группе максимум интенсивности диуреза приходился на первые два часа. В дальнейшем он резко снижался и конечный объем мочи за весь срок наблюдения составил 78% всей водной нагрузки (8,5 мл).

В экспериментальной группе диурез был выше во все сроки наблюдения, а конечный объем мочи почти в два раза превышал величину контрольного показателя. По сравнению с прототипом объем мочи предлагаемого средства увеличивался. (Табл.1)

Антиоксидантную активность определяли следующим образом:

В склянку с притертой пробкой объемом 200 мл вносили реакционную смесь следующего состава: 2 мл 1% раствора Твина 80; 0,2 мл 1 мМ раствора сульфата железа; 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 0,2 мл 1% раствора изучаемого объекта с конечным содержанием суммы веществ в пробе - 3 мг.

Смесь тщательно перемешивали, герметично закрывали крышкой и ставили в термостат при 40°С на 48 часов до максимального накопления продукта пероксидации - малонового диальдегината в инкубационной смеси. Затем реакционную смесь встряхивали и добавляли 1 мл 40% раствора ТХУ, смесь встряхивали вновь и выдерживали в течение 0,5 часа. После этого инкубат переносили в пробирки и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. Брали 2 мл центрифугата, добавляли 2 мл 0,25% раствора кислоты тиобарбитуровой, встряхивали и выдерживали при 100°С 15 мин, затем охлаждали и фотометрировали окрашенный в розовый цвет комплекс при 532 нм против контрольной пробы. В контрольных пробах вместо суммы веществ добавляли 0,2 мл воды.

Полученные данные при n=12 в каждом опыте обрабатывали статистически. Антиоксидантную активность в экспериментальных пробах оценивали по убыли МДА в процентах от контроля.

Результаты приведены в таблице №2

Противомикробное действие средства в жидкой питательной среде МПБ методом серийных разведений с последующим высевом на твердые селективные среды. Проявление противомикробной активности считают при полном отсутствии роста бактерий. Бактерицидная нагрузка составляла 250000 микробных тел в 1 мл.

Полное подавление роста золотистого стафилококка, синегнойной палочки и протея наблюдают у средства в чистом виде (таблица №3).

Острую токсичность суммы веществ исследовали на белых крысах-самцах линии Вистар со средней массой 170 г.

Водный раствор субстанции вводили животным внутрибрюшинно в дозах 500, 1000, 1500, 30000 и 60000 мг/кг по одной дозе в группе из 8 особей. За весь срок наблюдения у них отмечалось изменение в поведении, потребление корма и воды, реакции на различные раздражители.

Мышечный тонус и координация движений сохранены в полном объеме. Состояние волосяного, кожного покрова слизистых находилось в пределах нормы. Частота и глубина дыхания не изменялась.

Из за отсутствия гибели животных при максимально высокой дозе введения исследуемой субстанции сумма веществ из водного отвара травы репейничка аптечного относится к категории токсичности VI - относительно безвредных веществ.

Таким образом, предлагаемый способ получения по сравнению с известным позволяет получить препарат с увеличенной диуретической активностью и расширенным спектром действия

Таблица №1 Влияние суммы веществ из репейничка аптечного на диурез у крыс. Исследуемое вещество, группы крыс Количество мочи за 1 час(в мл) Количество мочи за 2 часа (в мл) Количество мочи за 3 часа Количество мочи за 4 часа (в мл) Количество мочи за 5 час(в мл) Общее количество мочи за 5 часов (в мл) контроль 2,6±0,5 2,0±0,3 0,9±0,2 0,6±0,07 0,5±0,04 6,6±0,2 Сумма веществ репейничка аптечного (20 мг/кг) 4,8±0,3 4,1±0,2 1,9±0,1 1,3±0,2 0,8±0,05 12,9±0,17 Прототип (20 мг/кг) 2,9±0,1 3,0±0,03 0,8±0,05 0,75±0,04 0,6±0,1 8,05±0,2

Таблица №2 Влияние суммы веществ из травы репейничка аптечного и эмоксипина на процесс пероксидации in vitro Исследуемые объекты Показатель экстинкции М±м % подавления пероксидации к контролю Контроль 0,36±0,004 100% Эмоксипин (3 мг/проба) 0,082±0,003 77,2% Сумма веществ из репейничка аптечного (3 мг/проба) 0,070±0,002 80,8% Р<0,05 во всех опытах к контролю

Таблица №3 Противомикробные свойства отвара из репейничка аптечного. Соотношение сырья и экстрагента в отваре Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Отвар 1:5 С С С Отвар 1:6 С С С Отвар 1:7 С С С Отвар 1:8 С К К С - стерильно К - колония

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающему диуретическим, антибактериальным и антиоксидантным действием из растительного сырья. Способ получения средства, обладающего диуретическим, антибактериальным и антиоксидантным действием, в котором измельченную траву репейника аптечного, собранную в фазе цветения, заливают водой, настаивают на кипящей водяной бане при определенных условиях, выдерживают, фильтруют, доводят водой до первоначального объема и вторично настаивают на кипящей водяной бане, охлаждают, доводят до первоначального объема, упаривают до получения сухого остатка. Средство, полученное заявленным способом, обладает повышенной активностью. 3 табл.

Способ получения средства, обладающего диуретическим, антибактериальным и антиоксидантным действием, характеризующийся тем, что измельченную траву репейника аптечного, собранную в фазе цветения, заливают водой, настаивают на кипящей водяной бане при частом помешивании при соотношении сырье-экстрагент 1:(5-8) в течение 15 мин с добавлением твина 80 в количестве 0,3%, выдерживают 6-8 ч, фильтруют, доводят водой до первоначального объема и вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема, упаривают до получения сухого остатка.