НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ОБРАЗЦА И СПОСОБ АНАЛИЗА ОБРАЗЦА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 G01N21/64 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к набору реагентов и к способу анализа клеток крови в биологическом образце.

Уровень техники

В области лабораторных тестов анализ компонентов крови в образцах является очень важным, когда диагностируются различные заболевания циркуляторных органов или чего-либо подобного у субъектов. В зависимости от типа заболеваний количество конкретных клеток крови может увеличиваться или уменьшаться или клетки крови, которые обычно не существуют в ней, появляются в периферической крови в некоторых случаях.

В последнее время на рынке появились различные автоматические счетчики клеток крови, в которых применяются принципы проточной цитометрии. При использовании таких автоматических счетчиков клеток крови клетки крови в образцах могут автоматически классифицироваться и подсчитываться.

Обычно лейкоциты могут классифицироваться как пять видов: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Среди них количество базофилов, содержащихся в образцах крови, является малым. По этой причине точность классификации может быть улучшена посредством измерения базофилов в образцах крови с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к измерению базофилов, по сравнению с измерением базофилов с помощью способа, в котором лейкоциты классифицируются как пять видов и базофилы измеряют за одно измерение. Базофилы имеют специфичную характеристику, такую, что они меньше повреждаются при кислотных условиях по сравнению с другими типами лейкоцитов. Дискриминация базофилов от других типов лейкоцитов с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к базофилам, посредством использования таких характеристик описана в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии № SHO 61(1986)-88896 (патентный документ 1) и нерассмотренной заявки на патент Японии № HEI 7(1995)-294518 (патентный документ 2).

Возникновение нуклеированных эритроцитов иногда вызывает проблемы при измерении лейкоцитов. Нуклеированные эритроциты имеют ядра. При измерении лейкоцитов, даже когда эритроциты обрабатывают с целью лизирования, ядра нуклеированных эритроцитов по-прежнему вызывают сигнал, сходный с лейкоцитами, давая ложную положительную ошибку при измерении количества лейкоцитов. Для устранения этого эффекта и получения точного количества лейкоцитов образец крови обрабатывают с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к нуклеированным эритроцитам, для измерения количества нуклеированных эритроцитов, количество лейкоцитов в том же образце крови измеряют с помощью другого способа, а затем количество нуклеированных эритроцитов вычитают из полученного количества лейкоцитов. Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии № HEI 10(1998)-339729 (патентный документ 3) описывает дискриминацию нуклеированных эритроцитов от лейкоцитов посредством применения обработки, эксклюзивной по отношению к нуклеированным эритроцитам, к образцам крови.

Однако необходимость обработки, эксклюзивной по отношению к соответствующим клеткам крови, как описано в указанных выше патентных документах 1-3, для классификации базофилов или нуклеированных эритроцитов требует длительного времени и, кроме того, усложняет измерительное устройство или увеличивает его размеры. В дополнение к этому, использование множества реагентов, эксклюзивных по отношению к соответствующим клеткам крови, делает слишком высокой стоимость исследования крови в целом. Соответственно, является предпочтительным, чтобы обработки, эксклюзивной по отношению к клеткам крови, было настолько мало, насколько это возможно.

Как базофилы, так и нуклеированные эритроциты могут измеряться посредством обработки образцов крови при кислотных условиях. По этой причине имеется возможность того, что как базофилы, так и нуклеированные эритроциты смогут измеряться за одно измерение, когда образец крови обрабатывают при кислотных условиях. Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии № 2002-148261 (патентный документ 4) описывает, что базофилы и эритробласты (нуклеированные эритроциты) могут измеряться посредством смешивания образца с водным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество и агент для лизирования эритроцитов, что позволяет лейкоцитам и аномальным клеткам находиться в состоянии, пригодном для окрашивания, с добавлением окрашивающего агента, содержащего флуоресцентный краситель, для окрашивания клеток и измерения интенсивности флуоресценции и интенсивности рассеянного света с помощью проточного цитометра.

Описание изобретения

Проблемы, которые решает изобретение

Однако при использовании способа, описанного в патентном документе 4, базофилы не отделяются должным образом от лейкоцитов, иных чем базофилы, в особенности в образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, в некоторых случаях.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание набора реагентов и способа измерения образца, которые позволяют подсчет и более четкую дискриминацию нуклеированных эритроцитов и базофилов от других типов лейкоцитов в образце.

Средства решения проблем

Настоящее изобретение представляет собой набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов и/или нуклеированных эритроцитов в образце, содержащий

первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, которая может лизировать эритроциты и повреждать клеточную мембрану лейкоцитов, так что флуоресцентный краситель может проникать через нее, и

второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту.

Кроме того, настоящее изобретение представляет собой способ анализа образца, включающий следующие стадии:

лизирования эритроцитов в образце и повреждения клеточной мембраны клеток крови, с тем чтобы флуоресцентный краситель мог проникать через нее, посредством указанного выше первого реагента, и окрашивания поврежденных клеток посредством указанного выше второго реагента,

приложения света к окрашенным клеткам с получением информации от рассеянного света и информации от флуоресценции и

классификации и подсчета базофилов и/или нуклеированных эритроцитов в образце на основе информации от рассеянного света и информации от флуоресценции.

Результат изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, нуклеированные эритроциты и базофилы могут дискриминироваться более четко от других клеток крови и могут подсчитываться даже в образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, что делает возможными более точные исследования и диагностику заболеваний. Хотя настоящее изобретение делает возможным подсчет нуклеированных эритроцитов и базофилов за одно измерение, в некоторых случаях может оказаться достаточным измерение любого объекта из нуклеированных эритроцитов и базофилов, в зависимости от цели исследования. В таком случае настоящее изобретение также позволяет проводить такие измерения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой схематическую форму диаграммы рассеяния, когда образец анализируют с использованием реагента для анализа образца по настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет собой схематическую форму диаграммы рассеяния, когда образец анализируют с использованием реагента для анализа образца по настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 1.

Фиг.4 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 1.

Фиг.5 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 2.

Фиг.6 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 2.

Фиг.7 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.8 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.9 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.10 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.11 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.12 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.13 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.14 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.15 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.16 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.17 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.18 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.19 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.20 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.21 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 7.

Фиг.22 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 7.

Фиг.23 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 8.

Фиг.24 показывает вид примерного набора реагентов по настоящему изобретению. A: второй реагент и B: первый реагент.

Фиг.25 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 9.

Фиг.26 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 9.

Фиг.27 показывает графики, представляющие корреляцию между результатами анализа образца с использованием реагентов для анализа образца из примера 9 и результатами анализа образца с использованием обычного способа анализа образца. (A) Корреляция количества лейкоцитов в целом; (B) корреляция отношения базофилов и (C) корреляция отношения нуклеированных эритроцитов.

Наилучший способ осуществления изобретения

Базофилы представляют собой один из видов лейкоцитов и имеют большие кислотные гранулы, которые окрашиваются основными красителями. Нуклеированные эритроциты также обычно называют эритробластами, и они включают в себя проэритробласты, базофильные эритробласты, полихроматофильные эритробласты и ортохроматофильные эритробласты.

Как используется в настоящем документе, "образец" относится к образцу жидкости, отобранной из организма у млекопитающих, предпочтительно у людей включая кровь, спинномозговую жидкость, мочу, образец, отобранный при аферезе, и тому подобное.

Авторы настоящего изобретения, в результате обширных исследований, обнаружили, что нуклеированные эритроциты и базофилы могут более четко дискриминироваться от других типов лейкоцитов посредством использования первого реагента, содержащего катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, и второго реагента, содержащего флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, набор реагентов для анализа образца представляет собой набор реагентов, содержащий первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, и второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Посредством обработки образца первым реагентом, содержащим катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, эритроциты в образце могут лизироваться, и клеточные мембраны лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов могут повреждаться до такой степени, что флуоресцентный краситель может проникать через мембраны. Благодаря этому лейкоциты, иные чем базофилы, и нуклеированные эритроциты повреждаются на клеточных мембранах и сморщиваются или генерируют голые ядра, в то время как базофилы меньше повреждаются на клеточных мембранах, чем лейкоциты, иные чем базофилы, и нуклеированные эритроциты. По этой причине считается, что базофилы сморщиваются меньше по сравнению с лейкоцитами, иными чем базофилы, и нуклеированными эритроцитами. Соответственно, базофилы могут дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и нуклеированных эритроцитов на основе различий в размере или форме клеток. Кроме того, посредством обработки образца вторым реагентом, содержащим флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту, нуклеированные эритроциты могут дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и базофилов на основе различий в свойствах окрашивания флуоресцентным красителем.

Катионное поверхностно-активное вещество может лизировать эритроциты и повреждать клеточные мембраны лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Катионное поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой тип соли четвертичного аммония или соли пиридиния. Катионное поверхностно-активное вещество типа соли четвертичного аммония предпочтительно представляет собой соль четвертичного аммония, имеющую следующую общую формулу (III):

В указанной выше формуле (III) R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ могут быть одинаковыми или различными и представляют собой атом водорода, C_1-8 алкильную группу или C_6-8 аралкильную группу. R¹⁶ представляет собой C_8-18 алкильную группу, C_8-18 алкенильную группу или C_6-18 аралкильную группу. X^- представляет собой анион.

C_1-8 алкильная группа для R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ включает в себя метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил и тому подобное. C_6-8 аралкильная группа для R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ включает в себя бензил, фенэтил и тому подобное. Предпочтительно, R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ представляют собой C_1-8 алкильную группу, такую как метил, этил и тому подобное.

C_8-18 алкильная группа для R¹⁶ включает в себя октил, децил, додецил, тетрадецил и тому подобное. C_8-18 алкенильная группа для R¹⁶ включает в себя октенил, деценил, олеил и тому подобное. C_6-18 аралкильная группа для R¹⁶ включает в себя бензил, фенэтил и тому подобное. Предпочтительно, R¹⁶ представляет собой C_10-18 алкильную группу с прямой цепью, такую как децил, додецил, тетрадецил и тому подобное.

Анион X^- включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^- и I^-, CF₃SO₃-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Катионное поверхностно-активное вещество типа соли пиридиния предпочтительно представляет собой соль пиридиния, имеющую следующую формулу (IV):

В указанной выше формуле (IV) R¹⁷ представляет собой C_8-18 алкильную группу. X^- представляет собой анион.

C_8-18 алкильная группа включает в себя C_10-18 алкильную группу с прямой цепью, такую как децил, додецил, тетрадецил и тому подобное. Анион X^- включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^- и I^-, CF₃SO₃ ^-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Конкретные примеры катионного поверхностно-активного вещества включают в себя децилтриметиламмоний бромид, додецилтриметиламмоний хлорид, октилтриметиламмоний бромид, октилтриметиламмоний хлорид, лаурилтриметиламмоний бромид, лаурилтриметиламмоний хлорид, миристилтриметиламмоний бромид, миристилтриметиламмоний хлорид, лаурилпиридиний хлорид и тому подобное.

Катионное поверхностно-активное вещество используют при концентрации, которая является достаточной для лизирования эритроцитов и повреждения клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Такая предпочтительная концентрация может легко определяться, например, с помощью наблюдения состояния клеточных мембран или чего-либо подобного под обычным оптическим микроскопом. Конкретно, концентрация катионного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 300 до 9000 мг/л, более предпочтительно от 400 до 8000 мг/л, а наиболее предпочтительно от 500 до 7000 мг/л. Однако концентрация может регулироваться соответствующим образом в соответствии с типом используемого катионного поверхностно-активного вещества.

Когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, точная дискриминация между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Причиной этого считается то, что лейкоциты не повреждаются в достаточной степени, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, так что различие по размеру или форме между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, является маленьким. С другой стороны, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Причиной этого считается то, что клеточные мембраны, в частности, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов, иных чем базофилы, чрезмерно повреждаются, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, так что точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, является невозможной. Соответственно, когда концентрация находится в указанном выше диапазоне, эритроциты могут эффективно лизироваться без чрезмерного повреждения клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Способность к гемолизу для катионного поверхностно-активного вещества зависит от длины основной цепи. Катионные поверхностно-активные вещества, имеющие длинную основную цепь, имеют большую способность к гемолизу, обеспечивая, таким образом, достаточное воздействие при меньшем количестве по сравнению с теми, которые имеют короткую цепь.

В образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, клетки крови, такие как лейкоциты, склонны к повреждениям из-за их морфологических изменений. Когда для такого образца используют катионное поверхностно-активное вещество, клеточные мембраны, в частности, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов, иных чем базофилы, чрезмерно повреждаются, так что точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях является невозможной. В таких случаях использование неионного поверхностно-активного вещества вместе с катионным поверхностно-активным веществом позволяет более точную дискриминацию между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, посредством подавления чрезмерного повреждения лейкоцитов и тому подобное. Неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой простой полиоксиэтиленалкиловый эфир, простой полиоксиэтиленполиоксипропиленалкиловый эфир, полиоксиэтиленкасторовое масло, гидрированное полиоксиэтиленкасторовое масло, полиоксиэтиленстерин или гидрированный полиоксиэтиленстерин.

Неионное поверхностно-активное вещество типа простого полиоксиэтиленалкилового эфира предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (V):

R ¹⁸ -O-(CH ₂ CH ₂ O) _n -H (V)

В указанной выше формуле R¹⁸ представляет собой C_12-22 алкильную группу или C_12-22 алкенильную группу. n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа простого полиоксиэтиленполиоксипропиленалкилового эфира предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VI):

В указанной выше формуле R¹⁹ представляет собой C_10-30 алкильную группу или C-алкенильную группу. m равно 1-10. n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа полиоксиэтиленкасторового масла предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VII):

В указанной выше формуле сумма k, n, m, x, y и z равна 10-60.

Неионное поверхностно-активное вещество типа гидрированного полиоксиэтиленкасторового масла предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VIII):

В указанной выше формуле сумма k, n, m, x, y и z равна 10- 60.

Неионное поверхностно-активное вещество типа полиоксиэтиленстерина предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (IX):

В указанной выше формуле n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа гидрированного полиоксиэтиленстерина предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (X) или (XI):

где n равно 20-30;

где n рано 20-30;

C_12-22 алкильная группа включает в себя додецил, гексадецил и подобные группы. C_12-22 алкенильная группа включает в себя олеил и подобные группы. Когда n в указанных выше формулах (V), (VI) и (IX)-(XI) является слишком малым, мембраны клеток крови чрезмерно повреждаются, а когда n является слишком большим, мембраны клеток крови не повреждаются в достаточной степени. Подобным же образом, когда сумма k, n, m, x, y и z в указанных выше формулах (VII) и (VIII) является слишком малой, мембраны клеток крови чрезмерно повреждаются, а когда она является слишком большой, мембраны клеток крови не повреждаются в достаточной степени.

Неионное поверхностно-активное вещество конкретно включает в себя простой полиоксиэтилен(16) олеиловый эфир, простой полиоксиэтилен(20) цетиловый эфир, простой полиоксиэтилен(20) полиоксипропилен(8) цетиловый эфир, простой полиоксиэтилен(30) полиоксипропилен(6) децилтетрадециловый эфир, полиоксиэтилен(20) касторовое масло, гидрированное полиоксиэтилен(20) касторовое масло, гидрированное полиоксиэтилен(50) касторовое масло, полиоксиэтилен(25) фитостанол и тому подобное. Среди них особенно предпочтительными являются простой полиоксиэтилен(16) олеиловый эфир и простой полиоксиэтилен(20) полиоксипропилен(8) цетиловый эфир.

Концентрация неионного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 500 до 7000 мг/л, более предпочтительно от 800 до 6000 мг/л, а наиболее предпочтительно от 1000 до 5000 мг/л. Однако концентрация может регулироваться соответствующим образом в соответствии с типом используемого неионного поверхностно-активного вещества.

Когда концентрация неионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, точная дискриминация, в частности, между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной, поскольку чрезмерное повреждение клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов с помощью катионного поверхностно-активного вещества не может быть подавлено. С другой стороны, когда концентрация неионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, точная дискриминация, в частности, между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, может быть невозможной в некоторых случаях, поскольку повреждение с помощью катионного поверхностно-активного вещества клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов подавляется. Соответственно, когда концентрация находится в указанном выше диапазоне, нуклеированные эритроциты и лейкоциты, иные чем базофилы, могут точно дискриминироваться, даже для образца крови, для которого прошло некоторое время после его сбора.

Первый реагент предпочтительно содержит, по меньшей мере, одну карбоновую кислоту, имеющую, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо в молекуле (далее упоминается в настоящем документе как "ароматическая карбоновая кислота") или ее соль. Посредством использования ароматической карбоновой кислоты эритроциты могут эффективно лизироваться за короткое время.

Когда при измерениях используют первый реагент без ароматической карбоновой кислоты, в некоторых случаях базофилы детектируются в слишком высоких количествах, в зависимости от образцов крови. Причина для этого слишком высокого значения неизвестна, однако можно предположить, что клетки крови, иные чем базофилы, или другие компоненты в образцах крови имеют размер, форму или интенсивность флуоресценции, сходную с базофилами. Посредством исследования образцов крови с помощью первого реагента, содержащего ароматическую карбоновую кислоту, такие явления слишком высокого значения могут предотвращаться.

Используемая ароматическая карбоновая кислота произвольным образом выбирается из органических кислот, имеющих, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо в молекуле, или их солей. Предпочтительная ароматическая карбоновая кислота включает в себя салициловую кислоту, фталевую кислоту, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту, аминобензойную кислоту и их соли.

Концентрация ароматической карбоновой кислоты или ее соли в первом реагенте не является конкретно ограниченной, пока pH первого реагента находится в пределах, описанных ниже, и предпочтительно составляет от 0,1 до 100 мМ, а более предпочтительно от 0,5 до 50 мМ.

Когда концентрация ароматической карбоновой кислоты является слишком низкой, точная дискриминация базофилов может быть невозможной, поскольку указанное выше воздействие не прикладывается в достаточной степени. С другой стороны, когда концентрация ароматической карбоновой кислоты является слишком высокой, точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Соответственно, когда концентрация находится в указанных выше диапазонах, нуклеированные эритроциты и базофилы точно дискриминируются от других клеток крови.

Когда образец обрабатывают первым реагентом, эритроциты предпочтительно лизируются, что мешает измерению нуклеированных эритроцитов и базофилов. Как правило, клеточные мембраны эритроцитов прорываются при осмотическом давлении примерно 150 мОсм/кг или ниже и становятся оптически прозрачными после утечки гемоглобина из внутреннего пространства эритроцитов (гемолиза). Оптически прозрачные эритроциты существенно не мешают измерению с использованием проточной цитометрии. Условия с низким осмотическим давлением и низким pH являются предпочтительными для лизиса эритроцитов. Осмотическое давление, удовлетворяющее двум этим требованиям, составляет от 20 мОсм/кг до 150 мОсм/кг. При установлении осмотического давления первого реагента в этом диапазоне эритроциты могут эффективно лизироваться, что мешает измерению нуклеированных эритроцитов и базофилов.

Базофилы имеют ту характеристику, что их трудно разрушить по сравнению с другими лейкоцитами при кислотных условиях. Соответственно, pH первого реагента предпочтительно составляет от 2,0 до 4,5, более предпочтительно от 2,0 до 3,5. В этом диапазоне pH гранулы базофилов являются стабильными. В дополнение к этому в этом диапазоне pH эритроциты могут эффективно лизироваться без чрезмерного влияния на лейкоциты, нуклеированные эритроциты и тому подобное. Благодаря этому рассеяние света и флюоресценция от эритроцитов без ядра может быть низкой, так что эритроциты по существу не влияют на измерения нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов.

pH первого реагента может устанавливаться с помощью буферного агента. Предпочтительный буферный агент представляет собой такой буферный агент, который имеет pKa в пределах ±2,0 от желаемого pH и включает в себя, например, яблочную кислоту, винную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, дигликолевую кислоту и тому подобное. Концентрация буферного агента в первом реагенте не является конкретно ограниченной, постольку поскольку может поддерживаться указанный выше диапазон значений pH.

Кроме того, удобно объединять ароматическую карбоновую кислоту и буферный агент, поскольку могут быть улучшены рабочие характеристики дискриминации нуклеированных эритроцитов. Сочетание буферного агента и ароматической карбоновой кислоты включает в себя, например, яблочную кислоту и салициловую кислоту или ее соль, яблочную кислоту и фталевую кислоту или ее соль, лимонную кислоту и салициловую кислоту или ее соль, лимонную кислоту и фталевую кислоту или ее соль, яблочную кислоту и бензойную кислоту или ее соль, яблочную кислоту и фталевую кислоту или ее соль и бензойную кислоту или ее соль.

Для установления осмотического давления первого реагента в пределах, пригодных для лизирования эритроцитов, может использоваться электролит, такой как NaCl, KCl или сахарид. Осмотическое давление может также устанавливаться с помощью концентрации буферного агента.

Первый реагент может быть получен посредством растворения поверхностно-активных веществ и ароматической карбоновой кислоты или ее соли, а также необязательного буферного агента в соответствующем растворителе, так что могут быть получены указанные выше концентрации, и необязательного установления pH с помощью NaOH, HCl или чего-либо подобного. Соответствующий растворитель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может растворять указанные выше компоненты и включает в себя, например, воду, органические растворители, их смеси и тому подобное. Органические растворители включают в себя спирты, этиленгликоль и диметилсульфоксид (далее упоминаемый как "ДМСО").

Второй реагент содержит флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Когда клетки крови, обработанные первым реагентом, окрашиваются флуоресцентным красителем, способным окрашивать нуклеиновую кислоту, лейкоциты интенсивно окрашиваются и испускают интенсивную флюоресценцию. С другой стороны, нуклеированные эритроциты слабо окрашиваются и испускают слабую флюоресценцию. Благодаря различию в склонности к окрашиванию флуоресцентным красителем нуклеированные эритроциты могут дискриминироваться от базофилов или лейкоцитов, иных чем базофилы. Механизм получения различий в интенсивности флуоресценции между лейкоцитами и нуклеированными эритроцитами не выяснен, однако это может происходить потому, что инкорпорирование красителя в ядро клетки ингибируется из-за конденсации ядра (ДНК) нуклеированных эритроцитов.

Флуоресцентный краситель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может окрашивать нуклеиновую кислоту, и включает в себя красители, которые обычно используют в данной области. Флуоресцентный краситель, содержащийся во втором реагенте, включает в себя флуоресцентные красители следующих формул (I) и (II):

где R¹ и R² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу;

R³, R⁴, R⁵ и R⁶ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или алкильную группу; и X^- представляет собой анион;

где R⁷ и R⁸ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу, необязательно содержащую кислотную группу;

и R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или кислотную группу, при условии что любой из R⁷-R¹² представляет собой/имеет кислотную группу; и кислотная группа, которая может присутствовать в R⁷-R¹², может образовывать соль, при условии что любая из кислотных групп, которые могут присутствовать в R⁷-R¹², представляет собой группу, из которой высвобождается протон.

В настоящем описании алкильная группа в указанных выше формулах (I) и (II) может иметь либо прямую цепь, либо разветвленную цепь. Количество атомов углерода в алкильной группе, как правило, составляет 1-20, а предпочтительно 1-10. Более предпочтительно, с точки зрения растворимости в воде флуоресцентного красителя оно равно 1-6. Предпочтительные примеры алкильной группы включают в себя метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил и тому подобное.

X^- в формуле (I) включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^-- и I^-, CF₃SO₃ ^-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Как используется в настоящем описании, кислотная группа, которая может присутствовать в формуле (II), включает в себя как группу, способную к высвобождению протона, так и группу, способную к высвобождению группы, из которой высвобождается протон. Группа, способная к высвобождению протона, включает в себя карбоксильную, сульфоновую, фосфорную или сходную группу, а предпочтительно представляет собой сульфоновую группу.

Кислотная группа может образовывать соль. Соль включает в себя соль щелочных металлов, таких как натрий, калий или сходную соль. Предпочтительной является соль натрия.

Используемый флуоресцентный краситель формул (I) и (II) может принадлежать к одному или нескольким видам. Флуоресцентный краситель может быть получен от Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.

Концентрация красителя в реагенте для анализа образца по настоящему изобретению может выбираться соответствующим образом в соответствии с типом красителя и, как правило, составляет от 0,01 до 100 мг/л, предпочтительно от 0,1 до 10 мг/л, а более предпочтительно от 0,2 до 6,0 мг/л.

Флуоресцентный краситель формул (I) и (II), содержащийся во втором реагенте, интенсивно окрашивает лейкоциты, поскольку он имеет более высокое сродство по отношению к лейкоцитам, чем к нуклеированным эритроцитам. Соответственно, на основе различий во флюоресценции, испускаемой клетками, окрашенными флуоресцентным красителем, нуклеированные эритроциты могут более точно дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и от базофилов.

Второй реагент может быть получен посредством растворения флуоресцентного красителя в соответствующем растворителе, так что может быть получена указанная выше концентрация. Соответствующий растворитель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может растворять флуоресцентный краситель, и включает в себя воду, органические растворители, их смесь и тому подобное. Органические растворители включают в себя спирты, этиленгликоль, ДМСО и тому подобное. Некоторые флуоресцентные красители имеют низкую долговременную стабильность в водных растворах, и в таких случаях они предпочтительно растворяются в органических растворителях.

Набор реагентов для анализа образца предпочтительно смешивается с образцом в таком количестве, что получают объемное отношение первый реагент:второй реагент:образец от 10:500:1 до 10:10:1, более предпочтительно от 20:100:2 до 20:5:1. При использовании такого отношения для смешивания первого реагента, второго реагента и образца с получением образца для измерений эритроциты благополучно лизируются и компоненты клеток крови окрашиваются удовлетворительно. Количество образца от нескольких микролитров до 100 мкл делает возможными благополучные измерения.

Способ анализа образца в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя следующие стадии:

лизирования эритроцитов в образце и повреждения клеточных мембран клеток крови, с тем чтобы флуоресцентный краситель мог проникать через них под действием указанного выше первого реагента, и окрашивания поврежденных клеток крови посредством указанного выше второго реагента,

приложения света к окрашенным клеткам крови для получения информации от рассеянного света и информации от флуоресценции и

классификации и подсчета базофилов и/или нуклеированных эритроцитов в образце на основе информации от рассеянного света и информации от флуоресценции.

На стадии окрашивания первый реагент, второй реагент и образец смешивают. На этой стадии катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическая карбоновая кислота в первом реагенте лизируют эритроциты в образце и повреждают клеточные мембраны клеток крови, так что флуоресцентный краситель может проникать через них. Соответственно, посредством смешивания первого реагента, второго реагента и образца целевые клетки крови могут эффективно окрашиваться флуоресцентным красителем.

На стадии окрашивания может использоваться любой порядок смешивания первого реагента, второго реагента и образца. Могут смешиваться первый реагент и второй реагент, а затем эта смесь может смешиваться с образцом. Альтернативно, могут смешиваться первый реагент и образец, а затем эта смесь может смешиваться со вторым реагентом. Сходные результаты измерений могут быть получены при любом порядке.

На стадии окрашивания смесь первого реагента, второго реагента и образца предпочтительно взаимодействует при 15-50°C, предпочтительно при 30-45°C в течение 5-120 секунд, предпочтительно 5-30 секунд.

Клетки крови, окрашенные на стадии окрашивания, могут анализироваться с помощью проточного цитометра. Теперь поясняется анализ клеток крови с использованием проточного цитометра. К окрашенным клеткам крови прикладывают свет, когда они проходят через проточную ячейку проточного цитометра, делая, таким образом, возможным получение информации от рассеянного света и информации от флуоресценции. Информация от рассеянного света не является конкретно ограниченной, постольку поскольку она представляет собой рассеянный свет, измеряемый с помощью обычного коммерческого проточного цитометра, и содержит ширину импульса, интенсивность и тому подобное для рассеянного света, такого как свет, рассеянный вперед (то есть угол приема света составляет приблизительно от 0 до 20 градусов), свет, рассеянный вбок (то есть угол приема света составляет приблизительно 90 градусов). Как правило, свет, рассеянный вбок, отражает внутреннюю информацию, такую как информация о ядрах и гранулах клеток, а свет, рассеянный вперед, отражает информацию о размерах клеток. В способе настоящего варианта осуществления является предпочтительным, чтобы информация рассеянного света содержала интенсивность света, рассеянного вперед, и интенсивность света, рассеянного вбок.

Информацию от флуоресценции получают посредством приложения света, имеющего соответствующую длину волны, к измеряемому образцу и измерения возбужденной флюоресценции. В соответствии с используемым флуоресцентным красителем может выбираться соответствующая длина принимаемой волны. Флюоресценция испускается нуклеиновой кислотой и гранулами в клетках, которые окрашиваются флуоресцентным красителем.

Источник света у используемого проточного цитометра не является конкретно ограниченным и выбирается среди источников света, которые имеют соответствующую длину волны для возбуждения флуоресцентного красителя. Например, могут использоваться красный полупроводниковый лазер, голубой полупроводниковый лазер, аргоновый лазер, He-Ne лазер. В частности, полупроводниковые лазеры являются недорогими по сравнению с газовыми лазерами, а следовательно, являются предпочтительными.

На основе измеренного таким образом рассеянного света и флюоресценции могут дискриминироваться от других компонентов и подсчитываться нуклеированные эритроциты и базофилы. Эта стадия предпочтительно включает в себя, например, (1) получение диаграммы рассеяния, имеющей две оси, информации от флуоресценции и информации от света, рассеянного вперед, (2) получение диаграммы рассеяния, имеющей две оси, информации от света, рассеянного вперед, и информации от света, рассеянного вбок, и (3) анализ соответствующих полученных диаграмм рассеяния с помощью соответствующего аналитического программного обеспечения.

На диаграмме рассеяния, имеющей ось x для интенсивности флуоресценции и ось y для света, рассеянного вперед, как показано на фиг.1, например, нуклеированные эритроциты, базофилы и лейкоциты, иные чем базофилы, распределяются с образованием кластеров, соответственно. На этой фигуре NRBC представляет собой кластер нуклеированных эритроцитов, BASO представляет собой кластер базофилов, WBC-BASO представляет собой кластер лейкоцитов, иных чем базофилы, и WBC представляет собой кластер лейкоцитов. На такой диаграмме рассеяния нуклеированные эритроциты появляются в области, у которой интенсивность флуоресценции ниже, чем у лейкоцитов. Соответственно, лейкоциты могут четко дискриминироваться от нуклеированных эритроцитов. Кроме того, базофилы появляются в области, у которой размер больше, то есть у которой интенсивность флуоресценции выше, чем у лейкоцитов, иных чем базофилы. Соответственно, базофилы могут дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы. Когда измерению подвергаются образцы крови, содержащие большое количество лейкоцитов, или образцы крови, для которых прошло некоторое время после их сбора, базофилы и лейкоциты, иные чем базофилы, могут не дискриминироваться точно на диаграммах рассеяния, использующих интенсивность флуоресценции и интенсивность света, рассеянного вперед. В таких случаях может использоваться информация от света, рассеянного вперед, и информация от света, рассеянного вбок. На диаграмме рассеяния, имеющей ось x для интенсивности света, рассеянного вбок, и ось y для интенсивности света, рассеянного вперед, как показано на фиг.2, например, базофилы и лейкоциты, иные чем базофилы, распределяются с образованием кластеров, соответственно. На этой фигуре BASO представляет собой кластер базофилов и WBC-BASO представляет собой кластер лейкоцитов, иных чем базофилы. На такой диаграмме рассеяния базофилы появляются в области, у которой интенсивность света, рассеянного вбок, и интенсивность света, рассеянного вперед, выше, чем у других лейкоцитов. Соответственно, базофилы могут дискриминироваться от других лейкоцитов. Кроме того, как описано выше, нуклеированные эритроциты могут дискриминироваться от других лейкоцитов в соответствии с фиг.1. По этой причине клетки, которые включаются в обе области на фиг.1 и 2, могут вычисляться как базофилы, так что может осуществляться более точное измерение базофилов.

Положения кластеров для каждых клеток крови, видимых на диаграммах рассеяния, могут идентифицироваться посредством обработки образцов, содержащих каждые клетки крови, соответственно, с помощью набора реагентов по настоящему варианту осуществления и осуществления измерений.

Количество и отношение нуклеированных эритроцитов и базофилов могут вычисляться посредством анализа кластеров на диаграммах рассеяния с помощью соответствующего аналитического программного обеспечения. Конкретно, когда кластер клеток идентифицируется на диаграмме рассеяния в положении, где, как предполагается, должны появляться определенные клетки, идентифицируется центр этого кластера. Граница этого кластера клеток может идентифицироваться как область, которая находится между центром и областью, в которой появляется другой кластер клеток, и простирается до той части, в которой появляется рассматриваемый кластер определенных клеток. Клетки, появляющиеся в этой идентифицируемой области, могут подсчитываться как рассматриваемые определенные клетки. В дополнение к этому, посредством подсчета лейкоцитов, иных чем базофилы, можно вычислить отношение базофилов к лейкоцитам в целом (базофилы/лейкоциты в целом; упоминаемое ниже как "отношение базофилов") и отношение нуклеированных эритроцитов к лейкоцитам в целом (нуклеированные эритроциты/лейкоциты в целом; упоминаемое ниже как "отношение нуклеированных эритроцитов"). Отношение нуклеированных эритроцитов, как правило, представляется как процент видимых нуклеированных эритроцитов на 100 лейкоцитов и выражается с помощью единицы "клетки/100 WBC".

Посредством использования набора реагентов и способа анализа образца в соответствии с настоящими вариантами осуществления кластеры, сформированные нуклеированными эритроцитами и базофилами, соответственно, четко отделяются от кластеров, сформированных другими клетками крови, так что может осуществляться более точный подсчет.

Настоящее изобретение объясняется дополнительно с помощью следующих далее примеров. Однако нужно заметить, что различные изменения и модификации могут повлиять на настоящее изобретение и что его рамки не ограничиваются следующими далее примерами.

Примеры

Катионные поверхностно-активные вещества, используемые в следующих далее примерах, представляют собой децилтриметиламмоний бромид (DTAB) и додецилтриметиламмоний хлорид (LTAC).

Неионные поверхностно-активные вещества, используемые в следующих далее примерах, представляют собой следующие:

простой полиоксиэтилен(16) олеиловый эфир (наименование продукта: NIKKOL BO-16);

простой полиоксиэтилен(20) цетиловый эфир (наименование продукта: NIKKOL BC-20TX);

простой полиоксиэтилен(20) полиоксипропилен(8) цетиловый эфир (наименование продукта: NIKKOL PBC-44);

простой полиоксиэтилен(30) полиоксипропилен(6) децилтетрадециловый эфир (наименование продукта: NIKKOL PEN-4630);

полиоксиэтилен(20) касторовое масло (наименование продукта: NIKKOL CO-20TX);

гидрированное полиоксиэтилен(20) касторовое масло (наименование продукта: NIKKOL HCO-20);

гидрированное полиоксиэтилен(50) касторовое масло (наименование продукта: NIKKOL HCO-50);

полиоксиэтилен(25) фитостанол (наименование продукта: NIKKOL BPSH-25).

Все указанные выше могут быть получены от Nikko Chemicals Co., Ltd.

Ароматические карбоновые кислоты, используемые в следующих далее примерах, представляют собой салициловую кислоту, фталевую кислоту, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту и аминобензойную кислоту.

Флуоресцентные красители, используемые в следующих далее примерах, представляют собой NK-529, NK-2670, NK-3750, NK-3383, NK-1840, NK-9001, NK-9003, NK-2929, NK-3375, NK-5056, NK-3266 и NK-3620. Все они могут быть получены от Playashibara Biochemical Laboratories, Inc. Химические формулы этих красителей представлены в таблице 1.

Сравнительный пример 1

В настоящем сравнительном примере образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора, анализируют посредством использования обычного способа.

Образцы крови, отобранные, соответственно, у трех субъектов, измеряют на автоматическом счетчике клеток крови XE-2100 (Sysmex Corporation: снабженном красным полупроводниковым лазером (633 нм)) для подсчета количества лейкоцитов в целом и количества базофилов. На основе этих результатов подсчетов вычисляют отношение базофилов. В качестве реагента используют Stromatolyser-FBII (Sysmex Corporation). Измеряют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

В результате, подтверждается, что содержания базофилов в этих образцах выше нормального значения (ниже эти образцы упоминаются как образцы BASO 1, 2 и 3, соответственно). Отношение базофилов в образцах BASO 1, 2 и 3 составляет 0,8%, 3,4%

и 1,6%, соответственно. Эти результаты используют в качестве эталона для примеров 1 и 2.

Нуклеированные эритроциты, содержащиеся в образцах крови, отобранных у трех субъектов, иных чем описанные выше субъекты, измеряют с помощью автоматического счетчика клеток крови XE-2100 для подсчета количества лейкоцитов в целом и количества нуклеированных эритроцитов. На основе результатов подсчетов вычисляют отношение нуклеированных эритроцитов. В качестве реагента используют Stromatolyser-NR (Sysmex Corporation). Измеряют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

В качестве результатов подтверждается, что нуклеированные эритроциты присутствуют в этих образцах (ниже эти образцы упоминаются как образцы NRBC 1, 2 и 3, соответственно). Отношение нуклеированных эритроцитов в образцах NRBC 1, 2 и 3 составляет 4,4 клеток/100 WBC, 1,9 клеток/100 WBC и 1,3 клеток/100 WBC, соответственно. Эти результаты используют в качестве эталона для примеров 1 и 2.

Пример 1

В этом примере приготавливают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции, и образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора, измеряют с помощью этих реагентов.

pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,5 мМ салицилата натрия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 2000 м.д. LTAC и 1000 м.д. BO-16.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,5 мМ салицилата натрия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1500 м.д. LTAC и 1000 м.д. PBC-44.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 2000 м.д. LTAC и 1000 м.д. BO-16.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1500 м.д. LTAC и 1000 м.д. PBC-44.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,5 мМ калия гидрофосфата, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 2000 м.д. LTAC и 1000 м.д. BO-16.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ калия гидрофосфата, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1500 м.д. LTAC и 1000 м.д. PBC-44.

Второй реагент:

Он представляет собой реагент, в котором 15 мг NK-3383 растворяют в 100 мл этиленгликоля.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови (образец BASO 1, 2 или 3 или образец NRBC 1, 2 или 3) тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 40°C в течение 10 секунд с получением образца для измерения. Образец для измерений вводят в детектирующую часть проточного цитометра, имеющего источник света возбуждения на 633 нм, и свет возбуждения прикладывают к клеткам в образце для измерений. Сигнал рассеянного света и флуоресцентный сигнал, испускаемый клетками, детектируют и анализируют для измерения базофилов, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов в целом в образце для измерений. Это измерение осуществляют с помощью автоматического счетчика клеток крови XE-2100.

Исследуют образцы BASO 1 и 2 и образцы NRBC 1 и 2, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Получают первую диаграмму рассеяния для образца для измерений, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Фиг.3 показывает вторые диаграммы рассеяния, полученные при измерениях образцов BASO 1 и 2, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора, и фиг.4 показывает первые диаграммы рассеяния, полученные при измерениях образцов NRBC 1 и 2, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

На основе этих диаграмм рассеяния подсчитывают лейкоциты в целом, базофилы и нуклеированные эритроциты и вычисляют отношение базофилов и отношение нуклеированных эритроцитов. Таблица 2 показывает отношения базофилов для образцов BASO 1 и 2, для которых прошло 8 часов после их сбора, которые вычисляют в сравнительном примере 1 и в настоящем примере. Таблица 3 показывает отношения нуклеированных эритроцитов для образцов NRBC 1 и 2, для которых прошло 8 часов после их сбора, которые вычисляют в сравнительном примере 1 и в настоящем примере.

Таблица 2 Используемые образцы Пример Отношение базофилов в сравнительном примере (%) Используемые реагенты Отношение базофилов (%) Образец BASO 1 (8 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 1,1 0,8 Первый реагент B и второй реагент 1,1 Первый реагент C и второй реагент 1,2 Первый реагент D и второй реагент 1,1 Первый реагент E и второй реагент 1,2 Первый реагент F и второй реагент 1,2 Образец BASO 2
(8 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 3,5 3,4 Первый реагент B и второй реагент 3,8 Первый реагент C и второй реагент 3,5 Первый реагент D и второй реагент 3,6 Первый реагент E и второй реагент 3,7 Первый реагент F и второй реагент 3,7

Таблица 3 Используемые образцы Пример Отношение нуклеированных эритроцитов в сравнительном
примере (клетки/100 WBC) Используемые реагенты Отношение нуклеированных
эритроцитов (клетки/100 WBC) Образец NRBC 1 (8 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 5,3 4,4 Первый реагент B и второй реагент 4,6 Первый реагент C и второй реагент 4,2 Первый реагент D и второй реагент 4,5 Первый реагент E и второй реагент 4 Первый реагент F и второй реагент 4,2 Образец NRBC 2 (8 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 1,8 1,9 Первый реагент B и второй реагент 1,8 Первый реагент C и второй реагент 2,1 Первый реагент D и второй реагент 1,8 Первый реагент E и второй реагент 2 Первый реагент F и второй реагент 2

Фиг.3 показывает, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца в соответствии с настоящим вариантом осуществления. Фиг.4 показывает, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца в соответствии с настоящим вариантом осуществления. Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количество и отношение к лейкоцитам в целом получают точно посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях, на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.3 и 4, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Таблицы 2 и 3 показывают, что отношения, вычисленные в примере 1, очень похожи на отношения, вычисленные в сравнительном примере 1. Следовательно, подтверждается, что нуклеированные эритроциты и базофилы могут измеряться с помощью реагентов для анализа образца настоящего примера так же точно, как в случае, когда используют другой реагент для измерения.

Пример 2

В этом примере первый и второй реагенты примера 1 используют для измерения образцов крови, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора. Способ измерения является таким же, как в примере 1, за исключением используемых образцов крови. Образец BASO 2 или 3 и образец NRBC 2 или 3, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, измеряют в настоящем примере.

Из первых реагентов A-F в примере 1 первые реагенты A, B, E и F используют для измерения образца BASO 2 и образца NRBC 2, а первые реагенты C и D используют для измерения образца BASO 3 и образца NRBC 3.

Подобно примеру 1, для образца для измерений получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Фиг.5 показывает первую и вторую диаграммы рассеяния, полученные посредством измерения на образцах BASO 2, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, и первую диаграмму рассеяния, полученные посредством измерения на образцах NRBC 2, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора. Фиг.6 показывает первую и вторую диаграммы рассеяния, полученные посредством измерения на образцах BASO 3, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, и первую диаграмму рассеяния, полученную посредством измерения на образцах NRBC 3, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора.

На основе этих диаграмм рассеяния подсчитывают лейкоциты в целом, базофилы и нуклеированные эритроциты и вычисляют отношение базофилов и отношение нуклеированных эритроцитов. Таблица 4 показывает отношения базофилов для образцов BASO 2 и 3, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, которые вычисляют в настоящем примере. Таблица 4 представляет собой соответствующие отношения базофилов, вычисленные в соответствии с первой диаграммой рассеяния (интенсивность света, рассеянного вперед, и интенсивность флуоресценции) и второй диаграммой рассеяния (интенсивность света, рассеянного вперед, и интенсивность света, рассеянного вбок). Таблица 5 показывает отношения нуклеированных эритроцитов для образцов NRBC 2 и 3, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, которые вычисляют в настоящем примере.

Таблица 4 Используемые образцы Используемые реагенты Отношение базофилов (%) Интенсивность света, рассеянного вперед, интенсивность света, рассеянного вбок Интенсивность света, рассеянного вперед, интенсивность флуоресценции Образец BASO 2 (50 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 3,6 3,3 Первый реагент B и второй реагент 3,6 3,6 Первый реагент E и второй реагент 3,6 3,5 Первый реагент F и второй реагент 3,4 3,4 Образец BASO 3 (50 часов после сбора крови) Первый реагент C и второй реагент 1,6 1,6 Первый реагент D и второй реагент 1,8 1,9

Таблица 5 Используемые образцы Используемые реагенты Отношение нуклеированных эритроцитов (клетки/100 WBC) Образец NRBC 2 (50 часов после сбора крови) Первый реагент A и второй реагент 1,9 Первый реагент B и второй реагент 1,8 Первый реагент E и второй реагент 1,8 Первый реагент F и второй реагент 1,8 Образец NRBC 3 (50 часов после сбора крови) Первый реагент C и второй реагент 1,1 Первый реагент D и второй реагент 1,2

Фиг.5 и 6 показывают, что базофилы в образцах, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца в соответствии с настоящим примером. Кроме того, показано, что нуклеированные эритроциты в образцах, для которых прошло примерно 50 часов после их сбора, четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца в соответствии с настоящим вариантом осуществления. Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, даже в образцах, для которых прошло некоторое время после их сбора, их количество и отношение к лейкоцитам в целом точно получают посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.5 и 6, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Когда осуществляют измерения по способу сравнительного примера 1, отношения базофилов для образцов BASO 2 и 3, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора, составляют 3,4% и 1,6%, соответственно. Отношения нуклеированных эритроцитов для образцов NRBC 2 и 3, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора, составляют 1,9 и 1,3 клеток/100 WBC, соответственно. На основе этих результатов в сравнительном примере 1 и в таблицах 4 и 5 отношения, вычисленные в примере 2, очень похожи на отношения, вычисленные в сравнительном примере 1. Следовательно, подтверждается, что нуклеированные эритроциты и базофилы могут измеряться, даже в образцах крови, для которых прошло некоторое время после их сбора, с помощью реагентов для анализа образца из настоящего примера настолько же точно, как в случае, когда для измерения используют другой реагент.

Кроме того, в соответствии с результатами для образца BASO 2 в таблицах 2 и 4 отношение базофилов, вычисленное для образца, для которого прошло примерно 50 часов после его сбора, очень похоже на отношение базофилов, вычисленное для образца, для которого прошло примерно 8 часов после его сбора. В соответствии с результатами для образца NRBC 2 в таблицах 3 и 5 отношение нуклеированных эритроцитов, вычисленное для образца, для которого прошло примерно 50 часов после его сбора, очень похоже на отношение нуклеированных эритроцитов, вычисленное для образца, для которого прошло примерно 8 часов после его сбора.

Соответственно, подтверждается, что очень точные измерения могут осуществляться с помощью реагентов для анализа образца из настоящего примера, даже когда используют образец, для которого прошло некоторое время после его сбора.

Пример 3

В этом примере исследуют сочетания катионного поверхностно-активного вещества, DTAB и различных неионных поверхностно-активных веществ. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. BO-16 и 3000 м.д. DTAB.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. BO-16 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. PBC-44 и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. PBC-44 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 2000 м.д. BC-20TX и 3000 м.д. DTAB.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 2000 м.д. BC-20TX и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент G:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. BPSH-25 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент H:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. BPSH-25 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент I:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. HCO-50 и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент J:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. HCO-50 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент K:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. HCO-20 и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент L:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. HCO-20 и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент M:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. CO-20TX и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент N:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. CO-20TX и 7000 м.д. DTAB.

Первый реагент O:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 3000 м.д. PEN-4630 и 5000 м.д. DTAB.

Первый реагент P:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. PEN-4630 и 7000 м.д. DTAB.

Второй реагент:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 300 м.д. NK-3383.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которого подтверждается присутствие BASO или NRBC (образец BASO 4 или образец NRBC 4), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 10 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100. Исследуют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образца для измерений, полученного из образца BASO 4, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образца для измерений, полученного из образца NRBC 4, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.7-10 показывают соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.7-10 показывают, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют DTAB и неионное поверхностно-активное вещество. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют DTAB и неионное поверхностно-активное вещество.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образце BASO 4, используемом в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть получены точно посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.7-10, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Пример 4

В настоящем примере исследуют сочетания катионного поверхностно-активного вещества, LTAC и различных неионных поверхностно-активных веществ. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. BO-16 и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. PBC-44 и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. PBC-44 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. BC-20TX и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. BC-20TX и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент G:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. BPSH-25 и 1500 м.д. LTAC.

Первый реагент H:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. BPSH-25 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент I:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. PICO-50 и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент J:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. HCO-50 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент K:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. HCO-20 и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент L:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 7000 м.д. HCO-20 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент M:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 1000 м.д. PEN-4630 и 1000 м.д. LTAC.

Первый реагент N:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ салицилата натрия, 5000 м.д. PEN-4630 и 1800 м.д. LTAC.

Второй реагент:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 300 м.д. NK-3383.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которого подтверждается присутствие BASO или NRBC (образец BASO 5 или образец NRBC 5), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 10 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100. Измеряют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образца для измерений, полученного из образца BASO 5, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образца для измерений, полученного из образца NRBC 5, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.11-14 показывают соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.11-14 показывают, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют LTAC и неионное поверхностно-активное вещество. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют LTAC и неионное поверхностно-активное вещество.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образце BASO 5, используемом в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть точно получены посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.11-14, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Примеры 3 и 4 показывают, что нуклеированные эритроциты и базофилы в образцах крови могут четко дискриминироваться от других лейкоцитов и подсчитываться посредством использования реагентов для анализа образца, в которых объединяют катионные поверхностно-активные вещества и неионные поверхностно-активные вещества.

Пример 5

В настоящем примере исследуют сочетания ароматических карбоновых кислот и буферных агентов. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 10 мМ калия гидрофосфата, 0 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 5 мМ калия гидрофосфата, 5 мМ DL-яблочной кислоты 5 мМ, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1 мМ калия гидрофосфата, 9 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,3 мМ калия гидрофосфата, 9,7 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 5 мМ салицилата натрия, 5 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 1500 м.д. LTAC.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1 мМ салицилата натрия, 9 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 1500 м.д. LTAC.

Первый реагент G:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,22 мМ салицилата натрия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 1500 м.д. LTAC.

Первый реагент H:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 5 мМ салицилата натрия, 5 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент I:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1 мМ салицилата натрия, 9 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Первый реагент J:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,24 мМ салицилата натрия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Второй реагент:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 300 м.д. NK-3383.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которых подтверждается присутствие BASO или NRBC (образец BASO 6 или образец NRBC 6), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 10 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100. Измеряют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образца для измерений, полученного из образца BASO 6, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образца для измерений, полученного из образца NRBC 6, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.15-17 показывают соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.15-17 показывают, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют ароматическую карбоновую кислоту и буферный агент. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, когда используют реагенты для анализа образца, в которых объединяют ароматическую карбоновую кислоту и буферный агент.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образце BASO 6, используемом в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть получены точно посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.15-17, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

На фиг.15 идентифицируют центры тяжести кластеров нуклеированных эритроцитов, базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, получают значения интенсивности флуоресценции, соответствующей соответствующим центрам тяжести, и сравнивают полученные значения (данные не показаны). Центры тяжести соответствующих кластеров получают с помощью известного способа (смотри публикацию нерассмотренной заявки на патент Японии HEI 5(1993)-149863). В результате, показано, что различие между интенсивностью флуоресценции нуклеированных эритроцитов и интенсивностью флуоресценции базофилов или лейкоцитов, иных чем базофилы, больше, когда используют реагенты для анализа образца, содержащие как фталевую кислоту, так и яблочную кислоту (первые реагенты B-D), по сравнению с реагентами для анализа образца, содержащими только фталевую кислоту (первый реагент A). Показано также, что среди реагентов для анализа образца, содержащих как фталевую кислоту, так и яблочную кислоту (первые реагенты B-D), различие между интенсивностью флуоресценции нуклеированных эритроцитов и интенсивностью флуоресценции базофилов или лейкоцитов, иных чем базофилы, больше для реагента с более высокой концентрацией яблочной кислоты (первые реагенты C и D).

Сходную тенденцию наблюдают на фиг.16 и 17 для реагентов для анализа образца, содержащих салициловую кислоту и яблочную кислоту (первые реагенты E-J). В результате, показано, что рабочие характеристики дискриминации, в частности, нуклеированных эритроцитов улучшаются посредством объединения ароматической карбоновой кислоты и буферного агента.

Пример 6

В настоящем примере используют различные флуоресцентные красители в качестве флуоресцентного красителя во втором реагенте. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,5 мМ калия гидрофосфата, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. BO-16 и 2000 м.д. LTAC.

Второй реагент A:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-529.

Второй реагент B:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-2670.

Второй реагент C:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3750.

Второй реагент D:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3383.

Второй реагент E:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-1840.

Второй реагент F:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-9001.

Второй реагент G:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 300 м.д. NK-9003.

Второй реагент H:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-2929.

Второй реагент I:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3375.

Второй реагент J:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 300 м.д. NK-5056.

Второй реагент K:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3266.

Второй реагент L:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3620.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которого подтверждается присутствие BASO или NRBC (образец BASO 7 или образец NRBC 7), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 10 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100.

Исследуют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образца для измерений, полученного из образца BASO 7, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образца для измерений, полученного из образца NRBC 7, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.18-20 показывают соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.18-20 показывают, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, посредством использования реагентов для анализа образца, содержащих любой из флуоресцентных красителей. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, посредством использования реагентов для анализа образца, содержащих любой из флуоресцентных красителей.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образце BASO 7, используемом в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть точно получены посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.18-20, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Пример 7

Исследование на тип бензойных кислот

В настоящем примере в качестве ароматических карбоновых кислот используют бензоат калия, 4-гидроксибензоат натрия, 3-гидроксибензоат натрия и 4-аминобензоат калия. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ бензоата калия, 8 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 3 мМ бензоата калия, 7 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 4 мМ бензоата калия, 6 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 7 мМ 4-гидроксибензоата натрия, 3 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 8 мМ 4-гидроксибензоата натрия, 2 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 4 мМ 3-гидроксибензоата натрия, 6 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент G:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 5 мМ 3-гидроксибензоата натрия, 5 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент H:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1 мМ бензоата калия, 9 мМ DL-яблочной кислоты, 2000 м.д. BO-16 и 2800 м.д. LTAC.

Первый реагент I:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ 4-аминобензоата калия, 8 мМ DL-яблочной кислоты, 2000 м.д. BO-16 и 2800 м.д. LTAC.

Водный раствор, содержащий 2 мМ гидрофталата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC, используют в качестве эталона для первых реагентов A-G, и водный раствор, содержащий 0,5 мМ гидрофталата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 2000 м.д. BO-16 и 2800 м.д. LTAC, используют в качестве эталона для первых реагентов H и I.

Второй реагент:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3383.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которого подтверждается присутствие BASO или NRBC (образцы BASO 8 и 9 или образцы NRBC 8 и 9), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 7 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100. Исследуют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образцов для измерений, полученных из образцов BASO 8 и 9, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образцов для измерений, полученных из образцов NRBC 8 и 9, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.21 и 22 показывают соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.21 и 22 показывают, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, в любом случае. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, в любом случае.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образцах BASO 8 и 9, используемых в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть точно получены посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.21-22, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Пример 8

Сочетание гидрофталата калия и бензоата калия

В настоящем примере исследуют сочетания гидрофталата калия и бензоата калия в качестве ароматических карбоновых кислот. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции. pH первого реагента составляет 3,0.

Первый реагент A:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ гидрофталата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент B:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1,5 мМ гидрофталата калия, 0,5 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент C:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1,33 мМ гидрофталата калия, 0,66 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент D:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 1 мМ гидрофталата калия, 1 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент E:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,66 мМ гидрофталата калия, 1,33 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент F:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 0,5 мМ гидрофталата калия, 1,5 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Первый реагент G:

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ бензоата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2500 м.д. LTAC.

Второй реагент:

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 150 м.д. NK-3383.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови, для которых подтверждается присутствие BASO или NRBC (образец BASO 10 или образец NRBC 10), тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 7 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100. Исследуют образцы крови, для которых прошло примерно 8 часов после их сбора.

Для образца для измерений, полученного из образца BASO 10, получают первую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, и вторую диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок. Для образца для измерений, полученного из образца NRBC 10, получают диаграмму рассеяния, имеющую две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.23 показывает соответствующие диаграммы рассеяния.

Фиг.23 показывает, что базофилы четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, в любом случае. В дополнение к этому показано, что нуклеированные эритроциты четко дискриминируются от базофилов и лейкоцитов, иных чем базофилы, в любом случае.

Показано также, что базофилы, содержащиеся в образце BASO 10, используемом в настоящем примере, четко дискриминируются от лейкоцитов, иных чем базофилы, на любой из второй и первой диаграмм рассеяния, которые имеют две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности света, рассеянного вбок, и две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции, соответственно.

Обнаружено, что количество клеток-призраков с преимуществами уменьшается, когда используют гидрофталат калия, и что фракция WBC и фракция NRBC четко дискриминируются с помощью бензоата калия. Посредством использования их в сочетании базофилы и нуклеированные эритроциты дискриминируются более четко, соответственно.

Таким образом, поскольку базофилы и нуклеированные эритроциты четко дискриминируются, соответственно, их количества и отношения к лейкоцитам в целом могут быть точно получены посредством идентифицирования клеток, видимых в определенных областях на диаграммах рассеяния, как показано на фиг.23, как базофилы и нуклеированные эритроциты.

Пример 9

Измерение образца крови, для которого прошло малое время после его сбора

В настоящем примере измеряют как NRBC, так и BASO в образцах крови, для которых прошло малое время после их сбора, с помощью реагентов по настоящему изобретению, посредством использования диаграммы рассеяния, имеющей ось x для интенсивности флуоресценции и ось y для интенсивности света, рассеянного вперед. Получают первый и второй реагенты, имеющие следующие композиции.

Первый реагент (агент для гемолиза):

Он представляет собой водный раствор, содержащий 2 мМ гидрофталата калия, 10 мМ DL-яблочной кислоты, 1000 м.д. PBC-44 и 2000 м.д. LTAC. pH первого реагента составляет 3,0.

Второй реагент (окрашивающий раствор):

Он представляет собой этиленгликоль, содержащий 50 м.д. NK-3383.

Используемые образцы крови представляют собой:

образцы крови, для которых подтверждено присутствие BASO (образцы BASO): 12 образцов; и

образцы крови, для которых подтверждено присутствие NRBC (образцы NRBC): 12 образцов.

Все образцы крови представляют собой такие, для которых прошло примерно 2-7 часов после их сбора.

Первый реагент (1 мл), 20 мкл второго реагента и 20 мкл образца крови (образец BASO или NRBC) тщательно смешивают и полученной таким образом смеси позволяют взаимодействовать при 41°C в течение 7 секунд с получением образца для измерения. Подобно примеру 1, базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты в целом в образце для измерений измеряют с использованием автоматического счетчика клеток крови XE-2100.

Для образцов для измерений, полученных из образцов BASO или NRBC, получают диаграммы рассеяния, имеющие две оси, интенсивности света, рассеянного вперед, и интенсивности флуоресценции. Фиг.25 показывает одну из диаграмм рассеяния для измерения образцов BASO. Фиг.26 показывает одну из диаграмм рассеяния для измерения образцов NRBC.

Фиг.25 и 26 показывают, что настоящие реагенты позволяют разделение NRBC и BASO в образцах крови, для которых прошло малое время после их сбора.

На указанных выше диаграммах рассеяния лейкоциты в целом, базофилы и нуклеированные эритроциты идентифицируются как клетки, видимые в определенных областях и подсчитываемые. Отношения базофилов и нуклеированных эритроцитов к лейкоцитам в целом получают из полученных количеств клеток.

Количества лейкоцитов в целом, базофилов и нуклеированных эритроцитов и отношения базофилов и нуклеированных эритроцитов к лейкоцитам в целом получают как эталоны для тех же образцов крови с помощью такой же процедуры как в сравнительном примере 1.

Фиг.27 показывает корреляции количества лейкоцитов в целом, отношение базофилов и отношение нуклеированных эритроцитов между результатами измерений с указанными выше реагентами (первый реагент и второй реагент) и эталонными измерениями. Результаты для количества лейкоцитов в целом для примера 9 и для эталона, показанные на фиг.27, получают от измерения образца BASO.

Фиг.27 показывает, что коэффициенты корреляции (r) между результатами, полученными с помощью настоящих реагентов и эталона, для любого параметра из количества лейкоцитов в целом, отношения базофилов и отношения нуклеированных эритроцитов составляют 0,9 или больше, показывая сильную корреляцию между ними. Соответственно, обнаружено, что NRBC и BASO могут измеряться с помощью настоящих реагентов в образцах крови, для которых прошло малое время после их сбора.

Настоящая заявка соотносится с заявками на патент Японии №№ 2007-252666 и 2008-76606, соответственно, поданными 27 сентября 2007 года и 24 марта 2008 года, их формулы изобретения, описания, чертежи и рефераты включаются в настоящий документ в качестве ссылок.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов и нуклеированных эритроцитов в образце, включающий первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, и второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Предложен способ анализа образца с использованием указанного набора. Предложены также набор реагентов для анализа образца для измерения лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов в образце и набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов, лейкоцитов, иных чем базофилы, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов в образце. Предложенная группа изобретений обеспечивает точное определение количества форменных элементов образца крови даже по прошествии 50 часов с момента получения образца от пациента. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 27 ил., 5 табл., 9 пр.

1. Набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов и нуклеированных эритроцитов в образце, содержащий:
первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, который может лизировать эритроциты и повреждать клеточные мембраны лейкоцитов, так чтобы флуоресцентный краситель мог проникать через нее, и
второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту,
где катионное поверхностно-активное вещество представляет собой соль четвертичного аммония или соль пиридиния, при этом неионное поверхностно-активное вещество представляет собой, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из простого полиоксиэтиленалкилового эфира, простого полиоксиэтиленполиоксипропиленалкилового эфира, полиоксиэтиленкасторового масла, гидрированного полиоксиэтиленкасторового масла, полиоксиэтиленстерина и гидрированного полиоксиэтиленстерина.

2. Набор реагентов по п.1, в котором флуоресцентный краситель, по меньшей мере, представляет собой один краситель, выбранный из группы, состоящей из флуоресцентного красителя, имеющего общую формулу (I):

где R¹ и R² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу;
представляет собой или
представляет собой или
R³, R⁴, R⁵ и R⁶ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или алкильную группу; и X^- представляет собой анион; и флуоресцентный краситель, имеющий общую формулу (II):

где R⁷ и R⁸ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу, необязательно содержащую кислотную группу;
представляет собой или
представляет собой или
и R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или кислотную группу при условии, что любой из R⁷-R¹² представляет собой/имеет кислотную группу; и кислотная группа, которая может присутствовать в R⁷-R¹², может образовывать соль, при условии что любая из кислотных групп, которые могут присутствовать в R⁷-R¹², представляет собой группу, из которой высвобождается протон.

3. Набор реагентов по п.2, в котором кислотная группа, которая может присутствовать в R⁷-R¹² в общей формуле (II), представляет собой сульфоновую группу.

4. Набор реагентов по п.2 или 3, в котором кислотная группа, образующая соль, которая может присутствовать в R⁷-R¹² в общей формуле (II), представляет собой группу соли щелочного металла.

5. Набор реагентов по п.1, в котором ароматическая карбоновая кислота представляет собой, по меньшей мере, соединение, выбранное из группы, состоящей из салициловой кислоты, фталевой кислоты, бензойной кислоты, гидроксибензойной кислоты, аминобензойной кислоты и их соли.

6. Набор реагентов по п.1, в котором рН первого реагента является кислотным.

7. Набор реагентов по п.1, в котором первый реагент содержит буферный агент, имеющий рКа в пределах от рН 2,0 до 4,5.

8. Набор реагентов по п.7, в котором буферный агент представляет собой, по меньшей мере, соединение, выбранное из группы, состоящей из яблочной кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, дигликолевой кислоты, малоновой кислоты и янтарной кислоты.

9. Способ анализа образца, включающий следующие стадии:
лизирования эритроцитов в образце и повреждения клеточной мембраны клеток крови, так чтобы флуоресцентный краситель мог проникать через нее посредством первого реагента по п.1, и окрашивания поврежденных клеток посредством второго реагента по п.1,
приложения света к окрашенным клеткам для получения информации от рассеянного света и информации от флуоресценции, и
классификации и подсчета базофилов и нуклеированных эритроцитов в образце на основе информации от рассеянного света и информации от флуоресценции.

10. Способ по п.9, в котором информация от рассеянного света представляет собой информацию от света, рассеянного вперед, и нуклеированные эритроциты в образце подсчитывают на основе информации от света, рассеянного вперед, и информации от флуоресценции на стадии классификации и подсчета.

11. Способ по п.9 или 10, в котором информация от рассеянного света представляет собой информацию от света, рассеянного вперед, и базофилы в образце подсчитывают на основе информации от света, рассеянного вперед, и информации от флуоресценции на стадии классификации и подсчета.

12. Способ по п.9, в котором информация от рассеянного света представляет собой информацию от света, рассеянного вперед, и информацию от света, рассеянного вбок, и базофилы в образце подсчитывают на основе информации от света, рассеянного вперед, и информации от света, рассеянного вбок, на стадии классификации и подсчета.

13. Способ по п.9, в котором лейкоциты в образце дополнительно классифицируют и подсчитывают на основе информации от рассеянного света и информации от флуоресценции на стадии классификации и подсчета.

14. Способ по п.13, где информация от рассеянного света представляет собой информацию от света, рассеянного вперед, и лейкоциты в образце классифицируют и подсчитывают на основе информации от света, рассеянного вперед, и информации от флуоресценции на стадии классификации и подсчета.

15. Набор реагентов для анализа образца для измерения лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов в образце, содержащий:
первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, которая может лизировать эритроциты,
где катионное поверхностно-активное вещество представляет собой соль четвертичного аммония или соль пиридиния, при этом неионное поверхностно-активное вещество представляет собой, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из простого полиоксиэтиленалкилового эфира, простого полиоксиэтиленполиоксипропиленалкилового эфира, полиоксиэтиленкасторового масла, гидрированного полиоксиэтиленкасторового масла, полиоксиэтиленстерина и гидрированного полиоксиэтиленстерина, и
второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту,
где лейкоциты и нуклеированные эритроциты могут дифференцироваться на основе информации от флуоресценции, полученной от образца, обработанного первым и вторым реагентами.

16. Набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов, лейкоцитов, иных чем базофилы, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов в образце, содержащий:
первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, которая может лизировать эритроциты,
где катионное поверхностно-активное вещество представляет собой соль четвертичного аммония или соль пиридиния, при этом неионное поверхностно-активное вещество представляет собой, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из простого полиоксиэтиленалкилового эфира, простого полиоксиэтиленполиоксипропиленалкилового эфира, полиоксиэтиленкасторового масла, гидрированного полиоксиэтиленкасторового масла, полиоксиэтиленстерина и гидрированного полиоксиэтиленстерина, и
второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту,
где базофилы, лейкоциты, иные чем базофилы, нуклеированные эритроциты и лейкоциты могут дифференцироваться на основе информации от флуоресценции и информации от рассеянного света, полученной от образцов, обработанных первым и вторым реагентами.