1
Изобретение относится к улучшенному способу вьщеления цитохрома С биологически активного соединения, который может найти применение в медицине для лечения различных нарушений окислительнЕзЖ процессов в организме .
Известный способ выделения цитохрома С 1 состоит в кислой экстракции (трихлоруксусной кислотой) сердец крупного рогатого скота, отделении балластных белков сульфатом аммония, осаждении цитохрома С раство-; ром трихлоруксусной кислоты, очистке от примесей насыщенным раствором сульфата аммония, диализе водного раствора продукта, деминерализации раствора цитохрома С с помощью катионита СДВ-ЗТ и анионита ЭДЭ-10П и, наконец, лиофильной сушке. Основные недостатки известного метода состоят в том, что диализ продолжается в течение 2-3 суток, при этом потери цитохрома С составляют до 25%; кроме того, весь процесс выделения состоит из большего количества технологических операций, общая продолжительность которых составляет 120 ч.
Цель настоящего изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.
Поставленная цель достигается описываемым способом выделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота, заключающимся в том, что сердца крупного рогатого скота экстрагируют трихлоруксусной кислотой, от экстракта отделяют балластные белки обработкой сульфатом аммония, затем полученный экстракт обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, с последующим элюированием раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8, после чего проводят деминерализацию электродиализом с использованием ионообменных мембран
Отличительными признаками способа являются обработка экстракта после отделения балластных белков макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, последующее элюирование раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8 и проведение деминерализации элюата электродиализом с использованием ионообменных мембран. Предпочтительными вариантами спос ба являются многократная (преимущественно двухкратная) сорбция цитохро ма С с помощью макропористых сульфокатионитов и осуществление электроди ализа в течение 4-6 ч при плотности тока 1-2 А/дм Применение описываемого способа вьщеления цитохрома С из сердец круп ного рогатого скота позволяет сократить время проведения процесса со 12 до 60 ч и повысить выход целевого продукта на . Пример 1. Свежие сердца, крупного рогатого скота дефростируют измельчают, промывают водой для удаления крови, а затем экстрагируют 2,5%-ной трихлоруксусной кислотой течение 2 ч. Для экстракции на 1 вес.ч. фарша берут 1 объем экстрагента.Перед осаждением балластных белков рН в экстракте устанавливают 7,0-7,2. Балластные белки отделяют при добавлении 550 г (Ш1)2 30 на 1л жидкости. Для хроматографического отделения цитохрома С используют колонку 10 X 200 мм, в которую загружают 10,0+0,1 г (в пересчете на сухое вещество) макропористого катионита КУ-23 30/100. Скорость пропускания исходного раствора и элюента 2мл/см мин, через колонку пропускают 150 мл экстракта, освобожденного от белков. Цитохром элюируют 0,55 М раствором NaC (40 мл). Параметры ионообмена приведены в табл.1. Таблица 1
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота | 2016 |
|
RU2658605C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С | 1994 |
|
RU2096464C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ ГИАЛУРОНИДАЗЫ | 2018 |
|
RU2703108C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С | 2010 |
|
RU2435597C1 |
| СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА С | 1996 |
|
RU2128512C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С | 1995 |
|
RU2105559C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С | 2013 |
|
RU2528061C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА | 1992 |
|
RU2027444C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ ИЗ ОРГАНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 1993 |
|
RU2067868C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ, РЕГЕНЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2020 |
|
RU2745443C1 |
Выход цитохрома С в этом опыте составил 62% от условного содержания в экстракте. В результате проведения 10 опытов было получено 10 фракций с содержанием цитохрома С
. Е цитохрома С 42,5%, -S . О , 9 .
с 2QO ОКИСЛ
Пример 2. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют макропористый сульфокатионит КУ 23 40/100 в количестве 10,0± iO,1 г (в пересчете на сухое вещество) . Параметры ионообмена в данном случае аналогичны параметрам, описанным в примере 1. Кроме того, для данной смолы исследовали влияние раз.личных видов элюента на процесс десорбции (табл.2).
Таблица 2
дистиллированная
0,55 М раствор NaC6
0,55 50,0
В данном примере оптимальные результаты (учитывая степень чистоты и вьоход) получают при использовании в качестве элюента раствора NaCe.
Повторное хроматографирование объединенных фракций, содержащих 3,3 мг/мл цитохрома С, на катионйте 40/100 позволило получить фракцию цитохрома С, которая имеет следующие характеристики: концентрация цитохрома 5,0 мг/мл, концентрация (NH ,)2 SO 2,3 Г--ЭКВ/Л. Общий выход цитохрома С после 2-кратной хроматографической очистки составил 50% Полученный раствор цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате АО-1 с помощью ионообменных мембран и . Параметры ионообмена аналогичны параметрам, приведенным
в примере 1, Потери цитохрома С на этой стадии составляют 12%. Общий выход цитохрома С по предлагаемой
,96
вьвделения 44%,
ОКИСА Пример 3.
Подготовку сырья.
экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит, полученный в результате полимеризации дивинилбензола, 100/100 в количест:ве 10,0±0,1 г (в пересчете на сухое вещество). В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Параметры 2-кратного ионообмена на данной смоле аналогичны параметрам, описанным в примерах 1 и 2. Выход цитохрома С равен 55%. Электродиализ проводят при параметрах, описанных в примерах, 1 и 2. Выход на этой стадии 85%. Общий выход цитохрома С по предg 550
лагаемой схеме 47%,
-Ic 2 во
ОКИСЛ
Пример 4. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит КУ-23 15/100.Параметры сорбции и десорбции аналогичны примерам 1,2,3. В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Катионит КУ-23 15/100 применяют в
П-, Na- и формах. Ионообмен проводят двухкратно. Наибольший выход цитохрома С (21%) получен при использовании NHx- формы. Условия электродиализа и выход цитохрома С аналогичны описанным в примере 1 и 2.
Общий выход гемопротеида с использованиеи данного катионита 17%,
550
Е Восст
- П 5
280 -°0Е;
очисд
Формула изобретения
76546128
щью макропористого сульфокатионита Источники информации, принятые во
проводят двухкратно, .внимание при экспертизе
3,Способ поп.1|Отличаю- 1. Авторское свидетельство СССР ад и и с я тем, что электродиалиэ№ 351546, кл. А 61 К 35/34, 1Г71.
