СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2011 года по МПК C12N11/02 C12P1/04 

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к микробиологическому синтезу веществ с использованием иммобилизованных бактериальных клеток, и может быть использовано для ферментативного получения натурального сахарозаменителя изомальтулозы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ энзиматического преобразования сахарозы в изомальтулозу с помощью изомальтулозосинтазы - фермента микробного происхождения, путем включения бактериальных клеток в гель [Патент №1011056. Способ получения изомальтулозы. Опубл. 07.04.1983, Бюл. №13].

Недостатками известного способа являются недостаточно высокий выход изомальтулозы и продолжительное время процесса биотрансформации сахарозы с целью получения изомальтулозы.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа иммобилизации бактериальных клеток - продуцентов изомальтулозосинтазы с целью получения изомальтулозы, позволяющего повысить ее выход и интенсифицировать процесс биотрансформации сахарозы за счет использования в качестве носителя для иммобилизации поли-N-винилпирролидона.

Для решения поставленной технической задачи предложен способ иммобилизации бактериальных клеток, характеризующийся тем, что бактериальные клетки Erwinia rhapontici B-9292 вносят в концентрации 10% в раствор поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере (pH 6,0), полученную реакционную смесь выдерживают в течение 3 часов при температуре 22-25°С, после чего иммобилизованные бактериальные клетки центрифугируют.

Технический результат заключается в повышении выхода изомальтулозы до 92-95% за более короткий промежуток времени за счет использования в качестве носителя для иммобилизации поли-N-винилпирролидона, что позволяет интенсифицировать технологический процесс.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; сахароза - 100, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Erwinia rhapontici B-9292 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут в течение 54 часов при температуре 28-30°С, после чего отделяют бактериальные клетки центрифугированием, определяют активность изомальтулозосинтазы, вносят клетки в концентрации 10% в раствор поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере (рН 6,0), полученную реакционную смесь выдерживают в течение 3 часов при температуре 22-25°С, после чего иммобилизованные бактериальные клетки центрифугируют и используют для трансформации сахарозы с целью получения изомальтулозы.

Изомальтулозосинтазную активность бактериальных клеток Erwinia rhapontici B-9292 определяют методом Сомоджи-Нельсона с учетом коэффициента пересчета, полученного при построении калибровочного графика. Реакция протекает при температуре 30°С, время реакции составляет 30 минут. Об активности изомальтулозосинтазы судят по изменению концентрации изомальтулозы, полученной в результате изомеризации сахарозы. Готовят 40% раствор сахарозы, в который вносят иммобилизованные бактериальные клетки Erwinia rhapontici B-9292. Реакционную смесь выдерживают при температуре 30°C с рН 6,0 в течение 1,5-2 часов, после чего иммобилизованные бактериальные клетки центрифугируют, а полученный фильтрат подвергают кристаллизации и сушат. При этом выход изомальтулозы составляет 92-95%.

Способ поясняется следующим примером.

Пример 1

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; сахароза - 100, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Erwinia rhapontici B-9292 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут в течение 54 часов при температуре 30°С, после чего отделяют бактериальные клетки центрифугированием, определяют активность изомальтулозосинтазы, вносят клетки в концентрации 10% в раствор поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере (рН 6,0), полученную реакционную смесь выдерживают в течение 3 часов при температуре 25°С, после чего иммобилизованные бактериальные клетки центрифугируют и используют для трансформации сахарозы с целью получения изомальтулозы. Определяют выход изомальтулозы.

Данные анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1 Показатели Данные по примерам Нативные клетки Иммобилизованные клетки Активность изомальтулозосинтазы, Ед/мг 2343 2350 Выход изомальтулозы, % 94 95 Продолжительность процесса, ч 3,5 1

Как видно из примера, предложенный способ иммобилизации бактериальных клеток позволяет получить продукт с использованием в качестве носителя для иммобилизации поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере (рН 6,0) с внесением в него бактериальных клеток Erwinia rhapontici B-9292, выращенных на питательной среде следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; сахароза - 100 в течение 54 часов при температуре 28-30°С, с дозировкой 5 Ед/мг субстрата, повысить выход изомальтулозы и интенсифицировать технологический процесс.

Предложенный способ иммобилизации бактериальных клеток позволяет повысить выход изомальтулозы и интенсифицировать процесс трансформации сахарозы за счет использования в качестве носителя для иммобилизации бактериальных клеток поли-N-винилпирролидона.

Способ иммобилизации бактериальных клеток предусматривает внесение бактериальных клеток Erwinia rhapontici B-9292 в концентрации 10% в раствор поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере рН 6,0. Полученную реакционную смесь выдерживают в течение 3 часов при температуре 22-25°С, а затем осуществляют центрифугирование иммобилизованных бактериальных клеток. Способ позволяет интенсифицировать процесс трансформации сахарозы и повысить выход изомальтулозы. Выход изомальтулозы составляет 92-95%. 1 табл.

Способ иммобилизации бактериальных клеток, характеризующийся тем, что бактериальные клетки Erwinia rhapontici B-9292 вносят в концентрации 10% в раствор поли-N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа с концентрацией 1 мг/мл в ацетатном буфере рН 6,0, полученную реакционную смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 22-25°С, после чего иммобилизованные бактериальные клетки центрифугируют.