СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ АУТОЛОГИЧНЫХ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2024 года по МПК A61K35/14 C12N5/00 C12N5/783 

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и может применяться в клеточной терапии для адоптивного переноса клеток при аутоиммунных патологиях. Изобретение также может найти применение в масштабировании Т-регуляторных клеток для научных исследований. Изобретение направлено на разработку нового способа индукции Т-регуляторных клеток из лимфоцитов периферической крови доноров в условиях in vitro при помощи коротких пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Т-регуляторные клетки выполняют чрезвычайно важную роль в супрессии иммунного ответа на уровне врожденного и адаптивного иммунитета. При аутоиммунных патологиях количество и функциональная активность этих клеток имеет принципиальное значение для пациента [Fehervari Z. & Sakaguchi S. Peacekeepers of the Immune System // Scientific American. 2006. V.295, №4. P. 56-63].

Получение Т-регуляторных клеток (Treg) необходимо для решения двух принципиально разных задач: первая задача связана с индукцией Treg в системе in vitro из аутологичных лимфоцитов с целью их адоптивного переноса пациенту с аутоиммунной патологией. Вторая задача связана с масштабированием количества этих клеток для изучения их активности и также возможностей модуляции при помощи новых фармакологических препаратов. Для решения этой задачи необходимо иметь технологии, позволяющие получить и нарастить Treg из периферических лимфоцитов здоровых доноров. Сложность исполнения задачи связана с тем, что у здоровых доноров уровень Treg не превышает 1% от всех лимфоцитов. Именно поэтому важно иметь технологии, позволяющие индуцировать дифференцировку Treg в культуре.

К настоящему времени известно два способа получения Treg: первый связан с использованием сортировки по поверхностным маркерам и получением клеток с фенотипом CD4+CD25+hi из мононуклеарных клеток донора без дальнейшего выращивания. Второй способ связан с культивированием лимфоцитов в условиях индукции их в фенотип Treg при помощи набора биологических активных веществ.

Очевидно, что получение достаточного количества Treg из периферической крови доноров без этапа культивирования практически невозможно, ни для научных целей, ни для адоптивного переноса. Именно потому, получение этой субпопуляции in vitro, практически единственный способ получить Treg в достаточном количестве.

Одна из самых распространенных методик получения Treg - это иммуномагнитная сепарация Т-хелперньгх клеток из периферической крови донора и дальнейшая их конверсия в фенотип Treg при помощи цитокинов IL-2 и TGF-(3, а также с Т-клеточным активатором, имитирующим присутствие антигенпрезентирующих клеток в культуре. Именно такой вариант генерации Treg самый рациональный, так как позволяет получить эти клетки в достаточном количестве для персонифицированной терапии [Патент RU 2437933, опубл. 27.12.2011, МПК: C12N 5/071]. Принципиальное отличие заявляемого способа получения Treg заключается во внесении в инкубационную среду композиции из коротких пептидов, присутствие которых приводит к повышению количества этих клеток.

Обоснование выбора пептидов

Трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ, PSG) - белок с плейотропными биологическими эффектами, который продуцируется клетками плаценты в период беременности. Концентрация ТБГ в сыворотке к III триместру достигает 200-400 мкг/мл, что значительно превышает концентрации других белков плаценты [Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Татаринов Ю.С. Трофобласт-специфический бета-гликопротеин в акушерстве и гинекологии. Иваново: Иваново, 2004. 240 с.]. ТБГ обладает выраженным иммунорегуляторным потенциалом, регулируя активность основных эффекторов иммунного ответа [Тимганова В.П., Бочкова М.С., Раев М.Б., Храмцов П.В., Заморина С.А. Иммунорегуляторный потенциал трофобластического pi-гликопротеина // Медицинская иммунология. 2021, V. 23(3). С. 455-468.]. Нашими исследованиями показано, что нативный препарат ТБГ, полученный из сыворотки крови беременных женщин, оказывал стимулирующий эффект на генерацию Treg в условиях in vitro [5.

Заморина S.A., Rayev М.В. Human trophoblastic β1-glycoprotein as a differentiation factor of minor regulatory T-lymphocyte subsets (Treg, Th17). The involvement of CD9 // Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2016. V. 10. N 4. P. 319-327]. Однако, практическое применение белков беременности как в нативной, так и в рекомбинантной форме связано с массой сложностей этического и экономического характера. В последнее время поиск биологических эффектов коротких линейных пептидов (мотивов) (SLiMs) является новой стратегией создания фармакологических препаратов («drug-design») [Persico М., Di Dato A., Orteca N., Fattorusso С, Novellino E., Andreoli M. and Ferlini C. From Protein Communication to Drug Discovery // Current Topics in Medicinal Chemistry 2015, V. 15(20), P.00.]. SLiMs являются высококонсервативными пептидными участками белковой молекулы длиной 3-10 аминокислот, которые разграничивают подлинные синтаксические и семантические единицы в белке. В перспективе они представляют собой новый класс препаратов, способных модулировать внутримолекулярные и межмолекулярные связи белков. Например, уже существует целый ряд препаратов, на основе SLiMs, которые имитируют или блокируют конкретное белок-белковое взаимодействие: Tritace®, Vasotec®, Accupril®, Lotensin® Zovirax®, Stutnet® Gleevec® Sprycel®. [en.wikipedia.org/wiki/Short_linear_motif]. Важно отметить, что в последние годы половина всех одобренных пептидных препаратов были пептидами [Angell Y., Holford М., Moos W.H. Building on success: a bright future for peptide therapeutics // Protein. Pept. Lett., 2018, V. 25, №12, P. 1044-1050.].

В первичной структуре различных PSG выявлены тетрапептидные участки: YQCE (присутствует во всех PSG), YECE и YACS (присутствуют в большинстве типов PSG), являющиеся консенсусньш мотивом YxCx (в данном случае, SLiMs), у которого выявлена иммуномодулирующая активность [Moldogazieva, N.T., Mokhosoev, I.M., and Terentiev, A.A. Pregnancy-Specific pi-Glycoproteins: Combined Biomarker Roles, Structure/Function Relationships and Implications for Drug Design // Curr. Med. Chemistry, 2016, V. 23, P. 1-23.].

Известен способ использования комплекса пептидов для повышения пролиферативной активности лимфоцитов человека в культурах, что свидетельствует об их эффективности в отношении регулирования активности клеток иммунной системы [Патент RU 2465001, опубл. 27.10.2012, МПК: А61К 38/03, А61Р 37/02, А61Р 37/04].

Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предложенный Быковской и соавт. [Патент RU 2437933, опубл. 27.12.2011, МПК: C12N 5/071]. Данная методика предполагает выделение мононуклеарных клеток периферической крови, из которых методом позитивной селекции получают монокультуру СO4+ - клеток, которые поляризуют в фенотип Treg при помощи цитокинов - IL-2, TGF-β и антител к CD2, CD3 и CD28. Затем клетки инкубируют в СО₂-инкубаторе в условиях содержания 5% СО₂ при 37°С в течение 7-12 суток. Смена среды производится каждые 3-4 суток. В итоге можно получить популяцию CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Т-лимфоцитов человека.

С позиции критики необходимо отметить, что, несмотря на эффективность схемы, в культурах, помимо регуляторных клеток (Treg) возникают и эффекторные субпопуляции клеток, непосредственно реализующие иммунный ответ, однако это общая проблема всех способов получения Treg.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка более эффективного способа получения регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) в условиях in vitro для дальнейшего применения в клеточной терапии или научных целях.

Достигаемый технический результат заключается в повышении уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культуре клеток при помощи композиции пептидов, добавленных к стандартной среде.

Достигается технический результат при помощи заявляемого способа в котором осуществляют магнитную сепарацию Т-хелперов из периферической крови человека (пациента), для их дальнейшего культивирования в условиях обработки смесью цитокинов, антител и пептидов (YACS, YQCE, YVCS, YECE) с целью последующего введения аутологичных клеток, обогащенных регуляторными Т-лимфоцитами, этому же пациенту.

В работе применяли пептиды ТБГ (YACS - A, YQCE - Q, YVCS - V, YECE - Е), синтезированные на заказ ООО «Рашн пептайд» (Россия), которые перед внесением в культуры были очищены от эндотоксина при помощи колонок Pierce™ High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns производства Thermo Scientific (США). В культуры вносили композицию из пептидов YACS, YQCE. YVCS, YECE в фармакологических концентрациях 5 и 50 мкг/мл, где каждый пептид был представлен в равных весовых пропорциях. Таким образом, каждый пептид был представлен в концентрации 1,25 и 12,5 мкг/мл, соответственно.

Способ повышения уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культурах клеток периферической крови человека, заключается в иммуномагнитной сепарации CD4+ Т-хелперов с последующим культивированием клеток in vitro в полной питательной среде и стандартных условиях, предусматривающих концентрацию СО₂ - 5% и температуру - 37°С, в присутствии моноклональньтх антител против CD3, CD28 в качестве Т-клеточного активатора и цитокинов, поляризующих Т-хелперы в фенотип Treg, а именно, IL-2 и TGF-β, при этом в среду культивирования клеток вносят композицию пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в концентрации 5-50 мкг/мл, что активирует поляризацию Т-хелперов в Treg, сопровождающуюся достоверным увеличением числа культивируемых клеток.

Исследование выполнено при финансовой поддержке правительства Пермского края в рамках научного проекта №С-26/509.

Сущность изобретения.

Из периферической крови, полученной венепункцией, выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) путем ее наслаивания на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). После чего из МПК клеток методом магнитной сепарации выделяют CD4⁺ Т-лимфоциты. Затем монокультуры Т-хелперов культивируют 72 ч (3 сут.) в полной питательной среде в присутствии цитокинов (IL-2, TGF-β) и Т-клеточного активатора (моноклональные антитела к CD2, CD3, CD28), что является стандартным способом поляризации Т-хелперов в Treg. Для индукции Treg в культуру вносят смесь синтетических пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в фармакологической концентрации (5 и 50 мкг/мл), при этом генерация Treg-клеток осуществляется в достаточном для персонифицированной терапии количестве.

Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что в культуральную среду вносят пептиды YECE, YQCE, YVCS и YACS в фармакологической концентрации (от 5 до 50 мкг/мл), дополнительно к базовым компонентам полной питательной среды (цитокины и Т-клеточный активатор). Результатом является более высокий достоверно значимый прирост клеток в культуре (на 22-31%) целевой субпопуляции Treg. Данная технология позволяет получить более высокое содержания Treg для адоптивного переноса или исследований in vitro.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПРИМЕР 1

Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n=5, возраст 25-39 лет) путем венопункции. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиаколл-верографина (Diacoll 1077, "Dia-M", Россия, ρ=1.077 г/см³). Монокультуры СD4+ - клеток (Т-хелперы) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием магнитных частиц MACS® MicroBeads ("Miltenyi Biotec", Германия). Чистота выделения Т-хелперов составила 96.7±1.7%. Полученные монокультуры Т-хелперов в концентрации 1×10⁶ клеток инкубировали в 96-луночном планшете в полной питательной среде (RPMI-1640 (Sigma Aldrich, США), 10% FBS ("ВI״, Израиль), 10 мМ Hepes ("ICN Ph.", США), 2 мМ L-глутамина ("ICN Ph.", США), 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина ("BI", Израиль)) и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами (#130-091-441, "Miltenyi Biotec", Германия), содержащими антитела против CD2, CD3, CD28 и цитокинами TGF-p (5 нг/мл) и IL-2 (166 нг/мл) ("Miltenyi Biotec", Германия). Пептидную композицию (YECE, YQCE, YVCS и YACS) вносили в культуры до конечной концентрации 5 мкг/мл, в равном количественном соотношении между каждым из четырех пептидов.

После культивирования 72 ч при 5% С02 и 37С производили окрашивание клеток с использованием панели идентификации Treg (#362251, "Biolegend", США), включающей витальный краситель 7-AAD и антитела к поверхностным антигенам (APC-CD25, APC/Cyanine7-CD3, PE/Cyanine7-CD127 (IL 7Rα), FTTC-CD4). Тактика гейтирования включала в себя следующие этапы: на графике FSC/SSC выделяли общий пул лимфоцитов, затем живые Т-лимфоциты (7-AAD-CD3+), из них гейтировали Т-хелперы (CD4+), внутри популяции которых оценивали процент Treg (CD25high CD127-/low) (рис. 1А). Итоговый фенотип Treg: 7-AAD-CD3+CD4+CD25highCD127-/low. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S ("Beckman Coulter", США). Далее файлы данных были обработаны в программе "KALUZA Analysis Software" (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку полученных результатов данных проводили в программе Graph Pad Prism 6 при помощи критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3)). Различия считались достоверными при р<0.5.

Приведенный пример иллюстрируется следующими графическими материалами: таблица 1, Фиг 1. Фиг. 2а.

ПРИМЕР 2

Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n=5, возраст 25-39 лет) путем венопункции. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиаколл-верографина (Diacoil 1077, "Dia-M", Россия, ρ=1.077 г/см3). Монокультуры СБ4+-клеток (Т-хелперы) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием магнитных частиц MACS® MicroBeads ("Miltenyi Biotec", Германия). Чистота выделения Т-хелперов составила 96.7±1.7%. Полученные монокультуры Т-хелперов в концентрации 1 × 10⁶ клеток инкубировали в 96-луночном планшете в полной питательной среде (RPMI-1640 (Sigma Aldrich, США), 10% FBS ("BI", Израиль), 10 мМ Hepes ("ICN Ph.", США), 2 мМ L-глутамина ("ICN Ph.", США), 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина ("BI", Израиль)) и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами (#130-091-441, "Miltenyi Biotec", Германия), содержащими антитела против CD2, CD3, CD28 и цитокинами TGF-P (5 нг/мл) и IL-2 (166 нг/мл) ("Miltenyi Biotec", Германия). Пептидную композицию (YECE, YQCE, YVCS и YACS) вносили в культуры до конечной концентрации 50 мкг/мл, в равном количественном соотношении между каждым из четырех пептидов.

После культивирования 72 ч при 5% С02 и 37°С производили окрашивание клеток с использованием панели идентификации Treg (#362251, "Biolegend", США), включающей витальный краситель 7-AAD и антитела к поверхностным антигенам (APC-CD25, APC/Cyanine7-CD3, PE/Cyanine7-CD127 (IL 7Rα), FITC-CD4). Тактика гейтирования включала в себя следующие этапы: на графике FSC/SSC выделяли общий пул лимфоцитов, затем живые Т-лимфоциты (7-AAD-CD3+), из них гейтировали Т-хелперы (CD4+), внутри популяции которых оценивали процент Treg (CD25high CD127-/low) (рис. 1А). Итоговый фенотип Treg: 7-AAD-CD3+CD4+CD25highCD127-/low. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S ("Beckman Coulter", США). Далее файлы данных были обработаны в программе "KALUZA Analysis Software" (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку полученных результатов данных проводили в программе Graph Pad Prism 6 при помощи критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3)). Различия считались достоверными при р<0.5

Приведенный пример иллюстрируется следующими графическими материалами: таблица 1, Фиг 1, Фиг. 2б.

КРЛ ТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРА ФИЧЕСКИХ МА ТЕРИАЛОВ

Сущность заявляемого изобретения поясняется следующими графическими материалами. На фиг 1 представлены гистограммы гейтирования Treg в популяции клеток, выделенных методом магнитной сепарации до начала культивирования клеток.

Фиг. 1а - гистограмма прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Выделен гейт лимфоцитов (32,43%).

Фиг. 1б - гистограмма жизнеспособных лимфоцитов, несущих маркер CD3 (CD3+7-AAD-, Т-лимфоциты) - 96,69%.

Фиг. 1в - гистограмма общего пула жизнеспособных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD4 (CD3+CD4+, Т-хелперы) - 98,22%.

Фиг. 1 г - график четырех популяций Т-хелперов, основанных на экспрессии молекул CD25 и CD127. Таргетная субпопуляция представлена на правом нижнем квадранте -регуляторньте Т-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+CD127-) - 45,16%.

На фиг. 2 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением смеси пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS. Тактика гейтирования аналогична представленной на фиг. 1.

Фиг. 2а - число Treg под воздействием пептидов в концентрации 5 мкг/мл, Фиг. 2б - то же, но в концентрации пептидов 50 мкг/мл.

На фиг. 3 показано, что применение пептидов по отдельности в тех же концентрациях (5 и 50 мкг/мл) продемонстрировало стимулирующий эффект на уровень Treg, который проявлялся для пептидов YQCE и YECE в высокой концентрации (50 мкг/мл), в то время как низкая концентрация пептидов (5 мкг/мл) не оказывали достоверных эффектов (Фиг. 3). В то же время, при использовании композиции из пептидов достоверный эффект наблюдался при использовании низкой фармакологической концентрации - 5 мкг/мл. Таким образом, композиция из пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS показала себя более эффективной для получения Treg, чем пептиды по отдельности. По-видимому, это связано с наличием эффекта имитации активных центров ТБГ, поскольку используемые в работе пептиды являются фрагментами активных центров этого фетоплацентарного белка. На графике в фиг. 3 отображены данные в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3), отмечены достоверны в w-критерию различия с контролем (* - между контролями, #-между эффектами пептидов и контролем), пептиды обозначены как YACS - A, YQCE - Q, YVCS - V, YECE - Е.

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующей таблицей:

После трех суток культивирования CD4⁺- лимфоцитов с пептидами YECE, YQCE, YVCS и YACS в концентрации 5 и 50 мкг/мл, количество Treg увеличивается на 22 и 31%, соответственно (табл. 1). Таким образом, применение коротких пептидов ТБГ в качестве дополнительного индуктора способствует генерации Treg. При этом две концентрации пептидов достоверно увеличивают уровень Treg в культуре, но не обнаружено различий между низкой и высокой концентрацией пептидов, что позволяет использование данных пептидов в диапазоне выбранных концентраций.

В целом, предложенный способ направленной дифференцировки CD4⁺-клеток в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов позволяет получить значимое с позиции практического применения количество Treg за счет добавления в культуру коротких пептидов ТБГ.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу усиления генерации Treg в системе in vitro, которая заключается в поляризации сепарированных Т-хелперов в фенотип Treg при помощи цитокинов и активации Т-клеточного рецептора. Изобретение заключается в культивировании клеток в среде, в которую добавляли комплекс пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS, в равном соотношении, что приводило к более эффективной генерации Treg. Изобретение способствует разработке способа поляризации Т-хелперов в фенотип Treg, что позволяет достигать существенное увеличения количества данных клеток в культуре. 3 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ повышения уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культурах клеток периферической крови человека, заключающийся в иммуномагнитной сепарации CD4+ Т-хелперов с последующим культивированием клеток in vitro в среде RPMI-1640, 10% FBS, с добавлением 10 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами и условиях, предусматривающих концентрацию СО₂ – 5% и температуру 37°С, в присутствии моноклональных антител против CD3, CD28 в качестве Т-клеточного активатора и цитокинов, поляризующих Т-хелперы в фенотип Treg, а именно, IL-2 и TGF-β, отличающийся тем, что в среду культивирования клеток вносят смесь пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в конечной концентрации 5–50 мкг/мл.