СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АДЭНОКАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/00 C12N13/00 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и онкологии.

Онкологические заболевания прочно удерживают печальное второе место по летальности в мире, несмотря на давние, усердные старания изучить болезнь и победить ее, несмотря на большие достигнутые успехи. Поэтому каждое, даже незначительное продвижение в решении задачи в научном плане или в клинике достойно внимания и приветствия.

Для лечения применяют известную и пытаются разработать новую химиотерапию, не самую эффективную из комплекса используемых приемов лечения, в силу высокой исходной (до 50%) резистентности злокачественных опухолей к токсическому воздействию химиопрепаратов.

Хирургические способы лечения онкозаболеваний показаны и сравнительно более эффективны для лечения незапущенных или умеренно запущенных форм. Однако хирургия является инвазивным вмешательством, для которого необходимо соблюдение ряда условий общего состояния больного, как правило, ослабленного развивающейся болезнью и премедикацией.

Известны, с конца прошлого века, заявившие хорошую перспективу, биологические способы лечения, в частности стимуляция иммунной системы (иммуномодуляция) специально выработанными вакцинами на основе угнетенных онкоклеток (в данном случае термин «вакцина» не вполне соответствует традиционному смыслу и используется с некоторой условностью).

Известен способ лечения онкозаболеваний и соответственно способ получения вакцины [Селедцев В.И. Доклад на выездном заседании Президиума СО РАМН, г.Новосибирск, клиника иммунопатологии ГУНИКИ СО РАМН РФ, 21 мая 2003 г.]. Данная вакцина содержит в своей основе разрушенные клетки опухолей мышей. Подкожную (игольную) инъекцию вакцины проводят по разработанному регламенту в сопровождении ронколейкина.

Способ недостаточно эффективен.

Более успешен известный способ лечения онкозаболеваний, в котором основой вакцины служат разрушенные клетки опухоли самого больного (аутовакцина), а в качестве носителя - инкубатора клеточной культуры используют имплантат из проницаемо-пористого никелида титана [Патент РФ №2234868]. Экспериментальный вариант вакцины в данном способе получен и апробирован на инбредных половозрелых мышах с искусственно вызванной опухолью аденокарциномы Эрлиха. Технология производства противоопухолевой вакцины в данном эксперименте составляет самостоятельный способ, по наибольшему сходству с предлагаемым, выбранный в качестве прототипа. Он осуществляется следующим образом.

Клетки аденокарциномы Эрлиха (опухолевые клетки желез внутренней секреции) из депонированного запаса банка клеток Российского онкоцентра им. академика Блохина (г.Москва) инъектируют мышам, прививая им опухоль. После развития опухоли, т.е. размножения онкоклеток в организме мыши, животное умерщвляют и вводят внутрибрюшинно питательный раствор RPMI-1640. Проводят массаж брюшной стенки. Образовавшуюся клеточную суспензию отсасывают шприцем и центрифугируют. Клеточный остаток ресуспензируют до необходимой концентрации в среде, составленной из раствора RPMI-1640, 10% фетальной сыворотки, гентамицина и глютамина. В дальнейшем для получения противоопухолевой вакцины клетки разрушают (снижают витальность до нуля).

С очевидностью следует, что производство исходного продукта для выработки экспериментальной вакцины, а далее и самой аутовакцины сложно и дорого. Этот недостаток усугублен в технологии производства вакцины для лечения больных, где стимулирование роста биоптированных клеток (повышение витальности) не осуществляется вообще, а на долю управления витальностью остается их ингибиция (снижение биоактивности), действие, завершающее технологический цикл. Могущий возникнуть в курсе лечения дефицит вакцины останется некомпенсированным. Технический недостаток прототипа возрастает до угрозы отсутствия функциональности.

Технический результат предлагаемого изобретения - повышение выхода культуры клеток для изготовления экспериментальной вакцины для лечения аденокарциномы Эрлиха.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе изготовления вакцины для лечения аденокарциномы Эрлиха в эксперименте, включающем регулирование витальности клеток, увеличение витальности клеток осуществляют облучением клеточной культуры «in vitro» электромагнитным полем оптического диапазона длин волн 900-1000 нМ, в течение 10-20 часов при плотности падающей мощности 0,4÷0,6 мВт/см².

Известные результаты множественных исследований влияния различных облучений, включая электромагнитное, на клеточные культуры создают картину, с одной стороны, достоверности самого факта реакции клеток, с другой стороны, недостаточности их уверенного, целенаправленного использования в практической работе («промышленная применимость»). Причина этого представляется в сложном и тонком характере реакции живой клетки на полевое воздействие. Клеточные акцепторы, участвующие в управлении обменом веществ и энергии клетки, весьма избирательны к виду облучения (электрическое, магнитное поле, их сочетание, рентгеновские волны), длине волны (радиодиапазон, оптический диапазон, когерентные и некогерентные волны, линейчатый или сплошной частотный спектр), интенсивности и дозе облучения [Дурнов Л.А., Грабовщиков А.Я., Гусев Л.И., Балакирев С.А. Экспериментальные и клинические исследования эффективности низкоинтенсивного лазерного излучения в онкологии. Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина, РАМН, www.riktamed.ru]. Незначительные вариации параметров облучения могут вызывать изменение реакции клетки, вплоть до перемены знака изменения ее витальности. Поэтому какая-либо некорректность постановки опыта, задания начальных условий исследования может привести (и приводит) к непрогнозируемым результатам. Дефицит достоверности результатов исследований, в свою очередь, тормозит их прикладное использование. Предлагаемое решение четко определяет режим инфракрасного облучения клеток аденокарциномы Эрлиха для их роста «in vitro». Потребительским итогом облучения является повышение выхода продукции на единицу исходного биоматериала, т.е. снижение материальных затрат, как важного фактора исследовательской и лечебной работы в стесненных условиях глобального кризиса и недофинансирования медицины.

Заявленные интервалы времени экспозиции, длин волн и падающей мощности оптического источника гарантируют работоспособность и технический результат способа. Параметры режима получены в результате научного поиска авторов, что свидетельствует об их некомпилированности, т.е соответствии критерию «изобретательский уровень». На чертежах представлено следующее.

Фиг.1 - схема внешнего вида планшета.

1 - лунки с клетками, 2 - светоизолирующие экраны.

Фиг.2 - схема установки с облучающими светодиодами.

3 - светодиоды типа АЛ 107 Б.

Фиг.3 - графики временной зависимости витальности клеток от облучения.

4 - контрольная группа,

5 - временная зависимость витальности клеток от облучения одним светодиодом,

6 - временная зависимость витальности клеток от облучения тремя светодиодами.

Фиг.4 - графики зависимости витальности клеток от длины волны облучения.

7 - режим облучения одним светодиодом в течение 12 часов,

8 - 1 светодиод, 24 часа,

9 - 3 светодиода, 24 часа.

Подтверждением достижимости технического результата является конкретный пример лабораторного эксперимента по выявлению влияния облучения клеток аденокарциномы Эрлиха «in vitro» и выбор режима работоспособности способа для стимуляции витальности клеток.

Пример

В эксперименте использованы технические средства, объекты исследования и методики, известные и финансово доступные, как условия, составляющие критерий изобретения «промышленная применимость». Опухолевые клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха получены из асцетической жидкости инбредных мышей линии C57BL/6, массой 20-24 г, самцов в возрасте 12-18 недель, перевитых опухолью с дозой 5×10⁶ клеток. Клетки выделялись методом центрифугирования и ресуспензировались в полной культуральной среде, состоящей из среды RPMI-1640 ("Sigma") с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ООО «Панэко», г.Москва), 250 мг/л глютамина и 40 мкг/мл гентамицина.

Ресуспензированные клетки раскапывались в 96-луночный планшет (фиг.1), в дозах 2×10⁵ клеток на лунку, с дифференцированным размещением их по 7 оптически изолированным друг от друга группам. Шесть рабочих групп предназначены для облучения от источников с разными длинами волн - от инфракрасного до ультрафиолетового диапазонов, седьмая - контрольная группа - без воздействия облучения. Загруженный планшет размещался в установку с облучающими светодиодами типа АЛ 107 Б (фиг.2), зонированными в 6 типов по длинам волн. Установка с загруженным планшетом помещалась в термостат, в атмосферу углекислого газа. Включение питания светодиодов соответствовало началу цикла облучения.

Изменение витальности клеточной культуры производилось в 0,4% растворе трипанового синего подсчетом трипаннегативных клеток и соотношением их количества ко всем клеткам луночного объема. Процедура подсчета производилась в конце намеченного временного интервала: для последующего, более длинного временного интервала клеточная культура во всех лунках обновлялась.

Влияние интенсивности облучения (плотность падающей мощности) определялось вариацией количества светодиодов в каждой волновой группе, конкретно для одного и трех запараллеленных и сфокусированных на одну группу клеток диодов.

Результаты эксперимента представлены графиками фиг.3, 4. Графики фиг.4 отображают зависимость витальности клеток от длины волны облучения для различных временных и мощностных режимов. Они свидетельствуют:

1. Наименьшую реакцию проявляют клетки при меньшей длительности облучения и меньшей плотности падающей мощности (кривая 7). Удвоение времени экспозиции и утроение плотности падающей мощности приводят к заметному увеличению реакции.

2. На длинноволновом участке облучения (инфракрасный диапазон) витальность клеток повышается - кривая лежит выше значения уровня контрольной группы 4. С укорочением длины волны и приближением к ультрафиолетовому диапазону реакция клеток снижается с переменой знака: стимуляция переходит в ингибицию. Временные зависимости представлены графиками 5 и 6 (фиг.3) для режимов облучения от одного и трех светодиодов соответственно, на волне длиной 1000 нм, что соответствует ближнему участку инфракрасного диапазона оптических волн. Здесь витальность клеток повышается (стимуляция, рост количества).

Анализ полученных результатов позволяет сделать утилитарные выводы, подтверждающие технический результат и обосновывающие отличительные признаки изобретения.

1. Возможен режим облучения опухолевых клеток адэнокарциномы Эрлиха для повышения их витальности.

2. Оптимальным выбором участка длин волн оптического диапазона следует считать 1000-750 нм.

Вблизи верхней границы интервала (750 нм) эффект роста витальности клеток снижается до порога практической целесообразности, а за ее пределами меняет знак, что соответствует ингибиции клеток, т.е. снижению витальности.

Нижняя граница интервала (1000 нм) выбрана из соображения имеющегося наличия электронных приборов, на которые ориентирован способ для его экономической доступности.

Временной и мощностной интервалы увязаны с волновым диапазоном облучения и ограничиваются условиями утилитарности.

Техническая и информационная готовность способа соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость».

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и онкологии. Способ изготовления экспериментальной вакцины для лечения адэнокарциномы Эрлиха путем перевивания подопытных животных опухолевыми клетками адэнокарциномы Эрлиха включает регулирование витальности клеток полученной культуры, причем регулирование витальности клеток осуществляют облучением клеточной культуры "in vitro" электромагнитным полем оптического диапазона длин волн 750-1000 нМ, в течение 10-20 часов при плотности падающей мощности 0,4-0,6 мВт/см². Способ позволяет увеличить клеточный ресурс при изготовлении вакцины и снизить финансовые затраты на исходное сырье. 4 ил.

Способ изготовления экспериментальной вакцины для лечения адэнокарциномы Эрлиха путем перевивания подопытных животных опухолевыми клетками адэнокарциномы Эрлиха, включающий регулирование витальности клеток полученной культуры, отличающийся тем, что регулирование витальности клеток осуществляют облучением клеточной культуры in vitro электромагнитным полем оптического диапазона длин волн 750-1000 нм в течение 10-20 ч при плотности падающей мощности 0,4-0,6 мВт/см².