Способ использования препаратов коллоидного серебра в лечении туберкулёзной инфекции в эксперименте для увеличения биодоступности специфических противомикробных лекарственных препаратов Российский патент 2025 года по МПК A61K33/38 A61P31/06 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к медицине, инфекционные болезни.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Из уровня техники известно, что препараты серебра обладают биоцидными свойствами в отношении широкого спектра возбудителей инфекционных болезней. Кроме того, комбинированное применение препаратов серебра с противотуберкулезными антибиотиками улучшает эффективность их применения в клинической практике 1) А.В. Захаров, А.Л. Хохлов, А.Э. Эргешов. «Наночастицы серебра в решении проблемы лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза». Архивъ внутренней медицины, № 3, 2017, стр. 188-199; 2) Кибрик Б.С., Лобановский В.М., Захаров А.В. и др. «Комбинированный лекарственный препарат противотуберкулёзного действия». Пат. 2403050; РФ, МПК A61KA61PB82B; заявл. 28.10.2008; опубл. 10.11.-2010, бюл. № 36; 3) RU 2003335 C1 1993.11.30. Гаврильев С. С. Способ лечения деструктивного туберкулеза легких с массивным бактериовыделением; 4) RU 2240806 C2 2004.11.27 Гусейнов Г.К. (RU) Способ лечения бациллярных форм туберкулеза легких; 5) WO 2018/189095 A1. Lostao Camon. Luis Jesus. Однако все вышеупомянутые прототипы изобретений имеют лишь относительное сходство с представляемым здесь изобретением. Авторы, особо не вдаваясь в механизм выявляемого терапевтического синергизма, объясняли это довольно просто, что, с одной стороны, специфический для данной инфекции антибиотик обладает биоцидным эффектом на возбудителя, а, с другой стороны, наночастицы или ионы серебра также обладают биоцидным действием, а, воздействуя на разные звенья метаболической системы возбудителя, получается синергический эффект, а другая часть авторов своих прототипов и вовсе не задумывалась над этим вопросом и обходилась лишь общими формулировками. Проанализировав данные научной литературы и проведя ряд экспериментов, выяснилось, во-первых, что самыми чувствительными клетками к воздействию препаратов коллоидного серебра оказались фагоцитирующие клетки – макрофаги, поскольку это единственные клетки иммунной системы организма, которые активно поглощают (фагоцитируют) и обезвреживают любые инородные частицы; во-вторых, эффект частиц коллоидного серебра во многом определяется их физическими и химическими свойствами, а в настоящее время диапазон выпускаемых промышленностью наночастиц серебра очень разнообразен. Исследователями была выявлена закономерность, что, чем меньше размер частиц серебра, тем выраженнее их токсические свойства! Тут необходимо заметить, что аналогичная зависимость прослеживается и при оценке эффективности терапии частицами с разными размерами, то есть с уменьшением размера частиц коллоидного серебра, повышается их биоцидная активность.

В природе существуют два вида механизма гибели клеток – апоптоз и некроз.

Апоптоз – это регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, находящиеся в оболочке цитоплазматической мембраны; фрагменты погибшей клетки в результате апоптоза обычно очень быстро (в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами, минуя развитие воспалительной реакции.

Некроз – повреждение клетки, которое приводит к их преждевременной гибели в живой ткани путем аутолиза. Некроз всегда сопровождается потерей целостности клеточной мембраны https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9D%D0%B5%D0%BA%D1%80%D0%BE%D0%B7 cite_note4 и неконтролируемым высвобождением продуктов клеточной гибели во внеклеточное пространство, это инициирует в окружающих тканях воспалительную реакцию, которая привлекает лейкоциты и близлежащие фагоциты, которые устраняют мёртвые клетки путем фагоцитоза. Однако вредные микробные вещества, высвобождаемые лейкоцитами, создают сопутствующие повреждения окружающих тканей.

Таким образом, гибель клетки через механизм апоптоза не позволяет высвободиться инфекционному возбудителю из погибшей клетки во внеклеточной пространство и вступить в непосредственный контакт с лекарственным препаратом, поскольку в процессе апоптоза возбудитель всегда находится в герметичной оболочке, состоящей из цитоплазматической мембраны, чего не происходит в случае с гибелью клетки по механизму некроза, где возбудитель после полного или даже частичного повреждения цитоплазматической мембраны начинает подвергаться прямому воздействию лекарственного препарата. Кроме того, наличие мембраны между лекарственным препаратом и возбудителем инфекции требует создания определенного градиента концентрации для проникновения препарата внутрь клетки, а именно это обстоятельство вынуждает врачей повышать дозы лекарственных препаратов, что неминуемо будет сопровождаться учащением случаев возникновения нежелательных побочных или токсических эффектов. Тут необходимо также напомнить читателю о результатах исследований нашего соотечественника А.Д. Белкина, которые объясняют механизм хронизации и устойчивости к лекарственным препаратам некоторых персистирующих в макрофагах инфекций тем, что возбудитель постоянно находится в оболочке цитоплазматической мембраны, а в некоторых случаях эта оболочка может быть многослойной (А.Д. Белкин. «Новые звенья в патогенезе хронических инфекций». Журнал "Врач". 1997. – N 7. – С. 40-41). К такого рода персистирующим в макрофагах инфекциям относятся туберкулез, хламидиоз, лейшманиоз, токсоплазмоз, лепра, листериоз и т.д.

Из сказанного можно сделать вывод, что если целенаправленно инициировать каким-либо агентом повреждение цитоплазматической мембраны инфицированных возбудителем макрофагов, а затем последние обработать специфическим противоинфекционным препаратом, то эффективность лечения значительно возрастёт. В подобных случаях не исключено, что можно допустить и одновременное введение обоих препаратов.

Препараты коллоидного серебра, такие как протаргол и колларгол, имеют средний размер частиц – мицелл от 0 до 100 нм и выше. Из уровня техники известно, что размер частиц очень сильно сказывается на частоте проявлений нежелательных побочных эффектов, так диаметр частиц от 0-10 нм является самым нежелательным для использования этих частиц при внутривенном их введении (Recordati, C., De Maglie, M., Bianchessi, S. Et al. Tissue distribution and acute toxicity of silver after single intravenous administration in mice: nanospecific and sizedependent effects. Part Fibre Toxicol 13, 12 (2016), рр. 2-17). В принципе, протаргол и колларгол отвечают этим требованиям, однако, в связи с неустойчивостью любых коллоидных растворов, примеси частиц размером менее 10 нм всё же присутствуют в них. С учётом этих данных, в представляемом здесь способе рекомендуется использование коллоидных растворов серебра с размером частиц от 10 нм и выше, вплоть до 600 нм. Именно этот диапазон размера частиц самый предпочтительный для фагоцитоза макрофагов, что неминуемо приведёт к некрозу фагоцита, в противном случае размеры менее 10 нм будут проникать в цитоплазму при помощи пино- и эндоцитоза, что повлечёт за собой гибель фагоцита по механизму апоптоза (Foldbjerg, R., Olesen. P., Hougaard, M., Dang, D.A., Hoffmann, H.J. and Autrup, H. (2009) PVP-Coated Silver Nanoparticles and Silver Ions Induce Reactive Oxygen Species, Apoptosis and Necrosis in THP-1 Monocytes. Toxicology Letters, 190, 156-162; Penghui Nie, Yu Zhao, Hengyi Xu. Synthesis, applications, toxicity and toxicity mechanisms of silver nanoparticles: A review., Ecotoxicology and Environmental Safety. 2023, 253, рр. 1-12).

Из уровня техники также известно, что при тестировании протаргола и колларгола на жизнеспособность спленоцитов и перитонеальных макрофагов мышей дозировок препаратов от 0.016; 0.08; 0.4; 2; 10; 20; 50 и 500 мкг/мл в условиях искусственного культивирования указанных клеток в питательной среде, было выявлено, что жизнеспособность спленоцитов при 3-х часовой экспозиции не меняется во всем диапазоне исследуемых дозировок, а вот при тестировании препаратов на модели перитонеальных макрофагов мышей обнаруживалась 100% гибель макрофагов по типу некроза в диапазоне от 10-20 мкг/мл при той же экспозиции. В этой же серии экспериментов исследователи протестировали протаргол и колларгол на функциональную активность спленоцитов. В качестве тестовой модели использовался тест на липополисахарид-стимулированную пролиферацию и пролиферацию спленоцитов в смешанной культуре лимфоцитов. В обоих тест-системах при тех же дозировках не было выявлено какого-либо эффекта, что указывает на то, что в указанном диапазоне доз препараты коллоидного серебра не оказывают своего разрушительного влияния на поверхностные рецепторы цитоплазматических мембран лимфоцитов.

К недостаткам прототипов прежде всего нужно отнести то, что гибель макрофагов, внутри которых персистирует тот или иной возбудитель, происходит по механизму апоптоза, что не способствует повышению эффективности лечения, а даже усугубляет последнюю. Кроме того, прототипы не предполагают снижение концентрации специфических противоинфекционных препаратов в организме. Все прототипы изобретения применялись в лечении только туберкулёза!

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачами изобретения являются:

1) Увеличить биодоступность противоинфекционных препаратов за счет инициации механизма гибели макрофагов по типу некроза.

2) Снизить концентрацию специфического противоинфекционного агента в организме

3) Ускорить сроки выздоровления.

4) Применить способ в лечении целого ряда других паразитарных и инфекционных болезней.

Осуществление изобретения

Эксперимент №1

Цель – выявление типа повреждения макрофагов от воздействия препаратов коллоидного серебра (протаргола или колларгола) на макрофаги в условиях IN VIVО.

В эксперименте были использованы мыши линии (CBA x C57BL/6)F1, самцы весом 25-28 грамм в возрасте 8-12 недель.

За четверо суток до теста в брюшную полость мышки вводили 1.0 мл гомогенизированной 4% суспензии крахмала с целью элиситации макрофагов. По истечении этого времени в брюшной полости мыши скапливалось большое количество фенотипически гомогенной популяции макрофагов, поглотивших и метаболизирующих гранулы крахмала. По истечении указанного срока в брюшную полость инъецировался, с разными концентрациями протаргол или колларгол, в 1-2 миллилитрах питательной среды для культивирования на основе RPMI1640. Через сутки у животных промывали брюшную полость 10 миллилитрами физиологического раствора хлорида натрия и полученную промывочную перитонеальную жидкость осаждали на лабораторной центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Затем надосадочную жидкость сливали и из осадка делали мазок для микроскопии. В результате изучения был сделан вывод, что под воздействием нарастающих доз (от 5 мкг/мл до 160 мкг/мл) и времени экспозиции с препаратами (от 2-х до 4-х часов и даже до 24 часов) отчетливо проявлялась гибель исключительно клеток макрофагального типа по типу некроза, ибо в поле зрения микроскопа наблюдалось увеличивающееся с повышением концентрации препаратов коллоидного серебра обрывки или небольшие конгломераты слипшихся фрагментов мембран, а также ядер клеток без покрывающей их цитоплазматической мембраны.

Серия экспериментов-3

Цель – выявление оптимально-безопасных терапевтических доз препаратов коллоидного серебра для селективного повреждения мембран макрофагов.

Воздействие колларгола и протаргола на макрофаги в условиях IN VIVО

Оценка величины гуморального иммунного ответа на тимус зависимый антиген ( этот тест характеризует функциональный статус клеток лимфоцитарного ряда в условиях IN VIVO)

Мышам-гибридам (СВА х С57BL6)F1 вводили внутривенно тестируемые препараты в дозе 1 мг/кг веса тела (эта доза рассчитана на концентрацию в крови животного эквивалентную токсическому диапазону доз для макрофагов в условиях IN VITRO) в 0.5 мл среды 199 (контрольным животным вводили 0.5 мл среды) и через сутки после введения исследуемых препаратов мышей иммунизировали, их внутривенно иммунизировали эритроцитами барана (тимусзависимый антиген) в дозе 2 × 10⁸ эритроцитов барана. На 4-е сутки после иммунизации мышей забивали и готовили супензию клеток селезенки в 5 мл среды 199, подсчитывая количество клеток. Суспензию спленоцитов разводили в 10 раз и смешивали 10% взвесью эритроцитов барана и комплементом в соотношении 1:1:1. Полученной смесью заполняли стеклянные камеры известного объема и инкубировали при 37 °С в течение 1 часа. После инкубации под бинокулярной лупой подсчитывали количество антителообразующих клеток (зон локального гемолиза) в каждой камере. Результаты выражали в виде числа антителообразующих клеток на селезенку и числа антителообразующих на 10⁵ ядросодержащих клеток селезенки.

ВЫВОД: полученные данные свидетельствуют, что как протаргол, так и колларгол в используемой дозировке не оказали влияния на величину гуморального иммунного ответа на тимус-зависимый антиген (эритроциты барана) и, следовательно, не нарушают взаимодействие Т- и В-лимфоцитов в этой иммунной реакции (Таблица – 1).

Таблица – 1

Влияние препаратов серебра (при их внутривенном введении мышам) на величину гуморального иммунного ответа на эритроциты барана

Контроль Колларгол, 1мг/кг Протаргол, мг/кг Опыт 1 АОК ⃰ /селезенку 19748 ± 2348 20990 ± 3910 22010 ± 3931 АОК/10⁶ клеток 132 ± 17 146 ± 30 158 ± 26 Опыт 2 АОК/селезенку 32798 ± 7973 22696 ± 6399 33979 ± 6274 АОК/10⁶ клеток 240 ± 47 194 ± 51 265 ± 51

⃰ – АОК – антителообразующие клетки.

Оценка реакции гиперчувствительности замедленного типа (этот тест определяется функциональным состоянием клеток моноцитарно-макрофагального происхождения)

Аналогично, как и в предыдущем тесте, мышей обрабатывали препаратами коллоидного серебра в дозе 1 мг/кг и через сутки после этого иммунизировали их внутрибрюшинным введением эритроцитов барана в дозе 10⁷ клеток. На 4-е сутки после иммунизации под подошвенный апоневроз задней лапки мыши вводили разрешающую дозу антигена (10⁸ эритроцитов барана в 50 мкл среды 199), одновременно в другую заднюю лапку мыши вводили такой же объем среды. Через 24 часа мышей забивали и штангенциркулем замеряли толщину лапок на уровне плюсневых костей. За величину реакции ГЗТ принимали разницу между толщиной лапки, в которую была введена разрешающая доза эритроцитов барана, и толщиной контрольной лапки. В результате полученных данных было выяснено, что колларгол и, в меньшей степени, протаргол, при введении их мышам до сенсибилизации, значительно подавляют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (Таблица – 2).

Таблица – 2

Влияние препаратов серебра (при их внутривенном введении мышам) на величину реакции гиперчувствительности замедленного типа

Препарат Разность толщины лапок, мм Опыт 1 Опыт 2 -------------
Колларгол,
1мг/кг
Протаргол,
1мг/кг 0,86 ± 0,07
0,46 ± 0,06 **
0,61 ± 0,07 * 0,82 ± 0,04
0,42 ± 0,05 **
0,53 ± 0,06 **

* – достоверное отличие от контроля (Р < 0,05).

** – достоверное отличие от контроля (Р<0,01).

ВЫВОД: основываясь на результатах ранее описанных экспериментов, можно предположить, что это действие препаратов коллоидного серебра обусловлено не их влиянием на Т-клеточные эффекторы реакции гиперчувствительности замедленного типа, а подавлением функции макрофагов, которые являются клетками эффекторами при развитии указанной иммунологической реакции.

СХЕМА ОСНОВОПОЛАГАЮЩЕГО ЭКСПЕРИМЕНТА

В эксперименте использовались мыши (CBA x C57bl/6)F1, самцы возрастом 12 недель и весом 25-28 грамм.

1-я группа – Контроль-1;

2-я группа – Контроль-2 БЦЖ (внутривенно вводили 3 мг вакцина в общем объеме физиологического раствора 0,3 мл);

3-я группа – Контроль-3 – протаргол (25 мг/кг, через 2 дня на третий);

4-я группа – Опытная-1 (БЦЖ в/в 3 мг + изониазид (25 мг/кг per os ежедневно);

5-я группа – Опытная -2 (БЦЖ в/в 3 мг + протаргол 25 мг/кг, через 2дня на третий);

6-я группа – Опытная-3 (БЦЖ в/в 3 мг + протаргол 25 мг/кг, через 2 дня на третий + изониазид (25 мг/кг per os ежедневно)).

Исследуемым параметром являлся прирост веса печени и селезёнки, после вычета веса аналогичных органов из соответствующих контрольных групп. Собственно прирост веса выражался как индекс отношения масса органа к общему весу экспериментального животного:

Таблица – 3

Влияние изониазида в комбинации с протарголом на гранулёмообразование инициируемое внутривенным введением вакцины БЦЖ в печени и селезёнки мышей линии (CBA x C57BL/6)F1

Индекс Контроль (+ БЦЖ) Опыт-1 (+ БЦЖ + изониазид) Опыт-2
(+ БЦЖ+
протаргол) Опыт-3
(БЦЖ +
протаргол + изониазид) Печень 2,43 ± 0,58 2,12 ± 0,5 ⃰
(↓ 12,76%) 2,36 ± 0,13 1,25 ± 0,37 ⃰⃰⃰
(↓ 53,9 % снижение) Селезёнка 0,765 ± 0,28 0,38 ± 0,28 ⃰
(↓ 50,3%) 0,43 ± 0,075 ⃰
(↓ 43,8%) 0,45 ± 0,2 ⃰
(↓ 54 %)

⃰ – Р < 0,05.

ВЫВОДЫ:

1) Эффект изониазида в монорежиме на гранулёмообразование, инициируемое внутривенным введением мышам живой вакцины БЦЖ, оказался минимальным и составил всего 12,76% от контроля;

2) Обработка мышей протарголом не выявила какого-либо его влияния на процесс гранулёмообразования инициируемого вакциной БЦЖ;

3) Комибинированная обработка мышей протарголом и изониазидом выявила выраженное подавление процесса гранулёмообразования в печени и составила 53,9%! от контрольного значения;

4) Комбинированная обработка мышей протарголом и изониазидом не оказала значительного влияния на величину лимфоидной реакции спленоцитов на введение живой вакцины БЦЖ. Вялость выявленной реакции объясняется низким процентным содержанием макрофагов в селезёнке мышей (менее 1-2% от общего количества клеток селезёнки); этот пункт также можно считать аргументом в пользу пункта №3, поскольку несущественное количество макрофагов в селезёнке не позволяет чисто методически регистрировать динамику изменений гранулематозного воспаления, и это ещё раз позволяет убедиться в том, что выявленный синергизм исследуемых препаратов можно объяснить лишь способностью протаргола увеличивать биодоступность изониазида к макрофагальным внутриклеточным возбудителям;

5) Выявленный синергизм в противотуберкулёзном эффекте от совместного применения изониазида и протаргола можно объяснить лишь одним – протаргол, разрушая поверхность цитоплазматической мембраны инфицированных макрофагов, увеличивает биодоступность изониазида к внутриклеточным возбудителям.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для лечения туберкулезной инфекции в эксперименте. Осуществляют внутривенное введение препарата коллоидного серебра протаргол с размером мицелл от 10 до 600 нм в дозе из расчета 1 мг/кг, затем через 120-240 мин вводят изониазид в дозе 25 мг/кг. Введение протаргола повторяют каждые 48 ч на фоне терапии изониазидом. Способ позволяет увеличить биодоступность специфических противоинфекционных препаратов за счет последовательного использования препарата коллоидного серебра протаргол, обеспечивающего разрушение цитоплазматической мембраны макрофага, и дальнейшего воздействия специфического противоинфекционного агента на возбудителя инфекции. 3 табл.

Способ использования препаратов коллоидного серебра в лечении туберкулезной инфекции в эксперименте, отличающийся тем, что препарат коллоидного серебра протаргол с размером мицелл от 10 до 600 нм вызывает гибель макрофагов по механизму некроза, тем самым увеличивает биодоступность противотуберкулезных лекарственных средств; в случае системного применения вначале внутривенно в дозе из расчета 1 мг/кг вводят протаргол за 120-240 мин до введения препарата специфической противоинфекционной терапии, а в дальнейшем инъекции повторяют через каждые 48 ч на фоне ежедневной специфической терапии изониазидом в дозе 25 мг/кг.