Способ выделения парапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях легких Советский патент 1983 года по МПК G01N33/50 

(5) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАРЛПРОТЕИНОВ ИЗ ТКАНИ ПОЧЕК ЖИВОТНЫХ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ

1

Изобретение относится к биохимии белков, в частности к выделению белков, и может быть применено для определения и выделения паропротеинов и белков с основными свойствами из тканей организма для биохимических исследований.

Известен способ получения денатурированных белков путем осаждения их солями тяжелых металлов, таких как серебра, меди, железа, свинца, цинка, ртути и других СО.

Однако по известнсму способу .невозможно получить парапротеины с нативными свойствами. Парапротеийы полностью выпадают в нерастворимый осадок, так как образуют металлоорганические соединения.

Целью изобретения является сохранение., нативных парапротеинов и увеличения их выхода.

Для достижения цели согласно способу выделения парапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях

легких, включающему гомогенизацию ткани.почек, осаждение парапротеинов солями металлов, экстрагирование их при подкислении и диализ, осаждение парапротеинов проводят при рН ,85,0 раствором мертиолата, а экстраг гирование проводят из осадка последовательно при рН 3,8-t,,0 и 2,6-3,0 растворами соляной кислоты.

Пример. Почки от животных,

10 зараженных туберкулезом, силикотуберкулезом, силикозом, и секционный материал больных туберкулезом легких перфузируют охлажденным до физиологическим растврром. Корковый

5 слой почек (Юг ) измельчают и растирают в фарфоровой ступке до гомо.-. генной массы с физиологическим раствором в отношении 1:1,5.

Полученную массу переносят в теф.

лоновый (фторопластовый ) гомогенизатор и проводят гомогенизацию в течение 3 мин при 1000 об/мин. Затем гомогенат переносят в фарфоровую ступ9оску, замораживают жидким азотом и тавляют в холодильнике на сетке. На следующий день гомогенату дают оттаять, переносят в пробирку и добавляют равный объем охлажденного эфира Гомогенат с эфиром встряхивают 2 мин цeнтpифyгиpyюt при охлах дении в течение 30 мин при «ООО об/мин. Полученный прозрачный экстракт содержит .около г/л белка. Для выделения парапротеинов с основными свойствами из экстракта тка ни почек последний подкисляют раствором соляной кислоты до рНЛ.5,5,0, оставляют на 30 мин, после чего центрифугируют. Благодаря подкисленной среде из экстракта осаждается значительная часть сопутствующих бел ков, нуклеопротеидов, нерастворимых частиц. Получается прозрачный белковый раствор, который подвергают диализу против О,005 -иогораствора соляной кислоты в течение суток в холодильнике при . Затем в белковый раствор вносят раствор мертиолата (сулемы ) в таком количестве, чтобы довести до 1%-ного раствора конечной концентрации и оставляют в холодильнике на сутки. Такой способ обработки обеспечивает выпадение в осадок большинства белков (во том числе парапротеинов). Осадок белков отделяют центрифугированием, промывают его 6, раствором мертиолата(сулемы при рН 3,0. Эту процедуру повторяют дважды. Из осадка экстрагируют парапротеины при рН ,0, доведя его раствором соляной кислоты. Для полного извлечения парапротеинов при этом значении рН осадок оставляют на сутки в холодильнике. Осадок промывают 0,5%-ным раствором мертиолата (сулемы ) в соля ной кислоте с рН k,0, Для дальнейшего извлечения парапротеинов из осадка-белковый раствор доводят до рН 3,0 раствором соляной кислоты. В осадке остаются сопутству ющие белки, не извлекаемые при рН k,Q и 3,0. Из белковых растворов сулему удаляют путем диализа против 0,01-ного раствора соляной кислоты. Белковый раствор замораживают и зате подвергают лиофилизации. Хранится препарат в сухом состоянии. Парапротеины с основными свойства ми, полученные предлагаемым способом обладают нативными свойствами. Выход белка 0,00 г. 4 После осаждения белков (парапротеинов ) раствором мертиолата или сулемы осадок промывают 0,5%-ным раствором мертиолата или сулемы, а затем из осадка последовательно при рН ,0 и 2,0 извлекают паропротеины растворами, содержащими соляную кислоту. Белковый раствор подвергают диализу для удаления мертиолата или сулемы. Растворимость белкового осадка после оса ; дения раствором мертиолата или сулемы и последующего диализа указывает на сохранение одного из признаков нативности белка. Изучают некоторые физико-химические и химические свойства выделенных белков.Определяют количество белка биуретовой реакцией,обнаруживающей пептидную связь,и по методу Лоури.Сохранение электрофоретических свойств подтверждают путем проведения электрофореза в полиакриламидном геле. Пpe v1aгаемым методом определяется одна белковая зона. Молекулярный вес парапротеинов определяют методом фильтрации через тонкий слой сефадекса Г-100 (размеры гранул ijO-120 мк) и методом фильтрации через колонку с сефадексом ., Г-100. Для построения калибровочной кривой используют чистые белки с известным молекулярным весом (сывороточный альбумин человека, пепсин, трипсин,, рибонуклеаза, цитохром С, мурамидаза (лизоцин), алы1)а-лактальбумин, бета-лактоглобулин. Согласно исследованиям молекулярный вес исследуемых парапротеинов почек кроликов составляет , парапротеинов почек крыс и морских свинок - 9500. Формула изобретения Способ выделения парапротеинов из ткани почек животных при заболеваниях легких, включающий гомогенизацию ткани почек, осаж/цение парапротеинов солями металлов, экстрагирование их при подкислении и диализ, отличающийся тем, что, с целью сохранения нативных парапроTeviHOB и увеличения их выхода, осаждение парапротеинов проводят при-рН А,8-5,О раствором мертиолата,а экстрагирование проводят из осадка

5 : 937525

последовательно.при рН 3,8-,0 и V. Асатиани В.С.Иетоды удаления i 2,6-310 растворами соляной кислоты. белков-из.содержащих их жидкостей.Источники информации, В кн.: Руководство по биохимической принятые ао внимание при экспертизе методике. Тбилиси, 1939,С.112.