СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ Российский патент 2012 года по МПК C11B1/04 C12N15/53 C12N15/54 C12N15/81 A01H5/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к биотехнологии, к способу получения полиненасыщенных жирных кислот в семени трансгенного растения. Способ включает введение в растительный организм нуклеиновых кислот, последовательности которых кодируют ферменты с активностью Δ-6-дезатуразы, Δ-6-элонгазы, Δ-5-дезатуразы, Δ-5-элонгазы, Δ-4-дезатуразы и Δ-12-дезатуразы. Способ позволяет увеличить содержание жирных полиненасыщенных кислот в семени трансгенного растения. 18 з.п. ф-лы, 33 ил., 24 табл., 61 пр.

1. Способ получения соединений общей формулы I

в семени трансгенных растений в количестве, по меньшей мере, 20% в пересчете на общее содержание липидов, включающий:
a) введение в растение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирущей полипептид с активностью Δ-6-десатуразы,
b) введение в растение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-6-элонгазы,
c) введение в растение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-5-десатуразы,
d) введение в растение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-5-элонгазы,
e) введение в растение, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-4-десатуразы,
f) при необходимости, введение в растение нуклеиновой кислоты с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-12-десатуразы,
причем переменные и заместители в формуле I имеют следующие значения:
R¹ означает гидроксил, коферментА-(тиоэфир), лизо-фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилэтаноламин, лизо-фосфатидилглицерол, лизо-дифосфатидил-глицерол, лизо-фосфатидилсерин, лизо-фосфатидилинозитол, сфингозиновое основание или остаток общей формулы II

где R² означает водород, лизо-фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилэтаноламин, лизо-фосфатидилглицерол, лизо-дифосфатидинглицерол, лизо-фосфатидилсерин, лизо-фосфатидилинозитол или насыщенный или ненасыщенный С₂-С₂₄-алкилкарбонил,
R³ означает водород, насыщенный или ненасыщенный C₂-C₂₄-алкилкарбонил или
R² или R³ независимо друг от друга означают остаток общей формулы Ia

где n=2, 3, 4, 5, 6, 7 или 9, m=2, 3, 4, 5 или 6 и р=0 или 3.

2. Способ по п.1, в котором заместители R² или R³ независимо друг от друга означают насыщенный или ненасыщенный С₁₀-С₂₂-алкилкарбонил.

3. Способ по п.1, в котором заместители R² или R³ независимо друг от друга означают ненасыщенный C₁₈-, C₂₀- или С₂₂-алкилкарбонил с, по меньшей мере, двумя двойными связями.

4. Способ по п.1, в котором
a) нуклеиновую кислоту с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-6-десатуразы, выбирают из группы, состоящей из:
i) нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 193 или SEQ ID NO: 201,
ii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые кодируют аминокислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 194 или SEQ ID NO: 202,
iii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые в жестких условиях гибридизируют с комплементарной цепью нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 193 или SEQ ID NO: 201, и
iv) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые идентичны представленной в SEQ ID NO: 193 или SEQ ID NO: 201 последовательности на, по меньшей мере, 60%,
b) нуклеиновую кислоту с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-6-элонгазы, выбирают из группы, состоящей из;
i) нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 199,
ii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые кодируют аминокислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 200,
iii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые в жестких условиях гибридизируют с комплементарной цепью нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 199, и
iv) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые идентичны представленной в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 199 последовательности, по меньшей мере, на 60%,
с) нуклеиновую кислоту с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-5-десатуразы, выбирают из группы, состоящей из:
i) нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11,
ii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые кодируют аминокислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12,
iii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые в жестких условиях гибридизируют с комплементарной цепью нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11, и
iv) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые идентичны представленной в SEQ ID NO: 11 последовательности на, по меньшей мере, 60%.

5. Способ по п.1, в котором нуклеиновую кислоту с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-5-элонгазы, выбирают из группы, состоящей из:
i) нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO:197,
ii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые кодируют аминокислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 198,
iii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые в жестких условиях гибридизируют с комплементарной цепью нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 197, и
iv) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые идентичны представленной в SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 197 последовательности на, по меньшей мере, 60%.

6. Способ по п.1, в котором нуклеиновую кислоту с последовательностью, кодирующей полипептид с активностью Δ-12-десатуразы, выбирают из группы, включающей:
i) нуклеиновые кислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 195,
ii) нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые кодируют аминокислоты с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 196,
iii) нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые в жестких условиях гибридизируют с комплементарной цепью нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 195,
iv) нуклеиновые кислоты с последовательностями, которые идентичны представленной в SEQ ID NO: 195 последовательности на, по меньшей мере, 60%.

7. Способ по п.5, в котором Δ-5-элонгазу экспрессируют под контролем семяспецифичного промотора.

8. Способ по п.6, в котором Δ-12-десатуразу экспрессируют под контролем семяспецифичного промотора.

9. Способ по п.1, в котором все последовательности нуклеиновых кислот вводят в растение в составе одного рекомбинантного вектора.

10. Способ по п.9, в котором каждая последовательность нуклеиновой кислоты находится под контролем собственного промотора.

11. Способ по п.10, в котором собственный промотор представляет собой семяспецифичный промотор.

12. Способ по п.1, в котором в формуле I m=4, n=3, р=3 и соединение представляет собой арахидоновую кислоту, и/или m=5, n=3, р=0 и соединение представляет собой эйкозапентаеновую кислоту, и/или m=5, n=5, р=0 и соединение представляет собой докозапентаеновую кислоту, и/или m=6, n=3, р=0 и соединение представляет собой докозагексаеновую кислоту.

13. Способ по п.1, в котором растение представляет собой маслосеменные или масличные растения.

14. Способ по п.13, в котором растение выбирают из группы, включающей сою, земляной орех, рапс, канолу, лен, ослинник, коровяк, чертополох, лесной орех, миндаль, макадамию, авокадо, лавровый лист, дикую розу, тыкву обыкновенную, фисташковый орех, кунжут, подсолнечник, сафлор красильный, огуречную траву, кукурузу, мак, горчицу, коноплю, клещевину, оливковое дерево, календулу, гранат, масличную пальму, грецкий орех и кокосовый орех.

15. Способ по п.14, в котором в качестве растения выбирают Brassica juncea.

16. Способ по одному из пп.1-15, в котором соединения формулы I получают из растения в форме масел, липидов и свободных жирных кислот.

17. Способ по п.16, в котором из соединений формулы I высвобождают насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты.

18. Способ по п.17, в котором высвобождение осуществляют щелочным гидролизом или ферментативным расщеплением.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно в растение вводят нуклеиновую кислоту с последовательностью, которая кодирует полипептиды с активностью ω-3-десатуразы, выбранную из группы, состоящей из:
1) нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 87 или SEQ ID NO: 105, или
ii) нуклеиновых кислот с последовательностями, которые как результат дегенерированного генетического кода производят от аминокислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 106, или
iii) производных нуклеиновых кислот с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 87 или SEQ ID NO: 105, которые кодируют полипептиды, по меньшей мере, с 60%-ной идентичностью на аминокислотном уровне с SEQ ID NO; 88 или SEQ ID NO: 106 и имеют активность ω-3-десатуразы.