Способ получения @ -амилазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/28 C12N15/00 

Изобретение относитсзя к .микробиологической промышленности, а именно к способам получения ot -амилазы Препараты, содержащие 46-аАилазу используются в животноводстве, пище вой, текстильной, бумажной промышленности и других областях народного хозяйства. , Известен способ получения амилбл тических ферментных препаратов с ис пользованием штампа Вас.1 Низ subtil ВНИИгенетика-42 вьфащиванием посе ного материала на ломтиках картофеля с последующей ферментацией, в ус ловиях аэрации на среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт, нитра аммония и мел. Штамм Bacillus subti lis ВНИИгенетика-42 в лабораторных условиях в колбах имеет активность 360-450 ед/мл за 48 ч ферментации JY Однако штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 не дает оптимальнр высоких активностей в производствен ных условиях в ферментерах емкостью 20 м. Кроме того, ферментационная среда, используемая для такого штам ма, на производстве не позволяет получать стабильный препарат. Известен способ получения об -амилазы, предусматривакяций культивирование продуцента Bacillus subtilis G-43 В аэробных условиях на ферментационной питательнойсреде, содержащей .источники углерода - крахмал и лактозу, источник азота и фосфооа - (NH jHPOJ, ростовые факторы белково-йитаминный концентрат и кукурузный экстракт, минеральные соли NaCi, СаСО, ,, MgSO,, И воду 2 Амилолитическая активность культуральной жидкости, полученной в лабораторных условиях, в колбах составляет 303 ед/мл. В промышленных условиях этот штамм при культивировании на ферментерах по сравнению со штаммом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 не проявляет вышеотмеченной активности. В связи с тем, что штамм Bacillus subtilisВНИИгенетика-42 в производственных условиях является более .активным продуцентом, сопоставительный айализ активностей проводят с учетом этого факта. Целью изобретения Является повышение выхода целевого продукта и его стабильности. . Поставленная цель достигается тем,- что в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44, в состав питательной среды дополнительно вводят, % от ее объема, минер&льные соли: CaCl 0,08-0,15, КеС1тбН,.0 0,0050,02, ZnSO 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливают ..равным 16-24, (NH)-, НРОи |0,9-2,0, NaCl . 0,08-0,3. Сущность способа состоит в том, что в условиях производства на ферментационной питательной среде .нового состава, содержащей крахмал, лактозу, кукурузный &кмтракт, амилолитичёская активность Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 на 15% выше, чем у штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42о Так, актийность штамма ВНИИ-генетика-44 в этих условиях через 64 ч ферментации достигает 309 ед/мл, в то время как активность ВНИИгенетика-42 232 ед/мл. В таблице приведены сравнительные данные трех параллельных ферментации с использованием штаммов Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 и ВНИИгенетика-44 в производственных условиях в ферментерах емкостью 20 и . Продолуштельность ферментации 60-64 ч.

Средняя амилолитическая активность по трем ферментациямШтамм Baolllus suttilis ВНИИгенетика-44 является мутантом исходного штамма Bacillus aubtelis В-340, полученного из Музея живых культур Й1нститута ВНИИгенетика. Штам полу304чен в результате применения генетиRO-сёлекционных методов и в промышленных условиях является более продуктивным, чем прототип - штамм 5 Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-42.

Ниже приведена биологическая характеристика штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44.

Культурально-морфологические признаки Штамма Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-44.

Морфология. Штам представляет собой грамположительную, спорообразукидую палочку, размером 2,5-4,5 х X 0,5-0,7(4 . Размер спор: 1,0-1,.2 X 0,6-0,7(й .

Культуральные и физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар (МПА). Через 48 ч и,нкубации при образует желторато-серые плоские, круглые, «олонии, диаметром 2,5-3,5 мм и с лопастными краями: колонии не врас тают в агар. Поверхность гладкая, матовая. .

Посев штрихом на мясо-пептонном агаре. При инкубации в течение 24 ч при З7с рост хороший. Штрих нитевидный с лопастным краем и гладкой, матовой поверхностью.

Посев уколомо Рост на поверхност Культура аэробная.

Мясо-пептонный бульон (МПВ) При инкубации в течение 24 ч при . без встряхивания рост без помутнени среды, на поверхности образуется сухая пленка. При встряхивании на качалке - сильное помутнение среды. При стояник образуется пленка.

Агаризованная среда Хоттингера. При инкубации в течение 48 ч при образует желтовато-серые, круглые, плоские колонии с белым лопастным краем, диаметром 3,5-5 мм. Поверхность шероховатая, матовая. На синтетической среде с минеральньом азотом (среза Спицайзена) растет в виде мелких круглых колоний диаметром 1-2 мм серовато-белого цвета. Поверхность матовая. Колонии срастаются с .субстратом.

На ломтиках картофеля пигмента не образует, имеет матовую, сухую, морщинистую поверхность.

Желатину разжижает на вторые сутки.

Крахмал гидролизует.

Молоко пептониэирует и подщелачивает.

Отношение к источникам углербда. Глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу ассимилирует..

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах.

В отличие от прототипа, обладающго сниженной активностью щелочной протеинаоы, штайм Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-44 имеет нормальный урвень синтеза щелочной протеиназы.

Штамм Bacillus subtilis, ВНИИгенетика-44 хранится в Музее живых

культур института ВНИИгенетика под регистрационным номером ЦМПМ В-1737.

Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 выращивают поверхностным способом в колбах в виде пленки на жидкой питательной среде, содержащей следующие компоненты: крахмал, (КН) CgHjOr, КНуРО,, , CaSOjj , FeSD, , CuSO, п-аминобензойная кислота, водау рН среды 6,0-6,3. Полученным таким образом посевным материалом в-количестве 0,01-0,02% от объема ферментационной среды засевают аппарат емкостью 20 м , содержащий 10 м ферментационной питательной среды состава, % крахмал 16-24, лактоза 0,2-0,3, .кукурузный экстракт 0,8-1,2, БВК 0,2-0,4, (НН)2НР04 0,9-2,0, NaCl 0,08-0,3., Caeiy 0,08-0,15, CaCO-j 0,02-0,03, 0,05-0,25, 0,02-0,09, FeCl 6HjO 0,050,02, ZnSQ4 0,001-0,003, CuSO 0,00025-0,00040, MnS04 0,0001-0,0002 вода ,72,2-81,7. ,

Содержание крахмала в ферментационной питательной среде 8-10%, остальное количество крахмала добавляют в виде подпитки в ферментер во время культивирования.

Согласно предлагаемому способу не проводят полного гидролиза крахмала, вxoдящe o в состав ферментационной среды (в том числе и добавляемого в виде лодпитки). Достаточно провести разжижение крахмала, т.е. осуществить его неполный гидролиз только до амилодекстринов (синяя окраска при реакции с йодом). В производстве по лицензии, приобретенной Советс,ким Союзом {Главмикробиопром) у французской фирмы Рапидаз, в составе ферментационной среды используют глубоко осахаренный крахмал, получаемый после полного гидролиза его до декстринов (бурая окраска при реакции с йодом)

Пример 1. Посевной материал получают выращиванием штамма Bacillu subtilis ВНИИгенетика-44 в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде состава, %: крахмал 10, (NH4) 3, РО 0,03, MgSOjTH O 0,15, КНдРО 0,2, СаЗОц 0,15., FeS04 0;002, MnSQ4 0,000125, GuS04 0,00075, п-аминобензойная кислота 0,001, вода 86,2, , рН 6,0-6,3, температура 35-3б С.

Пoлyчeнньfй посевной материал в количестве 0,01% от объема среды в ферментере вносят в аппарат объемом 20 м, содержащий 10 м ферментационной среды состава, %: крахмал 24 (в среду вносят 8%, остальное добавляют в виде подпитки в ходе ферментации), лактоза 0,2, кукурузный экстракт 0,9, БВК 0,2, (NH),lf РО, 1, 0,08, CaCljg 0,08, CaCOf 0,02, Rf. 0,07, 0,02, Fed,бН,,0 0,005, ZnSO 0,001, 0,00035, MnSO..j 0,0002, вода 73,3. pH 6,5. Пеногаситель 0,05%„ Процесс ферментации ведут при с аэрацией в течение 64 ч„ Культуральную жидкость, имекяаую активность 309 ед/мл oi гамилазы, высушивают на распылительной сушилке. Выход готового продукта 73%. П р и м е р 2. Штамм-продуцент, приготовление йосевного материала те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной сре ды и температуре культивирования. Культивирование проводят в ферменте ре объемом 20 м, заполненном 10 м ферментационной питательной среды следукяцего состава, %: крахмал 16 (в среду вносят 10%, остальное доба ляют в виде подпитки в ходе ферментации), лактоза 0,3, кукурузный экс тракт 1,1, БВК 0,4, (NH/) Р04 1,7 NaCl 0,2, CaCl/2 0,12, СаСОз 0,03, Мк3.04-7Н О 0,2, KfO 0,9, 0,015, ZnS04 0,002, CuSO 0,00025, MnSO 0,0001, вода 80,0. pK 6,6. Пенбгаситель 0,05%. Процесс ферментации ведут при с аэрацией в течение 60 ч. Культуральную жидкост имеющую амилолитическую активность 301 ед/мл, высушивают на распылител ной сушилке. Выход сухого продукта 71%. Преиму1цес±во способа состоит в том, что значительно сокращается время приготовления ферментационной питательной среды (2-3 ч вместо 8-10). За счет этого увеличивается оборачиваемость оборудования, что позволит получить дополнительный экономический эффект. Температуру ферментации поддерживают в пределах 34-37 С, рН 6-8. Для получения высокого выхода tf -амилазы рН поддерживается в кислой зоне. После завершения ферментации культуральную жидкость,высушивают, стандартизуют солями и используют в качестве неочищенного ферментного препарата. Лля- получения очищенного препарата oi -амиЛазы клетки после завершения фермента11ии отделяют фильтрованием или центрифугированием. После отделения клеток очищенный препарат ОС, -амилазы получают из жидкости одним из известных методов, например осаждением с помощью растворителя, высаливанием,, сг5пцением раствора и т.д. По предварительным расчетам экономия от использования способа в промышленности составит 250 тыс.руб./год.