Штамм бактерий BacILLUS амYLоLIQUеFасIеNS-продуцент @ -амилазы BacILLUS LIснеNIFоRмIS Советский патент 1993 года по МПК C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологической промышленности и представляет собой штамм Bacillus amylollquefaclens amy-, содержащий реком- бинантную плазмиду, кодирующую синтез термостабильной а -амилазы Bacillus licheniaormls, - продуценттермостзбильной а-амилазы.

а -Амилаза - фермент, разлагающий амилозную компоненту крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмал-содержащего сырья с целью получения глюкозо-фруктозных сиропов. Другое важное применение а-амилазы -.текстильная промышленность, где ее

используют для расшлихтовки тканей. Эти процессы протекают при весьма высоких температурах (до 105°С), что обуславливает необходимость повышения стабильности фермента при высоких температурах. Лучшими продуцентами бактериальных разжижающих а -амилаз являются в настоящее время штаммы Bacillus amylollquefaciens или штаммы Bacillus subtilis. содержащие фрагмент ДНК, кодирующий а-амилазу из Bacillus amyloliquefaciens. Однако, термо- инэктиоация этой а -амилазы происходит уже при температуре 70°С.

Известны штаммы-продуценты термостабильной а-амилазы Bacillus subtilis, содержащие плазмиду с геном а-амилазы

ч

00

00

ю о о

со

Bacillus Ucheniformis. Однако использование таких штаммов в промышленности затрудняется относительно низкой продуктивностью.Штамм B.amyloliquefaciens amy-Sm-(pBATAM2) (В- 5207) выбран в качестве прототипа. Этот штамм производит а-амилазу с необходимыми свойствами, но обладает недостаточной продуктивностью секретируемой термостабильной а-амилазы. Именно поэтому, повышение продукции термостабильной а -амилазы представляет собой важную задачу

Цель изобретения - повышение уровня продукции секретируемой термостабильной а-амилазы Bacillus licheniformis.

Поставленная цель достигается созданием нового штамма Bacillus amyloliquefaciens amy-(pBATAM2) - продуцента тёрмостабильной а-амилазы , имеющего регистрационный номер ВКПМ В-5208 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и секретирующего 220- 250 ед. активности фермента на 1 мл кул ь- туральной жидкости. Активность а-амилазы определяют, как описано в методике Госстандарта ГОСТ 20264. 4-74,

Штамм продуцент- Bacillus amyloliquefacleris amy- (pBATAM2) (В-5208) получают путем введения рекомбинантной плазмиды рВАТАМ2, которая кодирует синтез термостабильной а-амилазы В.licheniformis, в протопласты бесплазмид- ного штамма Bacillus amyloliquefaciens amy- (B-4899) известным методом трансформации (FEMC Micfobiol. Letters, 1988, v.48, 101-105).

Выборштамма Bacillus amyloliquefaciens amy-ВКПМ (В-4899) обусловлен тем, что этот штамм имеет мутацию в гене мезофильной«-амилазы на хромосоме и, соответственно, не сек.ретирует собственной активной «-амилазы. Штамм может продуцировать только термостабильную а - амилазу В.licheniformis, кодируемую введенной в штамм плазмидой рВАТАМ2. . Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5 - 4,0 х 0,5 - 0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0 - 1,2 х 0,6 - 0,7 мкм.

Культуральныёпризнаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептон- ном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, матовые., желтовато-серые, край неровный, лопастной, При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют

сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при 20- 45°С при оптимуме рН 6,8-7,5.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты,органичёские кислоты, в частности: D-глюкозу, D-фрукто- зу, лактозу. Не усваивают ацетат, галактозу.

0 В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Желатину разжижают.

5 Индол не образуют. .

Уреазную активность не обнаруживает. П. р и м е р 1. Конструирование штамма- продуцента Bacillus amyiollquefaciens amy- (рВАТАМ2). (ВКПМ-5208).

0 Для трансформации B.amyloliquefaciens amy-плазмидой рВАТАМ2 используют метод, описанный Vehmaanpera J. (FEMS Michrobiol.Letters, 1988, v.49,101). Трансформация . протопластовклеток

5 B.amyloliquefaciens amy (В-4899) проводят следующим образом: 1 мл суспензии ночной культуры B.amyloilquefaciens amy вносят в 9 мл питательного бульона PC и выращивают до титра 10 кл/мл. Клетки собирают центри0 фугированием (5000 об/мин. 10 мин)20°С), дважды промывают специальной средой SMMP(Vehmaanpera, FEMS Microbiol.Letters, v.49,101), а затем ресус- пендируют в среде SMMP, содержащей 100

5 мг/м/i лизоцима, и инкубируют 30 мин при 42°С. Образовавшиеся протопласты промывают средой SMMP с добавлением 0,1 %-но- го бычьего сывороточного, альбумина и используют для трансформации Плазмид0 ную ДНК рВАТАМ2 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при 0°С с протопластами клеток B.amyloliquefaciens amy и 22%-ным полиэтилен гликолем 6000, приготовленном на буфере SMMP. После десятикратного разве5 денйя средой SMMP с 0,1 %-ным альбумином трансформированные протопласты высаживают центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 20°С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30°С и

0 высевают на агаризованную среду DM3 с эритромицином (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производят через 48 ч роста при 37°С. Отбирают клоны, устойчивые, к эрит- ромицину 10 мкг/мл и гидролизирующие

5 амйлопектиназур (0,15%) или крахмал (0,11-).-.:

Анализ генетических маркеров плазмиды рВАТАМ2 в штамме Bacillus amyloliquefaciens amy (рВАТАМ2)(ВКПМ В- 5208) проводят следующим образом:

1. Устойчивость к эритроми цину клеток B.amyloliquefaciens (B-5208), содержащих плазмиду рВАТАМ2, анализируют на среде с содержанием эритромицина 5 - 20 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина.

2. Наличие секретируемой термостабильной а -амилазы в клетках B.amyloliquefaciens (B-5208), содержащих плазмиду рВАТАМ2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов наносят микробиологической петлей на чашку Петри с твердым LB-агаром, содержащим 0,15% амилопектиназура, в виде точек или полос и инкубируют при 37°С 18-24 час. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона гидролизованного амилопектиназура. Клетки исходного штамма - реципиента B.amyloliquefaciens (B- 4899), не содержащие плазмиды рВАТАМ2, зон гидролиза амилопектиназура не образуют, так как не содержат собственной секретируемой а-амилазы.

Определение активности термоста- б.ильной or-амилазы.

Активность термостабильной а -амилазы определяют по методике Госстандарта СССР (Методы определения амилолитиче- ской активности ГОСТ 202G4.4-74).

Активность термостабильной а-амилазы в культурзльной жидкости определяют во время ферментации определяют по гидролизу 1 %-нрго растворимого крахмала в 10 мМ Na-K-фосфатнрм буфере, рН 6,0, содержащем Imfvl CaClz и 33 мМ NaCI. Реакционная смесь содержит 10 мл 1 %-ного раствора растворимого крахмала, растворенного в 15 мМ Na-K-фосфатном буфере рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 мМ ацетатном буфере. рН 6,0, 3 мМ CaCla, 100 мМ NaCI супернатанта культуральной жидкости бактерий из ферментации). Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента. Пробы инкубируют при 30°С 10 мин. Реакцию останавливают добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0.1 М раствора HCI. Из полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего 0,0025% I и 0,025% KI. Реакционные смеси выдерживают при 20°С 20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм. Полученные растворы приобретают окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный раствор - фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованно- го крахмала. Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллированная вода. Количество прогидролизован- ного крахмала определяют по формуле

C DlfDlx0.1..

D 1

где DI -оптическая плотность контрольного раствора, D2 - оптическая плотность опытного раствора, 0,1 - количество субстрата,

взятое для испытания в качестве субстрата, г, Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06т, то испытание повторяют, подбирая разведение фермента.

Амилолитическую. активность (АС), ед/мл, определяют по формуле

с оосу Г П 001R7

дс ь,ьх1 иль-ь/хп

где С - количество гидролизованного крахмала, г:. п - величина разведения. За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принято такое количество ферментов, которые при строго определенных температуре. рН и времени действия гидролизуют до декстринов различной молекулярной массы 1 ггастворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

Полученной штамм имеет максимальную активность 287 ед/мл ч-:-рёз 77 ч, что соответствует 5 г/л.

Прим е р ы 2-8. Получение термосга- бильной а-амилазы с помощью рекомби- иантного штамма Bacillus amyloliquefaclens amy(pBATAiyi2) (ВКПМ B-5208).

Накопление термостабильной а-амилазы B.iicheniformis в культуральной жидкости штаммов B.amyloiiquefaciens a my- (рВАТАМ2) (ВКПМ В-5208) - заявляемый штамм и (ВКПМ В-5207)- прототип изучают при культивировании их в промышленных

ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осаха- ренный а -амилазой - 200, кукурузный экстракт - 18, дрожжевой экстракт - 2,4, лактоза - 0,6, (NH HPO-q 8,4; K2S04 - 3.

NaCI - 0,3; MgS04x7H20 - 0,15; CuSO - 0,0039; рН 7,2. Штаммы В.amyloliquefaclens В-5203 и В-5207, содержащие стабильно наследуемую плазмиду рВАТАМ2, выращивают на среде без антибиотика, процесс

ферментации проводят в ферментере Marubishi MD-150 с рабочей емкостью 0,75 л при 37°С. Активность фермента измеряют в ходе ферментации по методу, описанному выше. Данные по накоплению термостабильной «-амилазы B.llchenlformis в.к уль- туральной жидкости B.amylollquefaclens ату (рВАТАМ2) (ВКПМ В-5208) и B.amyloliquefaclens amy- Sm (рВАТАМ2) (ВКПМ В-5207) во время ферментации суммируются в табл.1.

Предлагаемый в данной заявке реком- бинантный штамм-продуцент термостабильной а-амилазы в 1,4-1,5 раз более продуктивен, чем исходный штамм-прототип (максимальная активность - 172 ед/мл).

П р и м е р 9. Сравнение свойств а -амилазы, продаваемой фирмой Slgma, и а- амилазы, полученной заявляемым штаммом-продуцентом.

Данные по свойствам термостабильной «-амилазы B.llcheniformls, секретируемой заявляемым рекомбинатным штаммом-продуцентом B.amyloliquefaciens amy- (рВАТАМ2) (ВКПМ В-5208)и свойства термостабильной а -амилазы B.iichenlformis, продаваемой фирмой Sigma ( cc-Amylase, Type XII-A, bacterial, from Bacillus

и

llcheniformis, No A3403) суммируются в табл.2.

Свойства термостабильной о:-амилазы B.licheniformls фирмы Sigma проверялись как в данной работе, так и описаны ранее 5 (S.J.Tomazic, A.M.KIibanov, Journal of Biological Chemistry, v.263. No. 7. p.3092- 3096, 1988).

Из анализа данных, представленных в 10 табл.2, ясно, что предлагаемый в данной заявке рекомбинантный штамм-продуцент термоетабильной Of-амилазы B.jicheniformls, B.amyloliquefaclens amy(pBATAM2) ВКПМ В- 5208 секретирует в культуральную жидкость 15 фермент, который по свойствам не уступает аналогичному ферменту фирмы Sigma, a именно: молекулярная масса, оптимальные рН и температура, изоэлектрическая точка, термостабильность совпадают с таковыми 20 препарата а-амилазы фирмы Sigma, Формула изобретения Штаммбактерий Bacillus amylollquefaclens ВКПМ В-5208 продуцент а-амилазы Bacillus jichenlformls.

25

Использование: биотехнология, генетическая инженерия, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: плазмиду рВАТАМ2. несущую ген термоста- бильнбй а-амилазы B.licheniformis, вводят в штамм В.amylollquefaclens ВКПМ В-4899, который лишен собственной мезофильной а -амилазы. Полученный штамм-продуцент ВКПМ В-5208 при культивации на промышленных средах выделяет значительные количества термостабильной ог-амилазы. Поскольку кодирующая фермент плазмида рВАТАМ2 стабильно поддерживается в B.amyloliquefaciens, нет необходимости добавлять в среду антибиотик. Заявляемый продуцент секретирует в среду а-амилазу в количестве 250-280 ед. ГОСТ/мл. Фермент по качеству не уступает препарату термостабильной а-амилазы фирмы Sigma с температурным оптимумом 90°С. 2 табл. ел с

Накопление термостабильной а - амилэзы B.llcheniformls, продуцируемой штаммами В. amyloilquefacienc ВКПМ В-5208 и В, amyioliquefaciens ВКПМ В-520 7 ( штамм прототип ) во время ферментации

ГОСТ 20264. 4-74 Методы определения амилолитической активности.

Таблица 1

Показатель

а- амилаза B.llchenlformls

из штамма В. amylollquefaclens B-5207

Молекулярная масса, kDa

Изоэлектрическая точка р I

рН оптимум ферментативной активности

Температурный оптимум фе- ментативной реакции, °С

Термостабильность при 90 °С течение 1 ч. при рН 8, при инкубации фермента без субстрата (крахмала)

Удельная активность (ед. ГОСТ/мг). при рН 6,0, Т

- зо°с

Ферментативная активность термостабильной а - амилазы, измеряемая при 90°С (температурный оптимум ферментативной реакции) возрастает на 60-70% (в диапазоне рН 6-8) по сранению с активностью, измеряемой при 30°С по ГОСТ 20264. 4-74 методике (в том же диапазоне рН).

При определении концентрации белка по удельной экстинкции термостабильной а - амилазы величина удельной активности составляет 30 ед. ГОСТ/мг.

Таблица 2

а-амилаза B.lichenlformls фирмы Slgma Type XII - А

55

55

7,5

7,5

7,5

7,5

90

90

Сохранение 100% актив.

50

54