ДНК-ИНТЕРКАЛЯТОРЫ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕНОМОВ МЕЛКОХРОМОСОМНЫХ РАСТЕНИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области использования биологически активных соединений, обладающих вставочной активностью, в качестве ДНК-интеркаляторов для исследования геномов растений с мелкими размерами хромосом. В качестве таковых предлагаются поликонденсированные азагетероциклы общей формулы:

где R1=СF₃, R2=H; R1=NH₂, R2=H; R1=СF₃, R2=NH₂.

Известны следующие ДНК-интеркаляторы: этидий бромистый [Karapetian A.T., Mehrabian N.M., Terzikian G.A., Antonian A.P., Vardevanian P.O., Frank-Kamenetskii M.D. // J. Biomol. Struct. Dyn. 1996. V. 14, N 2. P. 275-283], акридиновый оранжевый [Zelenin A.V. Fluorescent and luminescent probes for biological activity. London: Acad. Press. 1999. P. 117-135], которые вызывают недоконденсацию хроматина в концентрации 4 мкг/мл, и 9-аминоакридин гидрохлорид [Muravenko O.V., Amosova A.V., Samatadze Т.Е., Popov K.V., Poletaev A.I., Zelenin A.V. // Cytometry. 2003. Vol.51. P.52-57; Муравенко О.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Амосова А.В., Зеленин А.В. // Генетика. 2001. Т. 37. №3. С.332-335], применяемый в концентрации 1 мкг/мл. К недостаткам данных веществ относятся - высокая концентрация, применяемая для обработки объектов исследования (клеточные культуры, органы и организмы), и, как следствие, сильные цитостатическое и мутагенное действия.

Целью изобретения является подбор новых ДНК-интеркаляторов для картирования геномов мелкохромосомных объектов, обладающих повышенной вставочной активностью, которые используются в меньших концентрациях, чем существующие аналоги.

Поставленная цель достигается тем, что вместо традиционно используемого 9-аминоакридин гидрохлорида предлагается использовать следующие соединения:

7-трифторметил-пиридо[1,2-а]бензимидазол (I)

7-аминопиридо[1,2-а]бензимидазол (II)

7-трифторметил-9-аминопиридо[1,2-а]бензимидазол (III)

,

в концентрациях 0.8 мкг/мл для I, до 0.6 мкг/мл для II, до 0.5 мкг/мл для соединения III для предобработки корневой меристемы семян мелкохромосомных растений. Способность соединений I-III встраиваться в двойную спираль ДНК оценивали по степени недоконденсации метафазных хромосом в меристеме, такого классического объекта с хромосомами мелкого размера, как Linum grandiflorum Desf., при обработке растворами соединений I-III за 12 ч до фиксации клеток в течение 6 ч. Для этого измеряли длину метафазных хромосом третьей пары из генома Linum grandiflorum Desf. в опыте, сравнивали ее со значением в норме, без ДНК-интеркалятора, и при действии известного интеркалятора - 9-аминоакридин гидрохлорида. Однозначное определение хромосом пары 3 в геноме проводили детекцией нуклеотидных последовательностей двух генов, локализованных только в данной хромосоме, с использованием метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 7-(трифторметил)-пиридо[1,2-а]бензимидазол (I)

Корешки пророщенных семян L. grandiflorum Desf. за 12 ч до фиксации помещали в водно-спиртовой раствор I с концентрацией 1 мкг/мл на 6 ч. Затем корешки фиксировали и готовили клеточные препараты корневой меристемы по стандартной методике [Муравенко О.В., Зеленин А.В. // Генетика. 2009. Т.45. №11. С.1457-1471]. Идентификацию хромосомы пары 3 проводили флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) нуклеотидных последовательностей 26S и 5S рРНК-х генов, которые локализованы именно в этой паре хромосом. В качестве проб для FISH использовали последовательности генов 26S и 5S рРНК из генома Linum austriacum. Сайты гибридизации распознавали путем иммунодетекции. Фрагменты 26S рДНК метили биотином, фрагменты 5S рДНК - дигоксигенином. Выявление биотин-меченых проб 26S рДНК проводили с помощью стрептавидин-флуоресцеина. Для проб 5S рДНК, меченных дигоксигенином, использовали антидигоксигенин-родамин.

Изображения метафазных хромосом с клеточных препаратов регистрировали с помощью 12-битной (4095 уровней серого) черно-белой ПЗС камеры, установленной на микроскоп.

Предобработка клеток соединением I в концентрации 1 мкг/мл приводила к увеличению средней длины хромосом пары 3 L. grandiflorum Desf. до 4.67±1.07 мкм, тогда как без интеркалятора длина метафазных хромосом третьей пары 2.52±0.33 мкм.

Пример 2. 7-аминопиридо[1,2-а]бензимидазол (II)

Исследование проводили аналогично I.

Предобработка пророщенных корешков L. grandiflorum Desf. за 12 ч до фиксации водно-спиртовым раствором II с концентрацией 1 мкг/мл в течение 6 ч приводит к увеличению средней длины хромосом пары 3 до 6.27±1.18 мкм, тогда как без интеркалятора длина метафазных хромосом третьей пары 2.52±0.33 мкм.

Пример 3. 7-трифторметил-9-аминопиридо[1,2-а]бензимидазол (III)

Исследование проводили аналогично I.

Предобработка пророщенных корешков L. grandiflorum Desf. за 12 ч до фиксации водно-спиртовым раствором III с концентрацией 1 мкг/мл в течение 6 ч приводит к увеличению средней длины хромосом пары 3 до 7.12±1.49 мкм, тогда как без интеркалятора длина метафазных хромосом третьей пары 2.52±0.33 мкм.

Пример 4. 9-аминоакридин гидрохлорид (Sigma-Aldrich, USA CAS [52417-22-8])

Предобработка корневой меристемы L. grandiflorum Desf. водно-спиртовьм раствором 9-аминоакридин гидрохлорида в концентрации 1 мкг/мл приводит к увеличению средней длины хромосом пары 3 до 3.76±0.63 мкм, тогда как без интеркалятора длина метафазных хромосом третьей пары 2.52±0.33 мкм. Полные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние обработки интеркаляторами на длину маркированной флуоресцентными метками хромосомы 3 Linum grandiflorum Desf. ДНК-интеркалятор Выбранный интервал N W_max W_min X, мкм SD, мкм 7-трифторметил-пиридо[1,2-а]бензимидазол 35 6.66 3.08 4.67 1.07 7-аминопиридо[1,2-а]бензимидазол 24 8.45 4.59 6.27 1.18 7-трифторметил-9-амино-пиридо[1,2-а]бензимидазол 25 11.34 5.33 7.12 1.49 9-аминоакридин 22 4.89 3.01 3.76 0.63 Контроль 35 3.33 1.74 2.52 0.33 N - число хромосом в выборке, W_max - максимальная длина хромосомы, W_min - минимальная длина хромосомы, Х - среднее значение длины, SD - стандартное отклонение

Таким образом, соединения I-III обладают способностью значительно сильнее удлинять метафазные хромосомы, чем 9-аминоакридин гидрохлорид, в той же концентрации 1 мкг/мл. Это позволит при использовании соединений I-III в качестве ДНК-интеркаляторов снизить действующую концентрацию до 0.8 мкг/мл для I, до 0.6 мкг/мл для II, до 0.5 мкг/мл для соединения III и тем самым уменьшить цитостатическое и токсическое действие, оказываемое ДНК-интеркалятором на объект исследования.

Изобретение относится к биохимии. Описано применение биологически активных соединений, обладающих вставочной активностью, в качестве ДНК-интеркаляторов для исследования геномов растений с мелкими размерами хромосом. Производные пиридо[1,2-а]бензимидазола формулы:

где R1=СF₃, R2=H (I); R1=NH₂, R2=H (II); R1=СF₃, R2=NH₂ (III), удлиняют размер хромосом в клетках корневой меристемы растений с малыми размерами хромосом при обработке водно-спиртовыми растворами с концентрацией 0.5-0.8 мкг/мл за 12 ч до фиксации в течение 6 ч. Изобретение предоставляет ДНК-интеркаляторы для картирования геномов мелкохромосомных объектов, обладающие повышенной вставочной активностью, которые используются в меньших концентрациях, чем существующие аналоги. 1 табл.

Применение азогетероциклов общей формулы

где R1=СF₃, R2=H; R1=NH₂, R2=H; R1=CF₃, R2=NH₂, в качестве ДНК-интеркаляторов для увеличения размеров хромосом в клетках корневой меристемы растений с мелкими размерами хромосом при обработке водно-спиртовыми растворами с концентрацией 0,5-0,8 мкг/мл за 12 ч до фиксации в течение 6 ч, что необходимо для картирования геномов мелкохромосомных объектов.