ХЕЛАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ РТУТИ С ЦИСТЕИНОМ И МЕТИОНИНОМ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ "МЕРКУРИД" - МОДУЛЯТОР АПОПТОЗА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ, ПРОТИВОВИРУСНЫМ, ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫМ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2012 года по МПК A61K33/28 A61K31/198 C01G13/00 A61P35/00 A61P31/12 A61P37/02 A61P33/00 

Изобретение относится к биоорганической химии и экспериментальной медицине, в частности к получению комплексов серосодержащих α-аминокислот со ртутью, а также лекарственному препарату «МЕРКУРИД», являющемуся модулятором апоптоза и обладающему противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием.

Широко известны различные лекарственные препараты, которые модулируют процессы иммунитета. В частности, способностью стимулировать иммунные реакции организма обладают производные нуклеиновой кислоты. Способностью специфически активировать иммунокомпетентные клетки (T- и B-лимфоциты) обладают препараты пирогенан, продигиозон и другие (см. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков, «Торсинг», 1997, т.2, с.206).

Известно средство иммуномодулирующего, противоопухлевого, противовирусного и обезболивающего действия, которое содержит действующее вещество и разбавитель. В качестве действующего вещества средство содержит дихлорид ртути, либо калия арсенит, либо натрия арсенат. В качестве разбавителя средство содержит натуральное белое виноградное вино с содержанием сахара 3-4 масс.% или молочную сыворотку тоже с содержанием сахара 3-4 масс.%.

Действующего вещества средство содержит 0,001-1,5 мас.%, а разбавителя - остальную массу до 100% (см. патент Украины №26641, C1 на изобретение «Средство иммуномодулирующего, противоопухлевого, противовирусного и обезболивающего действия, 1999 г.).

Можно допустить, что эта система представляет собой ртутьорганический комплекс, в котором дихлорид ртути (сулема) находится в структурно-связанном состоянии с органическими соединениями, в частности, входящими в состав белого вина.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является патент Украины №55308.

В указанном патенте описаны три объекта:

1. Комплексы ртути с цистеином формулы Hg(C₃H₆O₂SN)₂ либо с метионином формулы Hg(C₅H₁₀O₂SN)₂, которые обладают иммуномодулирующим, противовирусным, противоопухлевым и противоаллергическим действием.

2. Способ получения комплексов ртути с цистеином или метионином, который включает взаимодействие дихлорида ртути с водным раствором цистеина или метионина при соотношении ртути и соответственно α-аминокислоты, которое равняется 1:(2-3), полученный раствор выдерживают при 50-60°C в течение суток, выпаривают, остаток охлаждают до комнатной температуры, а образовавшийся осадок обрабатывают ацетоном и сушат до постоянного веса.

3. Средство, обладающее иммуномодулирующим, противовирусным, противоопухлевым и противоаллергическим действием, содержащее комплекс ртути с цистеином формулы Hg(C₃H₆O₂SN)₂ либо с метионином формулы Hg(C₅H₁₀O₂SN)₂, разбавитель - дистиллированию воду или безалкогольный бальзам «ВИН-ВИТА», при следующем соотношении компонентов, масс.%:

комплекс ртути с цистеином или метионином 0,048-0,066,

дистиллированная вода или безалкогольный бальзам «ВИН-ВИТА» до 100.

Однако комплексы ртути с цистеином или метионином не обладают противопаразитарным действием, а также не являются модуляторами апоптоза, вследствие чего не способствуют замедлению процесса старения организма.

Что касается способа, то, во-первых, известным способом получают близкие, но не аналогичные комплексы, а во-вторых, способ довольно сложный, нетехнологичный. Это объясняется выдержкой реакционной смеси при более высокой температуре в течение суток.

Средство, описанное в патенте Украины №55308, обладает иммуномодулирующим, противовирусным, противоопухлевым и противоаллергическим действием, однако оно не обладает противопаразитарным действием. Оно также не проявляет свойств модулятора апоптоза.

В основу изобретения поставлена задача создать новые хелатные комплексы ртути с цистеином и метионином, способ их получения и лекарственный препарат - модулятор апоптоза, обладающий противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием.

Поставленная задача решена группой изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно:

1) хелатными комплексами ртути с цистеином и метионином;

2) способом получения хелатных комплексов ртути с цистеином и метионином;

3) лекарственным препаратом, обладающим противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием.

В первом изобретении поставленная задача решена синтезом хелатных комплексов ртути с цистеином формулы C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl либо с метионином формулы C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl.

Во втором изобретении поставленная задача решена тем, что смесь дихлорида ртути с водным раствором цистеина или метионина выдерживают при температуре 35-40°C в течение 60-90 мин, после чего реакционную смесь охлаждают до 18-20°C и выдерживают при этой температуре в течение суток.

При этом при получении хелатного комплекса ртути с цистеином реакционную смесь после выдержки при температуре 18-20°C дополнительно обрабатывают ледяным раствором NaCl в течение 1,5-2,0 час.

В третьем изобретении поставленная задача решена лекарственным препаратом - модулятором апоптоза, обладающим противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием, содержащим комплекс ртути с цистеином или метионином и дистиллированную воду, тем, что в качестве комплекса он содержит хелатный комплекс ртути с цистеином формулы C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl или с метионином формулы C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl при следующем соотношении указанных компонентов, масс.%:

хелатный комплекс ртути с цистеином или метионином 0,38-0,52 дистиллированная вода остальное

При этом лекарственный препарат содержит хелатный комплекс ртути с цистеином в количестве 0,38-0,49 масс.%, а с метионином - в количестве 0,4-0,52 масс.%.

Полученные хелатные комплексы принципиально отличаются от комплексов по патенту Украины №55308 и других соединений аналогичного назначения тем, что:

а) имеют иные структуру, химический состав и молекулярную массу;

б) имеют двойственную химическую природу, т.к, являясь носителем иона Hg²⁺, они одновременно сохраняют свойства серосодержащих аминокислот.

При этом способ получения заявляемых хелатных комплексов значительно проще, т.к. исключает термическую выдержку, отгонку на роторном испарителе, что не требует сложного оборудования. Процесс осуществляется при более низких температурах.

Причинно-следственную связь между заявляемой совокупностью признаков и достигаемым результатом можно объяснить следующим.

Подверженность цистеина окислению, приводящему к утрате им биологической активности, обусловила необходимость создания новых терапевтических форм, обладающих большей устойчивостью. Такими препаратами оказались смешанные соли цистеина, полученные путем прибавления металлов (Mg, Ca) к водному раствору этой аминокислоты. Растворы этих солей обладают более высокой биологической активностью, чем цистеин. Цистеин применяется в фармацевтической промышленности, он используется для улучшения свойств ряда лекарственных препаратов и служит в качестве их стабилизатора (М.С.Садовникова, В.М.Беликов, 1977). Эта задача была сформулирована еще в 1977 году.

Цистеин является предшественником содержащих серу соединений в организме человека и источником серы в процессах детоксикации. Очевидно, что непосредственное участие этой аминокислоты в процессах детоксикации организма является важной предпосылкой для обоснования ее применения при получении различных ртутьсодержащих препаратов и имеет существенное значение для обеспечения безвредности этих препаратов для организма.

Метионин - незаменимая серосодержащая аминокислота, необходимая для роста в развитии молодого организма, поддержания массы тела и азотистого равновесия взрослых особей. При нарушении питания отсутствие метионина является одной из первых причин нарушения процессов синтеза белка в организме. При белковой недостаточности у экспериментальных животных введение метионина быстро устраняет нарушения азотистого обмена. Особая роль метионина в обмене веществ связана с тем, что в его молекуле содержится подвижная метальная группа, которая может передаваться на другие соединения в процессе переметилирования. Так, метионин обеспечивает метальные группы для эндогенного синтеза холина. Он входит в состав молекулы лецитина. С этой способностью метионина связан его липотропный эффект. Метионин не только участвует в синтезе белков и фосфолипидов, он служит источником метальных групп при синтезе цистеина, холина, адреналина, креатина, саркозина, ансерина. Из этой аминокислоты в гепатоцитах синтезируется таурин, таурохолевые кислоты. Метионин способствует синтезу глютатиона в печени. Метионин, цистин и цистеин являются предшественниками всех содержащих серу соединений в организме и источниками серы в процессах детоксикации.

Ртуть и ее соединения способны оказывать многогранное корректирующее воздействие на различные системы организма, обуславливающее ее роль в поддержании гомеостаза. Ионы ртути (Hg²⁺) обладают самой высокой из всех элементов способностью к комплексообразованию с органическими веществами, особенно в случаях, когда в роли лиганда выступает макромолекула, связывающаяся с металлом по нескольким донорным группам (образование хелатных комплексов). Комплекс ртути с аминокислотами является хелатным. Для нормального функционирования организма микроэлементный состав должен быть постоянным, т.е. должен поддерживаться микроэлементный гомеостаз. Обычные микроэлементы, когда их концентрация в организме превышает биотическую концентрацию, проявляют токсическое действие на организм. Токсичные элементы при очень малых концентрациях не оказывают вредного воздействия на растения и животных. Например, мышьяк при микроконцентрациях оказывает биостимулирующее действие. Таким образом, к токсичным элементам относятся химические элементы, оказывающие отрицательное влияние на живые организмы, которое проявляется только при достижении некоторой концентрации, определяемой природой организма. Максимальную токсичность проявляют наиболее химически активные частицы, координационно ненасыщенные ионы, к числу которых следует отнести ионы свободных металлов. Снижение электрофильных свойств иона соответственно приводит к снижению его токсического действия на организм. Хелатрование свободных ионов металла полидентатными лигандами превращает их в устойчивые, более координационно насыщенные частицы, не способные разрушить биокомплексы, а следовательно, малотоксичные. Они мембранопроницаемы, способны к транспортировке и выведению из организма. Таким образом, токсичность элемента определяется его природой, дозой и молекулярной формой, в составе которой находится элемент.

Разносторонний характер воздействия ртути на организм, регуляция важнейших биохимических процессов указывает на перспективность разработки на основе ее соединений новых эффективных лекарственных препаратов. В гомеопатической литературе описан ряд случаев, в которых именно препараты ртути помогали в тяжелых случаях патологии, носящей хронический, не поддающийся лечению характер. Mercurius vivis и solubilis, "dulcis", "corrosivus", "aceticus", "protojodatus", "bidjodatus", "cyanatus", Cinnabaris, Mercurius sulphuricus - вот неполный перечень гомеопатических препаратов ртути. Как следует из вышесказанного, применение ртути является важной частью практики продления жизни, поддержания гомеостаза. Поэтому вполне закономерен интерес к этому элементу и его соединениям как к лекарственным средствам в наше время, в условиях ухудшения экологической обстановки и появления новых опасных видов инфекции, ставящих человечество на грань выживания. Ртуть постоянно присутствует в организме, ее введение в количествах, соответствующих физиологической концентрации, оказывает стимулирующее действие на процессы жизнедеятельности. Биотический эффект ртути определяется ее способностью вступать в обратимые реакции с функционально активными группами биомолекул (пептидов, белков), причем активность этих групп в реакциях со ртутью уменьшается в ряду: -SH>-CONH₂>-NH₂>-COOH>PO₄.

Максимальное сродство ртути к -SH (тиоловым, сульфгидрильным) группам обуславливает приоритетный характер их взаимодействия. Тиоловые группы являются важнейшими функциональными группами белков, они участвуют в формировании их пространственной стуктуры и, соответственно, активных центров путем образования дисульфидных связей (-S-S-) между остатками цистеина в разных участках одной пептидной цепи или в отдельных пептидных цепях белковой молекулы. В то же время, ионы ртути (Hg²⁺) обладают самой высокой из всех элементов способностью к комплексообразованию с органическими веществами, а комплексы переходных элементов, как известно из вышесказанного, являются источниками микроэлементов в биологически активной форме, обладающих высокой мембранопроницаемостью и ферментативной активностью.

Как указывалось выше, учеными разных стран создан ряд препаратов, в которых нашли применение полезные свойства соединений ртути. Поэтому исследования, направленные на получение комплексов ртути, обладающих выраженным противоопухолевым, анальгезирующим, иммуномодулирующим и противовирусным действием, отличающихся в то же время стабильностью состава и, в силу этого, высокой предсказуемостью применения в медицине, остаются актуальными.

Несомненный интерес в этом смысле представляют комплексы ртути с серосодержащими α-аминокислотами, поскольку они, являясь элементами структуры сложных молекул белков, и в виде индивидуальных веществ обладают значительной биологической активностью, что позволяет ожидать комплексного терапевтического эффекта при применении препаратов на их основе.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Получение хелатного комплекса ртути с метионином.

К 40 мл водного раствора 0,02 моля метионина приливают 50 мл водного раствора 2,71 г дихлорида ртути и при интенсивном перемешивании магнитной мешалкой выдерживают при температуре 35°C в течение 90 минут. Осадок выпадает после остывания раствора до температуры 18-20°C, и при этой температуре реакционную смесь оставляют на сутки.

Затем осадок промывают ледяной водой, обрабатывают ацетоном и сушат при комнатной температуре до постоянной массы. Осадок белого цвета, мелкокристаллический, почти аморфный.

Выход 3,48 г или 65% от теоретически возможного.

Молекулярная масса полученного вещества, определенная методом масс-спектрометрии, составляет 532,5 а.е.м. Полученный комплекс имеет формулу C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl.

Результат элементного анализа приведен в таблице 1.

Пример 2. Получение хелатного комплекса ртути с цистеином.

К раствору 2,42 г (0,02 моля) цистеина в 30 мл дистиллированной воды приливают 50 мл водного раствора 2,71 г дихлорида ртути (II) и при интенсивном перемешивании магнитной мешалкой выдерживают при 40°C в течение 60 минут и оставляют при комнатной температуре (18-20°C) на 24 часа. Выпавший осадок отделяют на воронке Бюхнера после выдерживания реакционной массы в течение 2 часов в ледяной смеси с NaCl. Осадок белого цвета, кристаллической структуры. После промывания водой и обработки ацетоном его сушат до постоянного веса.

Выход 3,8 г или 80% от теоретически возможного.

Полученный комплекс имеет формулу C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl. Молярная масса, определенная методом масс-спектрометрии, составляет 476,5 а.е.м.

Ртуть определяли на атомно-адсорбционном спектрометре «Сатурн» (погрешность определения +5%).

Результат элементного анализа приведен в таблице 2.

Пример 3. Лекарственный препарат «Меркурид М» представляет собой водный раствор хелатного комплекса ртути с метионином следующего состава, масс.%:

C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl 0,44 дистиллированная вода 99,56

Пример 4. Лекарственный препарат «Меркурид С» представляет собой водный раствор хелатного комплекса ртути с цистеином следующего состава, масс.%:

C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl 0,38 дистиллированная вода 99,62

Примеры 5-8 иллюстрируют приготовление лекарственных препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С» при различном массовом соотношении компонентов. Данные представлены в таблице 3.

Описание фармакологической активности препаратов

Изучение хронической токсичности препаратов Меркурид М и Меркурид С.

Исполнитель: Украинский НИИ глазных болезней и тканевой терапии им. В.П.Филатова, г.Одесса.

Результат: Препараты Меркурид М и Меркурид С при хроническом применении в 10-кратной терапевтической дозе не вызывают каких-либо токсических изменений в организме крыс. Препараты хорошо переносятся (животные охотно, добровольно его пили), улучшает мотивационные характеристики поведения, внешний вид крыс, что в целом можно охарактеризовать как адаптационно-стимулирующее влияние. Препараты оказали положительное влияние на Т-клеточное звено иммунной системы в виде увеличения числа цитотоксичных Т-лимфоцитов.

Изучение острой токсичности препаратов Меркурид М и Меркурид С.

Исполнитель: Национальный фармацевтический университет, г.Харьков

Результат: В результате исследований установлено, что препараты Меркурид М и Меркурид С по токсичности относятся к классу малотоксичных веществ, 501<LD₅₀<5000 мг/кг.

Противоопухолевое действие

Группа 30 пациентов с целью повышения противоопухолевой резистентности с установленным диагнозом рак (рак легких - 8 человек, рак желудка - 7, рак предстательной железы - 4, рак яичников - 6, рак матки - 5) принимала по 5 мл 3 раза в день перорально препарат в течение месяца за 30 мин до еды. Пациенты сдавали иммунологическое исследование до и после лечения. Пациенты, принимавшие комплекс с цистеином, обозначены - Меркурид С, с метионином - Меркурид М. Результаты сведены в таблице 4. Как видно по результатам представленного исследования, прием препарата способствовал повышению собственных факторов противоопухолевой защищенности организма. 12 пациентов после этого смогли получить более интенсивную химиотерапию, которую хорошо перенесли, без осложнений для организма. 5 была предложена лучевая терапия, которую они ранее не могли получать по состоянию здоровья. У 17 пациентов было отмечено уменьшение размеров опухоли и метастаз от 20 до 40%. Все пациенты отмечали хорошую переносимость препарата, удобство применения, отсутствие побочных эффектов, нормализацию сна, настроения.

Таким образом, прием препарата способствует следующему.

1. Нормализует уровни популяций CD3+(Т-лимфоцитов), CD19+(B-лимфоцитов).

2. Активизирует фагоцитоз.

3. Восстанавливает уровни IgA, IgM, IgG - гуморальных факторов иммунитета.

4. Способствует развитию Th1-зависимого ответа, выполняющего защитную роль при опухолях.

5. Активирует функцию Т-хелперов I типа и подавляет функцию T-хелперов II типа, что проявляется усилением синтеза гамма-интерферона, ИЛ-2, ИЛ-12, ОНФ-a и снижением продукции ИЛ-10.

6. Нормализует антигенпредставляющие функции клеток CD4+.

7. Повышает активность CD 16+ (естественных киллеров) и цитотоксических лимфоцитов CD8+, ответственных за уничтожение поврежденных клеток, неспособных к регенерации и аномальных - злокачественных клеток организма.

8. Повышает количество молекул CD80+, важнейшей костимулирующей молекулы, которая усиливает иммуногенность трансформированных клеток, отменяя тем самым анергию цитотоксических лимфоцитов и, следовательно, повышая цитолиз опухолевых клеток иммунокомпетентными клетками организма.

9. Препарат нормализует выработку ИЛ-2, который повышает цитолитическую функцию T-киллеров и NK-клеток, увеличивает продукцию этими клетками перфоринов и интерферона-гамма, активирует моноциты и макрофаги, которые повышают синтез и секрецию ОНФ-а ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-8.

При лечении злокачественных новообразований данное средство можно применять как препарат-сопровождение при химио- и радиолучевой терапии, что повышает эффективность терапии, благодаря способности препарата защищать здоровые клетки от химического и лучевого поражения. Благодаря наличию свободной -SH группы он обладает выраженным дезинтоксикационным свойством. Это позволяет применять более интенсивные схемы терапии с использованием сильнодействующих химиопрепаратов и облучения в больших дозах. Восстанавливает чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам. Предупреждает выпадение волос, снижает вегетативные, диспептические и болевые синдромы. Способствует нормализации качества жизни, а также восстановлению противоопухолевых функций иммунитета. Увеличивает способность организма самостоятельно уничтожать раковые клетки. Восстанавливает количество лейкоцитов и лимфоцитов, способствует их пролиферации и дифференцировки для развития адекватных иммунологических реакций организма против опухолевых клеток.

Противовирусное действие

Вирус - это внутриклеточный паразит. Препарат позволяет активизировать собственные иммунологические факторы для борьбы с вирусом, и не имеет значения, какой именно вирус атаковал ваш организм. Это может быть вирус герпеса, гепатита. Секреторный IgA (sIgA) действует как первая линия иммунной защиты слизистых, нейтрализующая патогены. Исследования показали, что присутствие секреторного IgA коррелирует с устойчивостью к инфицированию различными патогенами бактериальной, вирусной и грибковой природы.

Секреторный IgA - главный специфический фактор иммунитета слизистых оболочек.

1. Защищает все слизистые оболочки от поселения и проникновения во внутреннею среду организма патогенных микроорганизмов.

2. Секреторный IgA нейтрализует бактериальные токсины, локализует вирусы, стимулирует фагоцитоз, обеспечивая местную резистентность к инфекции.

3. Усиливает антибактериальную, противовирусную защиту организма.

Известно, что в пище, воде, воздухе содержатся различные бактерии, вирусы, которые при попадании в организм могут вызвать его заболевание. Первым барьером, который принимает на себя этот удар, являются слизистые оболочки нашего организма: глаза, полости носа, дыхательных путей, пищеварительный канал и мочеполовые пути. Главным специфическим механизмом защиты является секреторный иммуноглобулин А. Эти антитела располагаются на поверхности слизистых оболочек и служат для нейтрализации бактерий, вирусов, аллергенов, они не дают им проникнуть внутрь организма и развиться болезни.

Группа из 27 пациентов с установленным диагнозом (грипп - 18, вирусный гепатит С - 9 человек) принимала в течении 30 дней по 5 мл препарата перорально, за 30 мин до еды 3 раза в день. До и после лечения было проведено иммунологическое обследование. Пациенты, принимавшие комплекс с цистеином, обозначены - Меркурид С, с метионином - Меркурид М. Результаты указаны в таблице 5.

Как видно по результатам представленного исследования, прием препарата способствовал повышению собственных факторов противовирусной защищенности организма.

1. Препарат нормализует уровни популяций CD3+(T-лимфоцитов), CD 19+(B-лимфоцитов).

2. Активизирует фагоцитоз.

3. Способствует развитию Th1-зависимого ответа, выполняющего защитную роль при вирусных процессах. Активирует функцию Т-хелперов I типа и подавляет функцию Т-хелперов II типа, что проявляется усилением синтеза интерферонов, ИЛ-2, ИЛ-12, ОНФа снижением продукции ИЛ-10.

4. Нормализует антигенпредставляющие функции клеток CD4+.

5. Повышает активность CD16+ (естественных киллеров) и цитотоксических лимфоцитов CD8+, ответственных за уничтожение клеток, инфицированных вирусом.

6. Увеличивая выработку лимфоидными клетками секреторного иммуноглобулина A, который нейтрализует бактериальные токсины, локализует вирусы, стимулирует фагоцитоз, обеспечивая местную резистентность к инфекции.

В группе пациентов с диагнозом «гепатит C», по результатам ПНР исследования плазмы крови, отмечено уменьшение вирусной нагрузки в 10 раз: с 1,7·10⁶ до 1,4·10⁵ РНК HCV копий/мл (тест-система АмплиСенс).

По результатам биохимических исследований, УЗИ печени, селезенки, желчного пузыря отмечена нормализация размеров органов. Прием препарата активизирует процессы регенерации печени, способствует замещению погибших гепатоцитов здоровыми. Проявляет антиоксидантный и мембраностабилизирующий эффект, предотвращает развитие дистрофии, цитолиза и холестаза. Способствует нормализации уровня билирубина и активности трансаминаз в сыворотке крови. Активизируя функции печени, препарат способствует ускорению удаления из организма ксенобиотических агентов и токсических продуктов жизнедеятельности.

Применение препарата эффективно у больных при хронических и рецидивирующих вирусных и бактериальных инфекциях, а также у больных с вторичным иммунодефицитным состоянием, ассоциированным с вирусами герпеса, цитомегаловируса, вирусами гепатита, гриппа.

Иммуномодулирующее действие

Исследования in vitro являются достаточно доказательными и позволяют оценить влияния препаратов «Меркурид» на клеточные субпопуляции и реакцию бласттрансформации (РБТЛ). Это работа выполнена на клинической базе кафедры иммунологии и аллергологии Национального медицинского университета им. А.А.Богомольца, г.Киев, под руководством проф. Дранника Г.Н.

Общеизвестно, что наиболее оптимальны те методы лечения, которые активируют защитные силы самого организма, его адаптивные реакции. Установление жестких схем лечения, обычно с использованием максимальных (ударных) дозировок лекарственных препаратов, не отвечает этой задаче. Перспективно использование для коррекции иммунных нарушений т.н. факторов малой интенсивности. Это особенно актуально, когда надо не подавить, а восстановить. Низкие по силе, но адекватные воздействия имеют то преимущество, что они активируют только нарушенное звено, не затрагивая других, нормально функционирующих систем.

В исследовании приняло участие 30 человек. Женщин - 10 (с диагнозом: хр. бронхит, гастрит, цистит). Возраст от 22 до 57 лет. Средний возраст - 39 лет. Мужчин - 20 человек, с диагнозом: хр. простатит, бронхит. Возраст 21-61. Средний возраст 41 год. Для исследования бралась кровь, определялось число «CD» клеток, методом моноклональных антител, затем добавлялся Меркурид и оценивалась функциональная активность клеток иммунной системы. «Меркурид С» добавлялся донорам крови с нечетным номером, а «Меркурид М» - донорам с четным номером. Полученные результаты сведены в таблицу 6.

Анализ представленных данных показывает, что в случаях, где уровень Т-лимфоцитов на нижней границе нормы, после добавления препарата отмечается повышение содержания T-лимфоцитов. В то же время, при высоком уровне T-лимфоцитов (например, случаи 2, 13 и 18), препарат, наоборот, снижает их содержание. Интересно отметить, что в случае 2, 18 при незначительном снижении высокого уровня T-лимфоцитов происходит значительное повышение патологически сниженного уровня B-лимфоцитов. Здесь же отмечается снижение T-хелперов и повышение T-цитотоксических при снижении бласттрансформационной активности T-лимфоцитов, что отражает явную тенденцию к стимуляции гуморального звена. Очевидная стимуляция гуморального звена иммунной системы в случаях 3, 4, 6 и 8 также сопровождается уменьшением бласттрансформационной активности T-лимфоцитов.

Наиболее заметная бласттрансформационная активность отмечена лишь в случае 1, где увеличение уровня T-лимфоцитов происходит на фоне нормального состояния гуморального звена. При одновременной стимуляции гуморального звена (случаи 3 и 7) бласттрансформационная активность снижается.

Таким образом, можно отметить воздействие препаратов Меркурид на клеточные субпопуляции иммунной системы, имеющее характер мягкой модуляции.

Важным моментом является то, что мы наблюдали активацию лимфоцитов под действием препаратов Меркурид. Активация лимфоцитов - процесс, на котором базируются все иммунологические реакции. Суть активации сводится к переходу клетки в состояние, с которым связаны выполнение функций и проявление специфической активности клетки.

Полученный результат - следствие иммуномодулирующего действия препарата, т.к. из предоставленных данных следует, что объектом коррекции лекарственного средства Меркурид являются только нарушенные показатели иммуногенеза, и этот эффект более выражен там, где есть более значительные изменения. Причем это действие всегда индивидуально и, по-видимому, направлено на реализацию именно тех иммунологических реакций, которые наиболее предпочтительны для конкретного больного.

По результатам проведенных исследований in vivo и in vitro можно сделать вывод, что Меркурид:

- регулирует синтез цитокринов макрофагами (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-альфа) и лимфоцитами (ИЛ-2);

- усиливает фагоцитоз;

- регулирует пролиферацию T-лимфоцитов;

- регулирует пролиферацию ЕК-клеток;

- регулирует синтез антител;

- стимулирует синтез интерферона.

Кроме того, как показали проведенные исследования, препараты Меркурид С и М проявляют особую тропность к слизистым оболочкам и нормализуют выработку основного специфического фактора защиты слизистых - sIgA, а это предопределяет новый механизм корригирующего воздействия на иммунную систему. Основной функцией лимфоидных образований слизистых оболочек является выработка антител - иммуноглобулинов A (IgA), которые попадают в состав секретов, и там, в виде секреторной формы IgA (sIgA) оказывают защитное действие. Эта защита включает опсонизацию и агглютинацию микроорганизмов, бактериостатическое действие, предупреждение адгезии микроорганизмов к эпителию и тем самым проникновения их вглубь слизистых оболочек, а также нейтрализацию бактериальных токсинов, вирусных частиц.

Главные отличия Меркурида от других препаратов, влияющих на иммунитет, следующие.

1. Прием препарата стимулирует иммунный ответ слизистых оболочек, что приводит к мобилизации иммунных клеток не только в слизистой, но и в масштабах всего организма, в то время как стимулирование иммунной системы другими иммунными препаратами способно привести к выработке антител в организме, но может не вызвать ответа слизистых.

2. Объектом воздействия являются только нарушенные показатели иммуногенеза, нормально функционирующие не затрагиваются.

3. Применение препарата носит характер мягкого корригирующего воздействия, не вызывая гиперактивации иммунных клеток, а следовательно, риска истощения клона иммунокомпетентных клеток.

4. Применение препарата способствует пролиферации и дифференцировке иммунных клеток и снижению выработки провоспалительных цитокинов.

Противопаразитарное действие

В организме человека паразита ждет тройной защитный барьер. Первый - ферменты ротовой полости, второй - кислая среда желудка, третий - местный (мукозальный) иммунитет кишечника. В ослабленном организме все эти преграды могут не сработать. Тогда паразиты попадают в кишечник и развиваются в половозрелых особей. Как показали вышеприведенные исследования, прием препарата ведет к активизации выработки sIgA, что будет нарушать процесс проникновения паразита внутрь слизистых. Параллельно идет повышение цитотоксической активности лимфоцитов, естественных киллеров, которые принимают участие в разрушении паразитарных инфекций. Если заражение произошло и пациент принимает антигельминтные препараты, то назначение препарата позволит снизить токсическое действие не только химиопрепарата, но и самого патологического процесса, а также стимулировать собственные факторы противопаразитарной защиты - продукцию ОНФα, который подвергает лизису инвазированные клетки. Механизм действия антигельминтных препаратов направлен на снижение активности возбудителя, и после его гибели иммунная система обеспечивает элиминацию возбудителя. Меркурид, опосредованно через стимуляцию иммунного ответа и повышение фагоцитоза, «помогает» организму избавиться от паразита.

В исследовании приняло участие 16 женщин с диагнозом «токсоплазмоз». Токсоплазмоз - паразитарное заболевание, характеризующиеся хроническим течением, поражением нервной системы, лимфоаденопатией, мезаденитом, поражением миокарда, мышц и глаз. Они принимали препарат Меркурид С и Меркурид М по 5 мл 3 раза в день за 30 мин до еды. Диагноз был установлен клинически и подтвержден иммунологически. Результаты исследования представлены в таблице 7.

Как видно из предоставленных данных, прием препаратов группы Меркурид привел к активации иммунных клеток (частный эффект иммуномодулирующего действия) - увеличение числа лимфоцитов, повышение цитотоксической активности CD8 клеток, литической способности естественных киллеров CD16 клеток, выработке фактора некроза опухоли - белковой молекулы, которая несет приказ о гибели инвазированным клеткам. Повышение фагоцитоза способствовало более эффективной элиминации паразита из организма. Как результат, уменьшение паразитарной инфекции в организме, что подтверждается снижением практически до нормы титра антител к Toxoplasma Gonndii IgG.

Пациентки отметили нормализацию температуры тела (до этого субфебрилитет), практически прекратились головные боли, лимфоузлы в норме. Меньше ощущение слабости, быстрой утомляемости.

Модулирование апоптоза

Апоптоз рассматривается как естественный биологический механизм, который способствует ликвидации "ненужных" клеток и тканей. Биологическая "цель" этого явления состоит в удалении нежелательных клеток в процессе индивидуального развития, при защитных реакциях, старении.

Апоптоз включается в патологии любых ишемических и травматических повреждений нервной ткани, включая повреждения спинного и головного мозга, деменциальные изменения, связанные с развитием болезней Альцгеймера, Паркинсона, сенильной деменцией, врожденными патологиями мозга и др. Таким образом, можно говорить о нейроапоптозе, как новом патобиохимическом механизме нейродегенеративных расстройств широкого спектра.

Существенна роль нейротрофического фактора - фактора некроза опухоли (ОНФα), с которым связаны открытие пор в митохондриях, последующий разрыв их мембраны и высвобождение проапоптических белков.

Ранее была показана способность препарата снижать выработку провоспалительного цитокина ОНФα, что защищает клетки от развития апоптоза.

Апоптоз в кардиоваскулярных клетках

Признаки апоптоза при сердечно-сосудистых патологиях - дисфункция эндотелия, "чрезмерное" напряжение сосудистой стенки, ишемические нарушения, атеросклеротические изменения, инфаркт миокарда, ишемический инсульте и др.

Как известно, патология "гипертонического сердца" сопровождается гипертрофией левого желудочка, ведущей к ремоделированию миокарда, недостаточной васкуляризации, фиброзу, уменьшению числа функциональных кардиомиоцитов и сократительной способности сердца в целом. За все эти явления ответственны апоптозные процессы, спровоцированные хронической ишемией и перегрузкой больного сердца.

Исследования последнего периода показывают, что апоптозная гибель кардиомиоцитов служит решающим фактором в переходе к компенсаторной гипертрофии и нарушению насосной функции сердца при артериальной гипертензии.

Рассматривая проблему апоптоза как сложный биологический и патохимический феномен, можно определить, что апоптоз относится к глобальной информационно-регуляторной сети организма, определяющей его жизнь и смерть.

В настоящее время апоптоз рассматривается как базовый биохимический механизм неврологических, кардиоваскулярных, онкологических и других патологий.

Препарат снижает патологически активный апоптоз

Апоптоз - программированная клеточная гибель, который запускается специфическими сигналами. Этим специфическим сигналом является наличие маркера CD95 на поверхности клеток, что устанавливается лабораторным путем.

В иммунологическом обследовании принимало участие 116 человек, 60 из которых принимали «Меркурид М», а 56 - «Меркурид С» с сосудистыми патологиями мозга (вегетативная дистония, дисциркуляторная энцефалопатия, ишемический инсульт), с последствиями нарушений мозгового кровообращения (двигательные, речевые), дегенеративными заболеваниями нервной системы (болезнь Альцгеймера, Паркинсона), старческой деменцией, которые принимали препарат в течение 30 дней, затем перерыв и снова прием 30 дней по 5 мл перорально. Данные приведены в таблице 8.

Как показали исследования, Меркурид снижает неестественную высокую апоптическую готовность клеток организма, что защищает их от гибели и восстанавливает баланс между апоптозом, который безусловно необходим нам, чтобы избавляться от поврежденных и ослабленных клеток, и возникновением новых жизнеспособных клеток.

Кроме того, исследование показало, что прием препарата способствует корригированию основных иммунологических показателей, которые обеспечивают противоопухолевую и противовирусную защищенность организма. Учитывая, что с возрастом риск развития новообразований увеличивается в сотни раз по сравнению с молодостью, данный факт является дополнительным фактором, влияющим на продолжительность жизни.

87% пациентов, принимавших препарат, отметили его хорошую переносимость, снижение болевых ощущений суставов ног и рук, уменьшение боли в спине. Вероятно, это связано с уменьшением воспалительного процесса за счет снижения выработки провоспалительного цитокина ОНФα. У 78% произошло нормализация сна, повышение жизненных сил, улучшение аппетита, восстановление работы кишечника. 74% мужчин отметили улучшение мочеиспускания, струя стала более свободной, сам акт мочеиспускания безболезненный. 38% пациентов смогли под наблюдением врачей уменьшить дозировки кардиотропных препаратов. 76% отметили, что стали вести более активный образ жизни, больше ходить, меньше уставать.

В целом действие препарата можно охарактеризовать как повышение адаптационно-восстановительного потенциала организма человека. Поскольку апоптоз - фазный процесс и имеет обратимые этапы, то своевременное применение препарата позволяет противостоять чрезмерному развитию апоптоза (который инициируется различными факторами - радиацией, вирусами, неблагополучной экологической ситуацией, загрязненными продуктами питания, некоторыми лекарствами). Прием Меркурида позволяет защитить структуры мозга, сердца, сосудов, мышц от гибели большого массива клеток, а следовательно, смерти всего организма.

Таблица 1 Элементный состав хелатного комплекса ртути с цистеином Химический элемент Расчетное значение Экспериментальное значение Углерод 15,11 15,12 Водород 2,73 2,75 Кислород 13,43 13,41 Сера 13,43 13,44 Азот 5,87 6,0 Ртуть 41,97 41,95 Хлор 7,45 7,50

Таблица 2 Элементный состав хелатного комплекса ртути с метионином Химический элемент Расчетное значение Экспериментальное значение Углерод 22,53 22,50 Водород 3,94 3,90 Кислород 12,02 12,04 Сера 12,02 12,08 Азот 5,26 5,23 Ртуть 37,56 37,60 Хлор 6,67 6,70

Таблица 3 Качественное и количественное соотношение компонентов в лекарственных препаратах «Меркурид М» и «Меркурид С» (масс.%) Номер примера Хелатный комплекс ртути с метионином (Меркурид М) Хелатный комплекс ртути с цистеином (Меркурид С) Дистиллированная вода 5 0,4 - 99,6 6 0,52 - 99,48 7 - 0,44 99,56 8 - 0,49 99,51

Таблица 4 Данные, подтверждающие противоопухолевое действие препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С»   CD3 CD4 CD8 CD16 CD19 CD80 CD4/CD8 IgA IgM IgG Норма 55-70% 40-60% 10-20% 10-20% 6-15% 10-20% 2-4 1-2 0,9-1,2 9-18 До лечения 53±5 44±4 11±4 8±5 13±5 7±3 4,2 3±1 0,7±0,4 16±2 Меркурид С 62±7 51±6 16±3 14±3 12±4 14±4 3,1 1,5±1 1±0,2 14±3 Меркурид М 60±5 53±3 15±2 12±4 14±2 15±3 3,3 1,8±0,7 1±0,4 16±2 * CD - современная методика фенотипирования лимфоцитов (метод моноклональных антител).

Таблица 5 Данные, подтверждающие противовирусное действие препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С»   CD3 GD4 CD8 CD16 CD19 CD4/CD8 sIgA, г/л Фагоцитоз Норма 55-70% 40-60% 10-20% 10-20% 6-15% 2-4 0,4-0,8 40-95% До лечения 57±3 42±3 9±4 9±2 13±2 5,2 0,38±0,04 42±12 Меркурид С 64±5 48±4 14±2 15±3 14±1 3,5 0,52±0,02 65±11 Меркурид М 61±4 54±2 12±3 14±2 12±2 3,2 0,61±0,03 72±8 * CD - современная методика фенотипирования лимфоцитов (методом моноклональных антител).

Таблица 6 Данные, подтверждающие иммуномодулирующее действие препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С» N п/п донор «+» меркурид донор «+» меркурид донор T CD3 (40-60%) T CD3 (40-60%) B CD22 (15-30%) B CD22 (15-30%) Tx CD4 (30-40%) 1 42 46 18 18 23 2 60 59 9 27 28 3 40 43 17 25 25 4 44 42 17 22 28 5 48 37 22 14 24 6 48 51 18 26 23 7 42 46 22 13 23 8 58 56 15 17 35 9 51 57 21 29 31 10 62 51 38 29 39 11 55 50 32 26 25 12 38 47 16 24 21 13 61 54 11 23 27 14 46 42 18 26 25 15 40 55 15 28 27 16 57 51 14 16 37 17 40 46 16 25 23 18 64 58 10 16 27 19 41 52 18 27 27 20 44 46 23 19 34 21 58 61 15 18 36 22 51 47 17 27 38 23 43 56 19 25 28 24 57 49 10 22 25 25 38 41 14 17 21 26 47 54 21 27 28 27 55 57 24 27 27 28 48 53 17 24 25 29 40 54 18 22 27 30 42 57 20 27 21

Таблица 6 (продолжение) N п/п «+» меркурид донор «+» меркурид донор «+» меркурид Тх CD4 (30-40%) Тс CD8 (15-20%) Тс CD8 (15-20%) РБТЛ РБТЛ 1 22 19 23 0,040 0,051 2 21 24 38 0,033 0,028 3 23 15 18 0,041 0,037 4 22 16 17 0,056 0,042 5 26 22 16 0,037 0,041 6 25 21 15 0,067 0,059 7 20 17 19 0,049 0,045 8 30 23 18 0,053 0,050 9 34 20 23 0,047 0,052 10 32 28 18 0,051 0,058 11 31 14 16 0,031 0,046 12 35 11 15 0,061 0,057 13 31 21 20 0,034 0,029 14 32 17 15 0,054 0,048 15 41 18 21 0,044 0,054 16 31 24 19 0,057 0,051 17 29 14 18 0,044 0,051 18 36 27 22 0,032 0,025 19 38 14 18 0,046 0,055 20 31 18 17 0,042 0,039 21 38 30 23 0,056 0,061 22 32 23 21 0,046 0,055 23 36 14 21 0,037 0,042 24 29 27 20 0,041 0,037 25 32 17 21 0,049 0,054 26 35 19 15 0,035 0,042 27 31 24 20 0,054 0,059 28 37 22 24 0,047 0,051 29 31 13 19 0,039 0,044 30 32 17 23 0,052 0,059

Таблица 7 Данные, подтверждающие противопаразитарное действие препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С»   CD3 CD4 CD8 CD16 ОНФα пг/мл Toxoplasma Gonndii IgG Фагоцитоз Норма 55-70% 40-60% 10-20% 10-20% 15-22 POS<40/ME/мл 40-95% До лечения 59±3 45±4 11±3 10±3 16±4 230±23 48±12 Меркурид С 65±3 493 14±3 14±2 21±2 48±7 62±9 Меркурид М 63±4 52±2 13±2 12±3 22±3 51±5 69±5

Таблица 8 Данные, подтверждающие свойства модулятора апоптоза у препаратов «Меркурид М» и «Меркурид С»   CD95 CD3 CD4 CD8 CD16 CD19 CD4/CD8 ОНФα пг/мл   0-8% 55-70% 40-60% 10-20% 10-20% 6-15% 2-4 15-22 До лечения 28±4 59±4 46±3 9±4 7±2 14±3 4,8 36±3 Меркурид М 14±2 61±3 51±2 14±2 12±3 13±1 3,7 24±2 Меркурид С 11±3 62±4 54±4 12±5 11±2 10±2 3,5 21±3

Изобретение относится к хелатным комплексам ртути с цистеином формулы C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl или метионином формулы C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl, которые обладают противоопухолевым, противовирусным, противопаразитарным и иммуномодулирующим действием. Изобретение также относится к способу получения указанных выше комплексов, который включает взаимодействие дихлорида ртути с водным раствором цистеина или метионина, выдерживание смеси при температуре 35-40°С в течение 60-90 мин, охлаждение реакционной смеси до 18-20°С и выдержку при этой температуре в течение суток. Изобретение также относится к лекарственному препарату - модулятору апоптоза, обладающему противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием, который содержит 0,38-0,52 масс.% хелатного комплекса ртути с цистеином или метионином и дистиллированную воду. Изобретение обеспечивает получение новых хелатных комплексов ртути, обладающих противоопухолевым, противовирусным, противопаразитарным и иммуномодулирующим действием, а также упрощенный способ их получения, осуществляемый при более низких температурах. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл., 8 пр.

1. Хелатные комплексы ртути с цистеином формулы C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl или метионином формулы C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl, обладающие противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием.

2. Способ получения хелатных комплексов ртути с цистеином и метионином по п.1, включающий взаимодействие дихлорида ртути с водным раствором цистеина или метионина, выдержку реакционной смеси при повышенной температуре, отделение осадка, обработку его ацетоном и сушку до постоянного веса, отличающийся тем, что смесь дихлорида ртути с водным раствором цистеина или метионина выдерживают при температуре 35-40°С в течение 60-90 мин, после чего реакционную смесь охлаждают до 18-20°С и выдерживают при этой температуре в течение суток.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при получении хелатного комплекса ртути с цистеином реакционную смесь после выдержки при температуре 18-20°С дополнительно обрабатывают ледяным раствором NaCl в течение 1,5-2,0 ч.

4. Лекарственный препарат - модулятор апоптоза, обладающий противоопухолевым, противовирусным, иммуномодулирующим и противопаразитарным действием, содержащий комплекс ртути с цистеином или метионином и дистиллированную воду, отличающийся тем, что в качестве комплекса он содержит хелатный комплекс ртути с цистеином формулы C₆H₁₃O₄N₂S₂HgCl или с метионином формулы C₁₀H₂₁O₄N₂S₂HgCl при следующем соотношении указанных компонентов, мас.%:
хелатный комплекс ртути с цистеином или метионином 0,38-0,52 дистиллированная вода остальное

5. Лекарственный препарат по п.4, отличающийся тем, что хелатный комплекс ртути с цистеином он содержит в количестве 0,38-0,49 мас.%.

6. Лекарственный препарат по п.4, отличающийся тем, что хелатный комплекс ртути с метионином он содержит в количестве 0,4-0,52 мас.%.