СЕЛЕКТИВНАЯ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЭКСПОНИРУЕМЫХ ФАГАМИ ПОЛИПЕПТИДОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N7/01 C12N15/00 C12P21/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области биохимии и касается посттрансляционной модификации экспонируемых бактериофагом полипептидов. Такие экспонируемые полипептиды включают, по меньшей мере, одну неприродную арилазид-аминокислоту, такую как, например, пара-азидо-L-фенилаланин, которая встраивается в экспонируемый фагом гибридный полипептид в выбранном положении с применением ортогональной системы трансляции in vivo, включающей подходящую ортогональную аминоацил-тРНК-синтетазу и подходящую ортогональную тРНК. Представленное изобретение позволяет осуществлять модификацию белка при физиологических условиях, в которых сохраняется активность и жизнеспособность фага. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 пр.

1. Жизнеспособный бактериофаг для экспонирования селективно модифицированных полипептидов, содержащий полипептид, при этом указанный полипептид включает по меньшей мере один посттрансляционно модифицированный неприродный арилазид-аминокислотный остаток, в котором указанный посттрансляционно модифицированный неприродный арилазид-аминокислотный остаток получен путем реакции лигирования Штаудингера.

2. Бактериофаг по п.1, отличающийся тем, что указанный бактериофаг представляет собой нитевидный бактериофаг.

3. Бактериофаг по п.1, отличающийся тем, что указанный бактериофаг является производным бактериофага М13.

4. Бактериофаг по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой гибридный полипептид.

5. Бактериофаг по п.4, отличающийся тем, что указанный гибридный полипептид включает пептидный линкер, включающий последовательность аминокислот, которую узнает и расщепляет протеаза.

6. Бактериофаг по п.5, отличающийся тем, что указанную протеазу выбирают из фактора Ха, фактора ХIа, калликвеина, тромбина, фактора ХIIа, коллагеназы и энтерокиназы.

7. Бактериофаг по п.1, отличающийся тем, что указанный неприродный арилазид-аминокислотный остаток представляет собой остаток пара-азидо-L-фенилаланина.

8. Бактериофаг по п.1, отличающийся тем, что указанный бактериофаг очищен или выделен.

9. Бактериофаг по п.1, в котором указанный посттрансляционно модифицированный неприродный арилазид-аминокислотный остаток включает:
,

с) амидный фрагмент и фосфиноксидный фрагмент.

10. Фаговая библиотека для экспонирования множества полипептидов, включающая множество жизнеспособных бактериофагов по п.1, иммобилизованных на твердой подложке, где каждый бактериофаг включает полипептид, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере один пост-трансляционно модифицированный неприродный арилазид-аминокислотный остаток, и указанный пост-трансляционно модифицированный неприродный арилазид-аминокислотный остаток получен с применением реакции лигирования Штаудингера.

11. Фаговая библиотека по п.10 для экспонирования множества различных полипептидов.

12. Фаговая библиотека по п.10, включающая множество бактериофагов, которые экспонируют множество различных полипептидов.

13. Способ получения жизнеспособного посттрансляционно модифицированного бактериофага по п.1, включающий:
(а) обеспечение бактериофага, включающего полипептид, где указанный полипептид включает по меньшей мере один неприродный арилазид-аминокислотный остаток; и
(б) проведение реакции указанного неприродного арилазид-аминокислотного остатка с применением реакции лигирования Штаудингена, с получением таким образом жизнеспособного посттрансляционного модифицированного бактериофага.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один неприродный арилазид-аминокислотный остаток представляет собой остаток пара-азидо-L-фенилаланина.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная стадия обеспечения включает:
(i) обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, включающей:
A) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный бактериофаг, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит подпоследовательность полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, при этом указанная подпоследовательность полинуклеотида включает по меньшей мере один селекторный кодон;
Б) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминоацил-тРНК-синтетазу, которая является ортогональной по отношению к указанной клетке-хозяину (О-РС);
B) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тРНК, которая является ортогональной по отношению к указанной клетке-хозяину (O-тРНК), при этом указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную О-тРНК с помощью указанной неприродной аминокислотой в указанной клетке-хозяине, причем указанный селекторный кодон распознает вышеуказанная О-тРНК; и
Г) неприродную арилазид-аминокислоту; и
(ii) культивирование указанной клетки-хозяина с получением таким образом полипептида, кодируемого указанной подпоследовательностью полинуклеотида, где указанная неприродная арилазид-аминокислота встраивается в ходе трансляции в указанный полипептид в ответ на селекторный кодон, и получение фага, содержащего полипептид, кодируемый указанной подпоследовательностью полинуклеотида, где указанная неприродная арилазид-аминокислота встроена в указанный полипептид.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная стадия обеспечения включает обеспечение клетки-хозяина E.coli.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная стадия обеспечения включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую О-РС, где указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК-синтетазы Methanococcus jannaschii.

18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная стадия обеспечения включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую О-РС, где О-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

19. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная стадия обеспечения включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую О-тРНК, где указанная О-тРНК представляет собой супрессорную тРНК, распознающую амбер-кодон.