СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ КОМПОНЕНТОВ ОРТОГОНАЛЬНОЙ ТРАНСЛЯЦИИ В ЭУБАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ-ХОЗЯИНЕ Российский патент 2012 года по МПК C12N15/70 C12N1/21 C12P21/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения белков с новыми свойствами, которые определяются включением в заранее заданное положение не встречающихся в природе аминокислот. В изобретении раскрывается композиция для коэкспрессии в эубактериальной клетке-хозяине ортогональной тРНК (О-тРНК) и ортогональной аминоацил-тРНК синтетазы (О-РС), которая предпочтительно аминоацилирует указанную О-тРНК интересующей неприродной аминокислотой. Композиция по изобретению состоит из двух конструкций нуклеиновой кислоты: первая конструкция содержит последовательности промотора и терминатора из гена пролин-тРНК Е coli. и происходящую из архей экспрессируемую последовательность, которая кодирует одну О-тРНК или представляет собой полицистронный оперон, а вторая конструкция содержит модифицированный промотор glnS E.coli и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую О-РС. Описаны система трансляции, включающая векторные конструкции по изобретению, и способ получения представляющего интерес полипептида, содержащего не встречающуюся в природе аминокислоту в генетически определенном положении. 6 н. и 48 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.

1. Композиция для совместной экспрессии О-тРНК И О-РС, включающая:
(a) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной экспрессируемой последовательностью, а указанная экспрессируемая последовательность происходит из Архей и является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора; и
(b) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность промотора, соответствующую модифицированному промотору glnS E.coli, которая имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:13, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем указанная модифицированная нуклеотидная последовательность промотора glnS E.coli функционально соединена с указанной экспрессируемой последовательностью; при этом конструкция (а) содержит экспрессируемые нуклеотидные последовательности, выбранные из: (c1) и (d), a (b) содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность (с2), где
(c1) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (О-тРНК);
(с2) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), где указанная О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную О-тРНК путем присоединения к ней невстречающейся в природе аминокислоты;
(d) представляет собой один или более полицистронных оперонов, причем полицистронный оперон содержат множество нуклеотидных последовательностей генов тРНК, где по меньшей мере один ген тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера от природного тРНК оперона.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген пролин-тРНК Е. coli выбран из генов тРНК Е.coli: proK, proL и proM.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е. coli получены из последовательностей промотора и терминатора proK E.coli, представленных в SEQ ID NOS:32 и 33, соответственно.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество из одной или более нуклеотидных последовательностей.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует тРНК.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная тРНК получена из одной или более тРНК Архей.

7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанную тРНК кодирует нуклеотидная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).

8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).

9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность содержит множество указанных полицистронных оперонов.

10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; предпочтительно, указанная О-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

11. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в указанной О-РС присутствует замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (MjtRNA-Tyr PC дикого типа).

12. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.

13. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, где по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.

14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) полицистронный оперон содержит нуклеотид тимидин на 5′-конце, нуклеотид аденозин на 3′-конце, или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.

15. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.

16. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный в (d) гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).

17. Клетка-хозяин, экспрессирующая О-РС и O-tRNA, которая содержит композицию по п.1 в виде одного или двух векторов.

18. Клетка-хозяин по п.17, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяин, которая предпочтительно представляет собой клетку Е. coli.

19. Система трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который содержит по меньшей мере одну невстречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении, включающая:
(a) невстречающуюся в природе аминокислоту;
(b) композицию по п.1; и
(c) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается О-тРНК композиции, указанной в (b), причем положение указанного селекторного кодона в указанном полинуклеотиде определяет заданное положение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в полипептиде, представляющем интерес, при экспрессии указанного полинуклеотида с получением указанного полипептида.

20. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный ген пролин-тРНК Е. coli выбран из генов тРНК: proK, proL и proM.

21. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е.coli получены из последовательностей промотора и терминатора proK Е. coli, представленных в SEQ ID NOS:32 (промотор) и 33 (терминатор), соответственно.

22. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.

23. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.

24. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в композиции, указанной в (b) указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер содержит нуклеотид тимидин на 5′-конце или нуклеотид аденозин на 3′-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.

25. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.

26. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).

27. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-тРНК получена из одной или более тРНК Архей.

28. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих О-тРНК.

29. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).

30. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая О-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).

31. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

32. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции указанная О-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

33. Система трансляции по п.19, отличающаяся тем, что в указанной в (b) композиции в указанной О-РС присутствует замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа).

34. Система трансляции по п.19, включающая клетку-хозяина, содержащую (a), (b), (c1) и (с2) композиции, указанной в п.1.

35. Система трансляции по п.34, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяина, предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Е.coli.

36. Способ получения в клетке-хозяине представляющего интерес полипептида, содержащего в заданном положении невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий:
(a) обеспечение
(i) невстречающейся в природе аминокислоты;
(ii) композиции по п.1; и
(iii) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение селекторного кодона соответствует заданному положению указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде;
(iv) клетки-хозяина, которая содержит (i), (ii) и (iii);
(b) культивирование указанной клетки-хозяина; и
(c) включение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина с получением, таким образом, указанного представляющего интерес полипептида, содержащего указанную невстречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-тРНК, полученную из одной или более тРНК Архей.

38. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение полицистронного оперона, который содержит множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более разновидностей О-тРНК.

39. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-тРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA).

40. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1 (MjtRNA-Tyr (CUA)).

41. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, полученную из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

42. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, полученную из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii.

43. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей О-РС, которая содержит замену аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO:2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа).

44. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Escherichia coli, выбранной из тРНК Е.coli: proK, proL and proM tRNA.

45. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение, конструкции нуклеиновой кислоты в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин- тРНК Escherichia coli, которые содержат последовательности промотора и терминатора proK E.coli, соответствующие SEQ ID NO:32 (промотор) и SEQ ID NO:33 (терминатор), соответственно.

46. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение множества идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров.

47. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение множества гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два указанных гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются.

48. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, содержащего нуклеотид тимидин на 5′-конце, нуклеотид аденозин на 3′-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5′-конце и нуклеотид аденозин на 3′-конце.

49. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (ii), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV; valV и valW; glyT и thrT; metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX; alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ.

50. Способ по n. 36, отличающийся тем, что указанное обеспечение полицистронного оперона в композиции, указанной в (и), включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:14 (valU/valX линкер) или SEQ ID NO:15 (ileT/alaT линкер).

51. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина, предпочтительно, указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение клетки-хозяина Escherichia coli.

52. Способ получения системы трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит по меньшей мере одну невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий обеспечение:
(a) невстречающейся в природе аминокислоты;
(b) композиции по п.1; и
(c) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона в указанном полинуклеотиде определяет указанное заданное положение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде при экспрессии указанного полинуклеотида с образованием полипептида.

53. Способ по п.52, согласно которому обеспечивают клетку-хозяина, которая содержит (а), (b) и (с).

54. Способ получения представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит невстречающуюся в природе аминокислоту, включающий:
(а) обеспечение системы трансляции, включающей
(i) невстречающуюся в природе аминокислоту;
(ii) композицию по п.1;
(iii) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной О-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона соответствует указанному заданному положению указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде;
(iv) клетку-хозяина, содержащую (i), (ii) и (iii);
(b) культивирование указанной клетки-хозяина; и
(c) включение указанной невстречающейся в природе аминокислоты в указанное заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина с получением, таким образом, указанного представляющего интерес полипептида, содержащего указанную невстречающуюся в природе аминокислоту в указанном заданном положении.