ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ КУМАРИНОВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ Российский патент 2013 года по МПК C12N15/54 C12N9/10 C12N15/74 C12P21/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к способам трансляции белка, и может быть использовано в различных тест-системах, предназначенных для детектирования соединений полипептидной природы. Предложена ортогональная пара, включающая тРНК (О-тРНК) и аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), в которой О-тРНК является супрессорной тРНК, распознающей амбер-кодон, а О-РС представляет собой мутантную форму тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus janaschii, предпочтительно аминоацилирующую указанную тРНК неприродной аминокислотой L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицином. Описана система трансляции, обеспечивающая введение в любое выбранное положение интересующего белка, синтезируемого в этой системе, неприродной аминокислоты L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицина, которая включает ортогональную пару по изобретению, названную неприродную аминокислоту и нуклеиновую кислоту, которая кодирует представляющий интерес белок и содержит в выбранном положении селекторный кодон, распознаваемый О-тРНК. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 пр.

1. Система трансляции, включающая
(a) первую неприродную аминокислоту, которая представляет собой неприродную аминокислоту L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицин;
(b) первую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:2, или консервативный вариант указанной последовательности, при этом SEQ ID NO:2 или консервативный вариант указанной последовательности дополнительно содержит Glu в положении, соответствующем Tyr32; His в положении, соответствующем Leu65; Gly в положении, соответствующем His70; Tyr положении, соответствующем Phe108; His в положении, соответствующем Gln109; Gly в положении, соответствующем Asp158; и Gly положении, соответствующем Leu162; и
(c) первую ортогональную тРНК (О-тРНК), кодируемую последовательностью SEQ ID NO:1,
причем указанная первая О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную первую О-тРНК указанной первой неприродной аминокислотой.

2. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-РС получена из аминоацил-тРНК-синтетазы Methanococcus jannaschii.

3. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-тРНК представляет собой супрессорную тРНК, распознающую амбер-кодон.

4. Система трансляции по п.1, которая дополнительно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, причем указанная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один селекторный кодон, который распознает указанная первая О-тРНК.

5. Система трансляции по п.4, дополнительно содержащая вторую О-РС и вторую О-тРНК, причем указанная вторая О-РС предпочтительно аминоацилирует вторую указанную О-тРНК второй неприродной аминокислотой, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная вторая О-тРНК распознает селекторный кодон, отличный от селекторного кодона, распознаваемого указанной первой О-тРНК.

6. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-РС и указанная первая О-тРНК указанной системы экспрессируются в клетке-хозяине, при этом указанная клетка-хозяин представляет собой клетку эубактерии.

7. Система трансляции по п.6, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку E.coli.

8. Система трансляции по п.6, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-РС, и полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-тРНК.

9. Способ получения в системе трансляции белка, содержащего неприродную аминокислоту в выбранном положении, который включает:
(а) обеспечение системы трансляции, содержащей
(i) первую неприродную аминокислоту, которая представляет собой неприродную аминокислоту L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицин,
(ii) первую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO:2, или консервативный вариант указанной последовательности, при этом SEQ ID NO:2 или консервативный вариант указанной последовательности дополнительно содержит Glu в положении, соответствующем Tyr32; His в положении, соответствующем Leu65; Gly в положении, соответствующем His70; Tyr положении, соответствующем Phe108; His в положении, соответствующем Gln109; Gly в положении, соответствующем Asp158; и Gly положении, соответствующем Leu162;
(iii) первую ортогональную тРНК (О-тРНК), кодируемую последовательностью SEQ ID NO:1, и
(b) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, причем указанная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один селекторный кодон, распознаваемый указанной первой О-тРНК;
(c) обеспечение трансляции указанного белка;
(d) выделение указанного белка.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii, или тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанное обеспечение системы трансляции включает обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную О-тРНК.

12. Способ по п.9, в котором указанный белок дополнительно содержит вторую неприродную аминокислоту, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная система трансляции дополнительно содержит вторую О-РС и вторую О-тРНК, причем указанная вторая О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную вторую О-тРНК второй неприродной аминокислотой, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная вторая О-тРНК распознает селекторный кодон в нуклеиновой кислоте, который отличен от селекторного кодона, распознаваемого первой О-тРНК.

13. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная первая О-РС и указанная первая О-тРНК указанной системы трансляции экспрессируются в клетке-хозяине, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок, и при этом указанная клетка-хозяин представляет собой клетку эубактерии.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Е.coli.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-РС, и полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-тРНК.

16. Аминоацил-тРНК синтетаза, содержащая последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO:4, или консервативный вариант указанной последовательности.

17. Полинуклеотид, кодирующий ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС) по п.16.

18. Полинуклеотид по п.17, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, соответствующую SEQ ID NO:5.

19. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.17.

20. Клетка-хозяин для получения белка, содержащего неприродную аминокислоту, содержащая вектор по п.19.