Способ иммобилизации микросом печени Советский патент 1983 года по МПК C12N11/18 C12N9/02 

О

ел

сд

со

Од Изобретений относится к биотехнопоги вчастности к.способам получения иммобипвзованных макросом паче ни. животных и может найти применение в медицине, биохимии (иммобилизованные таким образом микросомы могут служить удобной моаепью дпя изучения метаболизма лекар ственных препаратов), в аналитической промышпенности (дпя создания ферментных электродов) и тонком органическом синтезе (дпя получения органических веществ, таких как гидроксилированные стероиды, жирные кислоты, 1,4-бевздиаз Т1И -2-оны). В этих цепях целесообразно использовать не только отдельные ферменты, но и фракцию микросом печени животных, так как это дает возможность устранить сложные дорогостоящие процессы выделения и очистки исходных ферментов и проводить сложные ферментативные реакции одностадийно. Известен способ иммобилизации микро сом печени на неорганической матрице (силохроме) с помощью бифункционально сшивающего реагента (хлористого цианур и 2,4-толуиленпиизоцианата) ll . Однако получаемый этим способом про дукт обладает лишь эстеразной активност и не проявЕ эт монооксигеназной активности. Наиболее близок к предлагаемому спо соб иммобилизации икросом печени, заключающийся в ковалентном связывании их с матрицей ( ВР CN ) активированной сефарозой. При этом процесс ведут при рН 7,4-7,7, а при иммобилизации моногоксигеназная система разделяется на компоненты : цитохром Р-450, НАДФН зависимую редуктазу и фосфатидилхопин, а затем компоненты в любой последовательности или одновременно фиксируют на матрице (при этом один или два комп нента могут оставаться в растворе в растворимом состоянии) 2 . Необходимость разделения моноокс геназной системы микросом печени на к компоненты (ци.тохром Р-45О,НАДФН зависимую редуктазу и фосфатидилхолин) перед иммобилизацией для получения стабильного продукта, обладающего актив- ностью, так как при иммобилизации самой системы микросом наблюдается полное отсутствие монооксигеназной акти&ности, значительно усложняет процесс, требуя обработки ультразвуком, холатом и дезоксихопатрм натрия и применения метода колоночной хроматографии. Монооксигеназная активность иммобилизованных указанным способом реконструированных систем низкаг при иммобилизации цитохрома Р-45О (растворимая НАДФН зависимая редуктаза и фосфатицилхолин) она составляет всего ЗО% от исходной, а при иммобилизации НАДФН - зависимой редуктазы (растворимые цитохром Р-450 и фосфагидилхолин) сохраняется 26-40% монооксигенаэной активности (определена по реакции N -деметилирования). Стабильность полученной таким образом монооксигеназной системы невысока, так как через 72 ч остается всего 7% исходной активности. Таким образом, известный способ не обеспечивает достаточно высокой монооксигеназной активности и стабильности иммобилизованных микросом. Цель изобретения - повышение монооксигеназной активности и стабильности иммобилизованных микросом. Указанная цель достигается cor лас-, но способу иммобилизации- микросом печени путем ковалентного связывания их с с матрицей, в качестве матрицы используют попиэтипен с 6-10% привитой полиакриловой кислоты и процесс ведут в присутствии карбодиимнда при соотношении карбодиимвд - полиэтилен с привитой полиакриловой кислотой 1: 5-1:12. Процесс осуществляют- при рН 7,2-7,6. Предлагаемый способ позволяет получать нерастворимые микросомы, отличающиеся вЪ1сокой монооксигеназной активностью и стабильностью. Функциональные группы легко модифи цируются из-за рыхлой упаковки привито го функционального покрова(полиакриповой кислоты), функциональные группы которого доступны для взаимодействия с сшивающими реагентами по всей глубине привитогсз слоя, а специфический эффект повышения монооксигеназной активности иммобилизованнь к микросом, вероятно, связан с созданием особых мягких условий иммобилизации в тонком при поверхностном слое, доступном дпя субстрата, привитой полиакриловой кислотой,т.е. данные полш«1ерные носители сочетают в себе преимущества линейных гомополимеров и трехмерю.1х полилигандов. Применение полиэтиленов с количеством полиакриловой кислоты меньшим 6% нецелесообразно, так как резко (до 50% от от максимальной) уменьшается мовоокси- геназная активность иммобилизованных микросом. Увеличение количества при витой полиакриловой кислоты более 1О% на позволяет создать однородного (по кол1Г1еству функциональных групп) носи- тепя. Поэтому испопьзуют попиэтипен с 6-10% привитой попиакриповой киспоты. В процессе испопьзуют ОД М К фатный буфер с ОДМ КСе ; 1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитопа на 2О%ном глицерине по объему в интервале рН 7,2-7,6, так как при значениям рН (табп. 1) сохранение монооксигеназной активности иммобипизованных микросом максимально. Весовое соотношение растворимый карбоаиимид - полиэтилен с привитой ; полиакриловой кислотой можно вариировать от 1:5 до 1:12, дальнейшее его изменение уменьшает мовооксигеназную активность иммобилизованных микросом (табл. 2). Иммобилизация проводится при 5°С в течение 24 ч.Пблученные препараты иммобилизованных микросом обладают значительной активностью по анилину, диметиланилину, амидопирину и этилморфину, так как сохранение активности по анилину составило 25% (этот вид и все последующие в прототипе полностью отсутствовали), а при определении активности иммобилизованных микросом печени по диметиланилину, амидопирину и этилморфину наблюдалось значительное увеличение активности (по сравнению с исходной): 116; 197; 8; 1бО% соответственно. Иммобилизованные предлагаемым способом микросомы печени оказались ста бильными при хранении при 5 С в течени 4 недель. Микросомы выделяют из печени белых крыс и кропиков согласно известной методике 3 , активность по анилину, диме типанилину, амидопирину, этилморфину также определяли по 3j Выход микросо мального белка 21,7 мг/г содер жание аитохрома Р-45О 2,75 нмоль/мг белка, активность по анилину 3,9 нмоль субстрата/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37°С, активность по диметиланилину 49,7 имоль субстрата-нмопь цитохрома Р-.450 в мин при , активность по амидопирину 13,9 нмоль субстрата/нмоп цитохрома Р-450 в мин при З7с, активность по этилморфину 5,5 нмоль субстрата-нмоль цитохрома Р-450 при 37 в мин. Пример l.lOr полиэтилена с привитой полиакриловой кислотой (6-10% суспендируют в 50 мл 0,1М К-фосфатно буфера (с 0,1М kC ; 1 мМ ЭДТА и . 1 мМ дитиотреитопа на 2О% глицерине объему, рН 7,2) растворимого карбоди имида (1,0 г), затем добавляют суспен1064 зию микросом (1 г бепка), доводят объем до 1ОО МП вышеуказанным буфером в встряхивают реакционную смесь 24 ч при . Препарат отфильтровывают, затем промывают следующими буферными растворами:1.2 п 0,1М К-фосфатного буфера с О,5 М КС1,1 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола на 20% глицерине по объему рН 7,2. 2.2 п 0,1 М К-фосфатного буфера с 1 мМ дитиотрентопа на 20% гпвпервве и хранят при 5°С. Активность по анипину 0,967 вмопь субстрата/нмопь цитохрома Р-450 в мин при 37°С (сохранение актввностн 25%). Активность по диметипанипину- , 57,4 нмоль субстрата/нмопь цвтохрома Р-450 в мин при (сохранение активности 116%). Активность по амидо f пирину 27,6 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Р-450 в мин при 37С (сохравение активности 197,8%). Активность по этилморфину 8,8 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Р-45О в мин прц З7с (сохранение активности 16О%). После 4 недепь хранения прв иммобилизованных микросом актввно ::ть по анилину составляет 10О%, а по двметиланилину 74% (от опредепениэй сразу после иммобилизации). Таким же образом проводят иммобилизацию фракции микросом на попиэт лене с привитой полиакриловой кислотой (6-10%) с тем же буфером, только при рН 7,4.и 7,6. Получают аналогичные результаты. Пример 2. Юг полиэтилена с привитой полиакриловой кислотой (6-1О%) суспендируют в 5О мл 0,1 М К-фосфатного буфера (0,1М КС1, 1 мМ ЭДТА в 1 мМ дитиотреитола на 20% глицерине по объему, рН 7,2) растворимого карбодиимида (0,8 г), затем добавляют суспензию микросом (1 г белка).. После этого все операции выполняют аналогичво примеру 1. Активность по анилину 0,92 нмоль субстрата/нмопь цитохрома Р-45О в мвн при (сохранение активности 24%). Активность по пвметиланилину 54,5 нмопь субстрата/шлопь аитохрома Р-4.50 в мин прв (сохравение активности 110%). Активность по амидопирину 26.2 нмопь субстрата/нмояь цвтохрома Р-450 в мин прв ( сохранение активности 19О%) Активность по этилморфину 8,4 нмопь субсграна/нмопь цитохрома Р-45О в мин при 37°С (сохранение активности 152%). Поспе 4 неаепь хранения при вммобипвзованш 1х микросом активность по анвпину составпяет 1ОО%, а по диметвпанипину 75% (от опреаепенной сразу notne иммобвпизации). Таким же обозом провоаят иммобилизацию фракции микросом на попиэтипене с привитой попиакриповой кислотой (6Сохранение монооксиге{шзной активности иммобилизованных при различных значениях рН микросом на полиэтилене с привитой полиакриловой кислотой (субстрат аиметиланилин).

Монооксигеназная активность микросом иммобилизованных, % от исходной, при рН 105

Таблица 1 36 анапогичными соотношениями всех компонентов, топько с 1,2 г растворимого карбоаиимида. Получают аналогичные результаты. Аналогично примеру 1 при указанных в примере 2 количествах растворимого карбодиимида Проводят аммобипизаиию фракции микросом при рН 7,4 и 7,6. Получают результаты, аналогичные приведенным в примере 2.

) 1. СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем ковапентного связывания их с матрицей, от пинающийся тем, что, с пепью повышеиия монооксвгеназной активности в стабильности 1а 1мобипизоваввых мнкросом, в качестве матрицы используют поввэтвлен сб-1О% привитой попиакрвповой кислоты- и процесс вецут в првсутстввв карбодиимида при соотвошеввв юарбоаиимид - полиэтилен с привитой полвакрвпо; вой кислотой 1:5-1:12. 2. Сгюсоб по п. 1, о т л н ча ю ш и и с я тем, что процесс ведут прв рН 7,2-7,6. S

Сохранение монооксигеназной активности иммобилизованных при различном соотношении карбодиимид - 1юлиэтилен с привитой полиакриловой киспотой микросом печени (субстрат - диметиланилик)

Монооксигеназная активность вммобипвзованных микросом, % от исходной, при соогйошениа карбодиимиа - полиэтилен с прввнтой попиакриповой кислотой

116

83,5 НО

66

Таблица 2

.46

36

110