Способ получения иммобилизованной уреазы Советский патент 1984 года по МПК C12N11/14 

:D о

:п

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованной уреазы, и может найти применение в медицине (для аппарата искусственная почка), в аналитической прокышленности (для создания ферментных электродов) и при очистке сточных вод от мочевины.

Известен;способ получения иммобилкзованной уреазы, заключающийся в .связывании фермента с модифицированным Y -аминопропилтриэтоксисиланом .пористым стеклом l .

Недостатком способа является невозможность использования препарата в медицинских целях из-за токсичное- 15 ти, обусловленной присутствием Y аминопропилтриэтоксисилана, и способности к тромбообразованию,

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому 20 положительному эффекту является способ получения иммобилизованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивающим pea- 25 гентом - карбодиимидом или солью изоксазолия 2,

Однако при иммобилизации по известному способу уреазы заметно снижается активность фермента, невысо- JQ ка и стабильность иммобилизованной уреазы при многоразовом использовании (т-бл, 2 и 3) . Кроме того, при применении указанных углей возможно возникновение запыленности, тогда как при применении их в медицине сопоставимые по размерам с форменными элементами крови пылевые частицы должны отсутствовать. Недостатком является также необходимость применен я дорогих, дефицитных карбодииМИДОВ дициклогексилкарбодиимид, дибен зилкарбодиимид, 1-ци клоге ксил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид, 1бензилдиэтиламиноэтил карбодиимид, 1-циклогексил-З-(2-морфолиноэтил)- 45 карбодиимид и соли изоксизолия, причем некоторые из них промышленностью не выпускаются.

Целью изобретения является увеличение удельной активности и ста- 50 бильности иммобилизованной Уреазы. I

Поставленная.цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной уреазы, заключающемуся в связывании фермента с активирован- 55 ным.углем, подвергнутым юдификaции сшивающим реагентом, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористым титаном, при соотношении угля и че- 60 тыреххлористого титана 1:0,2-0,5.

Причем в качестве окисленного активированного угля используют окисленный сферический карбонит или окисленный фенолформальдегидный уголь. 5

Данный способ позволяет получать нерастворимую уреазу, отличающуюся высокой активностью и стабильностью.

Особым преимуществом обладает окиленный сферический карбонит, отличйощийся высокой химической стойкостью, малым изменением прочности в широком интервале развития пористости, полным отсутствием пыли, при этом для окисленных сферических карбонитов прочность, обеспечивающая отсутствие пыли, сохраняется вплоть до Vg 1,2-1,3 см/г, повышенной адсорбционной емкостью к средним и крупным молекулам при сорбции их из водных расворов, и особенно к ионам NH ,образущимся в процессе разложения мочевины, что способствует дополнительной стабилизации уреазы, уменьшая концентрацию и тем самым ингибирование фермента ионами NH..

Применение в качестве связывающего реагента четыреххлористого титана помимо упрощения процесса за счёт применения Менее дефицитного сшивающего реагента позволяет увеличить выход уреазной активности к стабильности иммобилизованного фермента. Весовое соотношение окисленный сферический карбонит: четыреххлористый титан можно варьировать от 1:0,2 до 1:0,5, дальнейшее увеличение количества чет.ыреххлористого титана (табл. 1) уменьшает активность уреазы. Это, по-видимому, связано с ухудшением адсорбционных свойств носителя по отношению к выделяющимся в ход реакции ионам аммония, что ингибирует иммобилизованную .уреазу.

. Иммобилизованная указанным способом уреаза при хранении при 5с в течение 1 мес, сохраняет 80% исходной активности. При использовании в реакторе периодического действия (13 раз) сохранялось 60% исходной активности, рН оптимум иммобилизованной уреазы 8,5, а температурный оптимум . Отмечено существенное увеличение термостабильности. При 10°С сохраняется 56% исходной активности иммобилизованной уреазы, тогда как нативная в этих условиях полностью инактивируется. Стабильность препарата выше, чем при иммобилизации по известному способу (табл. 2). При иммобилизации предлагаемым способом сохраняется 44% исходной удельной активности, а связывается 30% белка. При иммобилизации по известному способу сохранение удельной активности уреазы значительно ниже (табл. 3) .

Пример 1.2г окисленного сферического карбонита суспендируют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешивании прибавляют 0,5 г четыреххлористого титана, продолжают перемешивание 1 ч. Носитель много кратно промывают дистиллированной водой. Аналогично получают носитель обработанный 0,2 г четыреххлористого титана, К 800 мг полученного таким образом угля добавляют раствор 10 мг уреазы в 10 мл фосфатного буфера, рН 7,6 (энзиматическая активность 34 ед/мг препарата). За едини цу уреазной активности принимается такое количество фермента, в резуль тате реакции которого с субстратом выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 ми при 30°С, Полученную смесь перемешивс1ют 4 ч при комнатной температуре. Затем методом декантации промывают фосфатным буфером рН 7,6 1 М раствором КС1 и дистиллированной во дой. Получают препарат иммобилизова ной уреазы с активностью 55,9 ед/г носителя, что соответствует 44%-му сохранению исходной удельной активности при 30%-ом связывании белка. Пример 2.2г окисленного фенолформальдегидного угля суспенди руют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешивании прибавляют 0,5 г четьлреххлористого титана, про должают перемешивание 1 ч. Носитель многократно промывают дистиллирован ной водой. К 800 мг полученного таким образом модифицированного окисленного фенол

Соотношение угля

Активность иммобилизованной уреазы, % и четыреххлористоот максимальной

го титана

80

80

98

98

100

100

75

50

Процент связывания белка I (от максимального) при иммобилизации уреазы

42

63

97

100

100

100

97

93 :формальдегидного угля, добавляют раствор 10 Мг уреазы в 10 мл фосфатного буфера рН 7,6 (экзиматическая активность 34 ед/мг препарата), Аналогично примеру 1 получают препарат иммобилизованной уреазы с активностью 51,3 ед/г носителя, что соответствует 40,4%-му сохранению 1ИСХОДНОЙ удельной активности при 30%-ом связывании белка. i Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет получить стабильные препараты иммобилизованной уреазы с более высокой удельной активностью, отличающиеся значительной термостабильностью при -Повышенной температуреj способные к многоразовому использованию. Использование предлагаемых окисленных углей (окисленного сферического карбонита и окисленного фенолформальдегидного угля) позволяет исключить запыленность форменных элементов крови, что особенно важно лпя нормального функционирования аппар ата искусственная почка и позволяет использовать иммобилизованную уреаэу в медицине. Замена дефицитных и дорогих сшивающих реагентов на четыреххлористый титан значительно удешевляет получение целевого продукта. Таблица 1

Таблица 2

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ УРЕАЗЫ, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивания реагентом, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и стабильности иммобилизованной уреазы, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористым титаном, при массовом соотношении угля и четыреххлористого титана 1:0,2-0,5. 2. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что в качестве окисленного активированного угля исполь- зуют окисленный сферический карбо- «g HUT или окисленный фенолформальде-) гидный уголь. f/j

50 55

СКНд ФАУд Darco

70 14 16.

d-бО

«

СКНо ФАУо

Darco

20 d-60 Пр ленный

1-Циклогексил-З-(2морфолиноэтил)карбодиимид (известный

Дициклогексилкарбодиимид (известный

Четыреххлористый титан (предлагаемый способ)

65 70

80 95

80 20 26

100

70

65

35

80

25

15

20

15

10

13

44

40,4

27 имечание . СКН,, - окисленный сферический карбонит; ФАУр - окисфенолоформальдегидный уголь Darco d-60 марка угля. Таблица 3.