Консорциум штаммов LеNсоNоSтос oeNoS ВКПМ В-3334,PeDIococcUS реNтоSасеNS ВКПМ В-3335,SасснаRомUсеS ceRoVISIae ВКПМ Y-512,используемый для биологического кислотопонижения вин Советский патент 1987 года по МПК C12G1/02 C12N1/20 C12N1/16 C12N1/20 C12R1/01 C12N1/16 C12R1/865 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается нового консорциума штаммов микроорганизмов , который может быть использован для кислотопонижения с целью получения высококачественных марочных пин.

Целью изобретения является получение нового консорциума штаммов бактерий и дрожжей, обладающего высокой биологической активностью при регулировании кислотности виноматериалов.

В состав консорци т а входят штамм молочно-кислых бактерий Leuconoatoc

oenos ВКПМ В-3334 (К-48 ф) , Pediococ- tf ший рост, образуя белые блестящие

CUS pentosaceusВКПМ В-3335. (К-48 ф) и дрожжиSaccharomyces cerevisiae: ВКШ-1 У-512 (К-48 ф) при их соотношении соответственно (48 - 51) : (42- 44) : (5-10).

Итаммы, входящие в консорциум К-48 ф, характеризуются следующими морфолого-культуральными и физиолого- биохимическими признаками,

Штамм Leuconostoc oenos ВКПМ в-3334

Мор(, элого-культуральные признаки.

CpaN оложительный неподвижный фа- культуро тьный анаэроб. На агаризованной среде MFC при 28 С на третьи сут- ки дает слабый рост, образуя белые гладкие блестящие колонии диаметром 0,1-1 мм. В жидкой среде MFC + вино (1:1) образует мелкодисперсный осадок . Не образуют слизи.

У штамма отчетливо наблюдается диморфизм. На жидкой среде МРС с вином (1:1) в ассоциативной культуре с дрожжами образует данные цепочки из кокков овальной формы размером 0,7 х

X 1 мкм. При выращивании на агаризованной среде MFC обнаруживаются цепочки из кокков и дигтлобациллы из коротких палочек (0,8 х 1,4 мкм). Аналогичное явление описано для штаммов Leuconostoc oenos, выделенных из швейцарских вин.

Слабо растет при 10 С, не растет при 45 с. Хороший рост при 15-37°С.

Физ иолого-биохимические признаки,

Для штамма характерно образование газа из глюкозы, и неспособность образовывать аммиак и з аргинина.

Сбраживают глюкозу, фруктозу, маннозу, ксилозу. Не сбраживает галактозу, сорбозу, араОинозу, мальтозу, .сахарозу, целлобиозу, лактозу, мели- , рафинозу, рамнозу, инулин, сС

метил-П-глюкозид, салицин, глииврин, дульцит, маннит, сорбит, инозит.

Не усваивает цитрат, не восстанавливает нитраты п нитриты, не разжигает желатин, не гидролизует эскулин, ус- ваичает яблочную и лимонную кислоты, Каталазоотрицательный, не патогенен.

Штамм Pediococcus pentosaceus ВКПМ В-3335.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительный неподвижный мик- роаэрофил. На агаризованной среде МРС на третьи сутки при дает хоро

гладкие колонии диаметром I мм. В жидкой среде МРС + вино (1:1) о.бразует- ся однородная муть и мелкодисперсный осадок.

Штамм изменяет форму клеток в зависимости от условий культивирования: при росте на жидкой среде совместно с дрожжами и у свежевьщеленного из консорциума щтамма клетки кокковидной

формы 0,7 X 0,7 мкм располагаются парами. После двух лет культивирования в монокультуре при высеве иа МРС- агар клетки имеют вид коротких палочек 0,7 X 1,0 мкм, обычно в парах. Слабо растет при 10 С, обильный рост при 15 и 37 С, при 45 с не растет .

Физиолого-биохимические признаки. Штамм ферментирует глюкозу без образования газа.

Сбраживает глюкозу,галактозу, ксилозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, салацин. Не сбраживает сор- бозу, арабинозу, целлобиозу, лактозу,

мелибиозу, рафинозу, рамнозу, инулин.

о -метил-В-глюкозид, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит,

Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не гид- 45 ролизует эскулин, не усваивает цитрат. Усваивает яблочную и лимонную кислоты. Каталазоотрицательный. Не патогенен,

Штамм Saccharomyces cerevisiae 50 У-512.

Культурально-морфологические признаки.

При росте на сусло-агаре у трехсуточной культуры при 23 С клетки 55 круглые, овальные, одиночные или в парах (размером 3-5 х 4-10 мкм). Штрих - культура через 3 для на сусло-агаре бледно-кремовая, гладкая.

31

блестящая, края ровные. Аски содер- 1-4 аскоспоры.

Растет на среде без витаминов и при 37°С.

Физиолого-биохимические признаки.

Сбраживает глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, рафинозу на 1/3, лактозу не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, галактозу.

мальтозу, сахарозу, рафинозу, этанол, JO остается практически неизменным: в молочную и яблочную кислоты. Не ас- контроле 0,39 г/л, в опыте 0,41 г/л. симилирует f-сорбозу, целлобиозу, лактозу, инулин, растворимый крахмал.

Устанавливают степень участия мик роорганизмов, составляющих консорциум, в кислотопонижении вина.

d-ксилозу, t-арабинозу, d-арабинозу, d-рибозу, Р-рамнозу, глидерин, дуль- цит, маннит, сорбит, ot-метил-В-глю- козид, салацин, янтарную и лимонную кислоту, инозит. Не ассимилирует KNOj .

Тип взаимодействий между штаммами симбиотический. Дрожжи снижают высокий окислительно-восстановительный потенциал среды, который препятствуе развитию молочно-кисльпс бактерий и

прохождение яблочно-молочного броже- 25 ми путем удвоения их обычного содер- ния, потребляют молочную кислоту, яв- жания в вине, в частности тиамина, ляющуюся ингибирующим продуктом для никотиновой кислоты, пиридоксина, молочно-кислых бактерий, способствуют биотина и особенно рибофлавина, в от- повышению их спирто- и кислотоустой- дельности или в сочетаниях, заметно чивости. Бактерии выделяют протеоли- 30 ускоряет сбраживание яблочной кисло- тические ферменты, которые делают ты молочно-кислыми бактериями, среду более доступной для дрожжей. Штамм Leuconostoc oenos способен

При выращивании посевного материа- удваивать количество рибофлавина, ла на сусло с вином (7:3) соотношение никотиновой кислоты, тиамина, биоти- штаммов Leuconostoc оепоз, Pediococ- на и пиридоксина в виноматериале при CU8 pentosaceus и Saccharomyces се- проведении им яблочно-молочного брожения.

Синтез витаминов группы В монокультурами дрожжей и молочно-кислых

revisiae (48-51) : (42-44) : (50-10) соответственно,

Селекционированный консорциум обладает высокой адаптивной способно- 40 бактерий приведен в табл.4. стью и проявляет одинаковую кислото- понижающую активность в винах различного состава.

Снижение консорциумом титруемой кислотности вин различного состава показано в табл.1.

Некоторые щтаммы молочно-кислых бактерий могут накапливать в винах нежелательный биогенный амин - гиста- 45 мин в значительных количествах (до 20 мг/л), которьш повинен в серьезных осложнениях при употреблении этих вин. Молочно-кислые бактерии, входящие в состав консорциума, гистамин не образуют.

Консорциум интенсивно снижает кислотность вина при глубинном способе культивирования.

Кислотопонижению подвергают столовый виноматериал сорта Алиготе с содержанием общего SOg 32 мг/л, свободного SOg 3,2 мг/л, спирта 10,2 об.% Сахаров 0,30%, с летучей кислотностью 0,39 г/л и виноградное сусло не сульфитированное, содержащее 19,0% Сахаров.

Кислотопонижающая актинность консорциума дана в табл . 2 .

Кислотопонижающая актириость на вине в 2,8-3,4 раза выше, чем кисло- топонижающая активность этой же культуры на сусле. Результаты хроматогра- фического анализа показывают исчезновение не только яблочной кислоты, но и молочной. Содержание летучих кислот

остается практически неизменным: в контроле 0,39 г/л, в опыте 0,41 г/л.

Устанавливают степень участия микроорганизмов, составляющих консорциум, в кислотопонижении вина.

Кислотопонижающая активность монокультур молочно-кислых бактерий и дрожжей на виноматериале сорта Алиготе дана в табл.3.

В процессе кислотопонижения вина штаммы, составляющие консорциум, синтезируют витамины группы В, имеющие важное значение для проведения этого процесса. Обогащение вина витаминажения.

Синтез витаминов группы В монокультурами дрожжей и молочно-кислых

бактерий приведен в табл.4.

бактерий приведен в табл.4.

Некоторые щтаммы молочно-кислых бактерий могут накапливать в винах нежелательный биогенный амин - гиста- мин в значительных количествах (до 20 мг/л), которьш повинен в серьезных осложнениях при употреблении этих вин. Молочно-кислые бактерии, входящие в состав консорциума, гистамин не образуют.

Консорциум сохраняют на жидкой среде, состоящей из МРС и виномате-- риала (1:1), при С и производят пересевы через каждые 3 мес. При этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.

Состав среды МРС:

Пептон, г10

Дрожжевой автолизах, :ш50 Мясная вода, мл 100 Твин-80, мл1 Глюкоза, г 20 Натрий уксуснокислый (СНдСООМа-ЗН Р), г 5 Аммоний лимоннокислый трехзамещенный (C,H,,), г 2 Фосфорный калий двузамещенный (K.,HPO,-3HjO), г 2 Сернокислый магний (.7H,0), г 0,2 Сернокислый марганец (,,0), г 0,05 Вода дистиллированная До 1 л При хранении культур на одной срде МРС кислотопонижающая активность ассоциации снижается, а при разбавлении среды МРС более чем на 50Z снжается интенсивность роста ассоциации.

Влияние состава среды на интенсиность роста консорциума показано в табл.5.

Выращивание прседного материала осуществляют в ферментерах, стерилизованных острым паром, на смеси вноградного сусла и виноматериала (7:3), смесь предварительно пастеризуют при 70 - в течение 20 мин Засев смеси производят трехсуточной активной культурой, выращенной на разведенном вдвое виноградном сусле из расчета 2% к объему смеси.

После максимального накопления биомассы в ферментерах (2100 млн/мл бактериальных клеток и 233 млн/мл дрожжевых) и возникновения процесса кислотопонижения посевной материал вносят в емкости с виноматериалом дпя проведения биологического кислотопонижения в количестве 3% к объем виноматериала.

Биологическому кислотопонижению подвергают виноматериал с содержанием свободного SOg не вьппе 10 мг/л и общего SOg не выше 50 мг/л, концентрацией яблочной К ислоты не менее 2 г/л, спирта 10 - 13°, рН 2,9 - 3,2 и высокой титруемой кислотностью 10- 14 г/л при 18-25 С.

2506A6

Процесс биологического кисло опо- нижения контролируют путем отбора проб и определения в них титруемой кислотности, а также качественного 5 определения наличия винной, яблочной и молочной кислот.

Процесс биологического кислотопонижения заканчивают при исчезновении пятна яблочной кислоты на хромото- 10 грамме или после снижения титруемой кислотности до заданных кондиций. После окончания процесса виноматериап направляют на дальнейшую технологическую обработку согласно принятым 15 схемам.

Пример. 6мл жидкой питательной среды, содержащей трехсуточную культуру, засевают 0,5 л колбу, в ко20 торой находится смесь из 210 мл виноградного сусла и 90 мл вина. После достижения максимальной биомассы (2033 млн/мл бактериальных клеток, 226 млн/мл дрожжевых клеток) посев25 ной материал вносят в 9700 мл виноматериала сорта Алиготе, содержащего Сахаров 0,20%, свободного 80 3,2 мг/л, общего SOy 50,8 мг/л, и проводят кислотопонижение при .

30 После внесения 3% посевного материала в виноматериал концентрация дрожжевых клеток 6,8 млн/мл, бактериальных 61 млн/мл.

В результате кислотопонижения

35 титруемая кислотность снижается до 6,31 г/л, содержание винной кислоты, спирта, летучих кислот остается без изменений, яблочная кислота .содержит ся в следовых количествах, окисли40 тельно-восстановительный потенциал снижается в 1,5 раза, рН повьшается до 3,30.

Изменение биохимического состава -- 45 вина в результате проведения кислотопонижения виноматерцала консорциум К-48 в дано в табл.6.

Формула изобретения 50

Консорциум штаммов Leuconostoc oenos ВКПМ В-3334, Pediococcus реп- tosaceus ВКПМ В-3335, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-512, используемый 55 для биологического кислотопонижения вин.

Контроль (до кислотопоии- жения) . 11,0

Оимт (после

кислотопонижения)

6,3

лТК - кислотопонижающая активность (разность между энaчeния лI исходиоП и конечной титруемой кислотности)

Контроль(исходТ а б л и, ц а 1

9,7

13,1710,739,57

6,4

6,726,42

6,3

Таблица 2

Таблиц 3

Saccharomyces се- revisiae

Pediococcus pcn- tosaceus

Leuconostoc oenos

В вине, после проведения процесса кисло- понижения

Saccharomyces се- revisiae 17,0

Pediococcus penРезультаты даны по содержанию витаминов группы В в вине после проведения процесса кислотопонижения с вычетом контроля - содержания витаминов в исходном вине.

Таблица 5

0,72

0,70

До кислотопонижения10,86 4,43 3,50 0,36 44,5 170 3,10 11,4

После кислотопонижения

6,31

4,42 0,068 0,38 49,5 115 3,30 11,4

2,5

0,30

12,5 0,17 12,5 0,20

6,2

15,0 15,0

0

60,0 О

0,52

0,07

0,06

Таблица 6

Изобретение относится к микробиологической, промьгашенности и касается нового консорциума штаммов, который может быть использован для биологического кислотопонижения вин. Консорциум штаммов включает молочнокислые бактерии Leuconoetoc oenos ВКПМ В-3334, Pediococcus pentosaceus ВКПМ В-3335 и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-512 при следующем их соотношении соответственно (48- 51) : (42-44) : (5-10). Целью изобретения является получение нового консорциума, обладающего высокой биологической активностью. 6 табл. (Л