СПОСОБ ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ Российский патент 2010 года по МПК C13K1/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к области переработки лигноцеллюлозных материалов, преимущественно отходов лесопереработки, для получения сбраживаемых сахаров и других продуктов, которые можно использовать непосредственно в разных областях техники или в качестве сырья для дальнейшей переработки в конечные ценные продукты.

Целлюлоза составляет основную часть всей растительной биомассы. Источником целлюлозы является структурная ткань растений. Целлюлоза вместе с гемицеллюлозой и лигнином составляет основную часть растительной клетчатки. Целлюлоза состоит из длинных цепей с β-гликозидной связью в положении 1,4. Эти связи придают целлюлозе высокую степень кристаллизации, что определяет низкую возможность воздействия ферментов или кислых катализаторов. Гемицеллюлоза является аморфным гетерополимером, который легко подвергается гидролизу. Лигнин - ароматический трехмерный полимер, заполняющий промежутки между целлюлозой и гемицеллюлозой внутри клетчатки растений. Несмотря на простой химический состав, целлюлоза имеет множество топологий: кристаллические, аморфные и переходные. Ее нерастворимость в воде и гетерогенность определяет низкую возможность воздействия кислых катализаторов и делает целлюлозу устойчивой к ферментативному гидролизу, несмотря на ее гомогенный химический состав.

Процессы гидролиза целлюлозы включают биологические и небиологические способы деполимеризации. В биологических способах используются ферменты целлюлозы. Среди небиологических способов традиционным и наиболее известным в производстве сахаров из целлюлозы является гидролиз в среде кислоты. Кислотой, наиболее часто используемой в этом способе, является серная кислота. Вообще же гидролиз в среде серной кислоты можно характеризовать как гидролиз в среде разбавленной либо в среде концентрированной кислоты.

Известен способ получения глюкозы из целлюлозосодержащих отходов (RU 2346055, 10.02.2009), включающий предварительное измельчение сырья, гидролиз 60-80%-ной серной кислотой при комнатной температуре с последующей инверсией, отличающийся тем, что измельченное до фракции 1,6>х>0,1 мм сырье подвергают обработке раствором уксусной кислоты, пероксида водорода, серной кислоты (1,5-2,0%) при температуре 110-120°С в течение 2-3 ч, а затем гидролизу 60-80%-ной серной кислотой в течение 1-2 ч с последующим разбавлением водой и инверсией при температуре 90-100°С в течение 1-2 ч.

Основным недостатком известного способа является необходимость использования в процессе гидролиза серной кислоты, которая требует в дальнейшем обработки щелочью для нейтрализации и удаления образующегося осадка. Кроме того, процесс гидролиза проходит при высокой температуре, что ведет к разложению сахаров, с образованием фурфурола и других нежелательных побочных продуктов. В результате этого выход глюкозы очень низок. Кроме того, возникает необходимость в оборудовании, кислотостойком при высоких температурах.

Ферментативная деструкция целлюлозы происходит, как правило, под действием не отдельных ферментов, а полиферментных систем. Ферментам, входящим в состав этих систем, присуща определенная специализация: одни из них эффективно гидролизуют «внутренние» гликозидные связи между моносахаридными остатками, другие предпочтительно расщепляют «внешние» гликозидные связи на концах молекул. Расщепление идет до ди- и олигосахаридов, которые затем расщепляются целлобиазой (β-глюкозидазой) до моносахара.

Известен следующий способ осахаривания лигноцеллюлозного материала (JP 1181794, 19.07.1989): бактерию, продуцирующую целлюлазу, например Trichrodermaressei QM9414 (АТСС 26921), культивируют в среде, содержащей древесную пыль размером до 100 мкм. Тонко измельченная древесина постепенно осахаривается культуральной жидкостью при температуре 30-60°С и рН 4-5.5, необходимость в осуществлении какой-либо предварительной обработки, такой как удаление лигнина отсутствует. Отметим, что существенным недостатком продуцента целлюлаз - мутантного штамма Т. reesei является низкая секреция β-глюкозидазы, отвечающей за конверсию промежуточных целлоолигосахаридов в конечный продукт - глюкозу.

Известен также способ получения сбраживаемых сахаров из лигноцеллюлозных материалов, включающий подготовку сырья, обработку подготовленного сырья ферментным препаратом, полученным культивированием микроорганизма Penicillium funiculosum (RU 2316584, 10.02.2008). Этот способ предусматривает предварительную обработку древесины сернистым ангидридом при повышенной температуре и давлении с последующей декомпрессией, что заметно усложняет и удорожает процесс.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа осахаривания лигноцеллюлозного сырья с использованием ферментативного препарата.

Технический результат состоит в обеспечении высокого выхода сбраживаемых сахаров - восстанавливающих сахаров и глюкозы.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается за счет способа осахаривания лигноцеллюлозного сырья, включающий подготовку сырья, обработку подготовленного сырья ферментным препаратом, отличающийся тем, что подготовка лигноцеллюлозного сырья включает в себя грубый помол и последующий тонкий помол и в качестве ферментного препарата используют препарат, полученный культивированием штамма Penicillium verruculosum BKM F-3972D.

Грубый помол лигноцеллюлозного сырья осуществляют до размеров частиц 1-2 мм на пригодных для такого процесса мельницах, например шаровых, предпочтительно одновременно с сушкой, путем продувки воздухом с температурой 120-130°С, что позволяет удалить влагу из сырья и подготовить его к тонкому помолу.

Тонкий помол растительного сырья осуществляют до размеров частиц 1-5 мкм, до изменения его агрегатного состояния, близкого к аморфному, что позволяет улучшить перемешивание с водой, используя соотношение 1:6, а не 1:10, как того требует необработанное сырье, и увеличить таким образом биодоступность сырья. Предпочтительно осуществлять тонкий помол растительного сырья в вибрационных, струйных и коллоидных мельницах, обеспечивающих усилие сдвига при помоле, что, как показали исследования авторов, обеспечивает механоактивацию сырья.

Для дополнительной интенсификации процесса тонкого помола осуществляют насыщение диоксидом углерода при сверхкритическом давлении, что приводит в присутствии влаги к образованию угольной кислоты, которая блокирует «слипание» пыли и образование вторичных кристаллов.

Хотя в предлагаемом способе могут быть использованы любые возобновляемые источники сырья, такие, например, как солома и т.п., но преимуществом предлагаемого способа является возможность использования отходов деревоперерабатывающей промышленности - древесных опилок. В качестве опилок возможно использование наиболее трудно ферментализуемых опилок деревьев хвойных пород.

Перед тонким помолом древесных опилок из них предпочтительно удаляют смолу, что дает возможность осуществить полный ферментолиз целлюлозы, поскольку в противном случае в силу гидрофобности часть ферментов садится на смолу и не участвует в процессе ферментолиза. Удаление смолы предпочтительно осуществляют экстракцией органическими растворителями, ацетоном и/или этанолом с модулем 1:7-1:10.

Для получения ферментативного препарата используют мутантный штамм Pemcillium verruculosum BKM F-3972D, указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН.

Предпочтительно рН реакционной среды поддерживают в пределах 4,8-5,2. При превышении значения 5,2 его понижают раствором серной кислоты, при снижении значения ниже 4,8 повышают раствором гидроксида калия. Желательно, чтобы массовое соотношение ферментного препарата и измельченного сырья составляло 2-5 г на 1 кг сырья, обработку проводят при интенсивном перемешивании и температуре 43-56°С.

Предпочтительно культуральную жидкость, используемую в качестве ферментного препарата, получают следующим образом: штамм Penicillium verruculosum BKM F-3972D культивируют на водной среде, содержащей в г/литр: целлюлозу - 50, глюкозу - 20, КН₂РO₄ -10, (NH₄)₂SO₄ - 5, MgSO₄×7H₂O -0,3, CaCl₂×3H₂O -0,3, при 26-30°С, поддержании рН в диапазоне от 4,5 до 5,5 путем подачи серной кислоты или гидрооксида калия при перемешивании и аэрации.

После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую комплекс целлюлаз и сопутствующих ферментов, подвергают ее ультрафильтрации на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и лиофильно высушивают ультраконцентрат с получением сухого ферментного препарата. Целлобиогидролазная активность сухого ферментного препарата составляет 900-920 ед/г, эндоглюканазная активность - 14500-14900 ед/г, β-глюкозидазная активность - 1200-1250 ед/г, целлобиазная активность - 600-670 ед/г, ксиланазная активность - 23000-24000 ед/г, ксилоглюканазная активность - 7500-8200 ед/г.

Пример 1

Древесную щепу хвойных пород измельчают на шаровой мельнице до 1-2 мм и сушат в потоке горячего воздуха до влажности не более 10%. Из полученных опилок удаляют смолу экстракцией этанолом с модулем 1:10. Опилки отделяют от экстрагента на центрифуге, остатки экстрагента удаляют продувкой сухим паром.

Обессмоленные опилки с влажностью 3-4% измельчают на активационной мельнице, например ОГО-3, Новосибирск, до размера 1-5 мкм. Измельченную древесину в количестве 20 кг загрузили в реактор-ферментер, куда также при перемешивании добавили воду и 80 г культуральной жидкости, полученной культивированием грибов Penicillium verruculosum BKM F-3972D. Содержание целлюлозы в обрабатываемой древесине составило 41 мас.%. Количество добавляемой воды определяли из расчета получения в ферментере суспензии плотностью 0,9-1,0 г/см³.

После получения в ферментере однородной среды определили ее рН, который оказался равным 5,9, понизили его значение до 4,9 раствором серной кислоты. Температура в ферментере была установлена и поддерживалась в процессе разложения целлюлозы на уровне 49±2°С. рН среды, который в процессе осахаривания снижался, при падении значения ниже 4,8 повышали добавлением в ферментер раствора гидрооксида калия.

Контроль за полнотой разложения целлюлозы вели по концентрации глюкозы в ферментере. По достижении степени разложения целлюлозы 82% и заметном снижении скорости дальнейшего превращения процесс остановили и отделили раствор образовавшихся cахаров от лигнина и остатков целлюлозы. Общее количество cахаров в растворе составило 6,12 кг. Выход глюкозы составил 5,75 кг или 94% от общего содержания сахаров.

Пример 2

Солому пшеницы измельчают на шаровой мельнице (Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, Новосибирск) до размера частиц 1-2 мм. Затем предварительно измельченную солому подвергают тонкому размолу на струйной мельнице ВИТ (Институт теплофизики СО РАН, Новосибирск) до размера частиц 1-5 мкм.

Измельченную солому в количестве 25 кг загрузили в реактор-ферментер, куда также при перемешивании добавили воду и 100 г культуральной жидкости, полученной культивированием гриба Penicillium verruculosum BKM F-3972D. Количество добавляемой воды определяли из расчета получения суспензии плотностью 0,9-1,0 г/см³.

Температура в ферментере была установлена и поддерживалась в процессе разложения на уровне 49±2°С. рН среды поддерживали на уровне 4,8-4,9.

Контроль за полнотой разложения целлюлозы вели по концентрации глюкозы в ферментере. По достижении степени разложения целлюлозы 82% и заметном снижении скорости дальнейшего превращения процесс остановили и отделили раствор образовавшихся cахаров от лигнина и остатков целлюлозы. Общее количество cахаров в растворе составило 8 кг.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время обработки сырья на подготовительных стадиях; исключить стадию гидролиза серной кислотой; значительно увеличить выход сбраживаемых сахаров.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ осахаривания лигноцеллюлозного сырья предусматривает подготовку сырья, включающую грубый помол и последующий тонкий помол сырья. Подготовленное сырье обрабатывают ферментным препаратом. В качестве ферментного препарата используют культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium verruculosum BKM F-3972D. Способ позволяет увеличить выход сбраживаемых сахаров. Общее количество сахаров в растворе составляет 6,12-8 кг. Выход глюкозы 5,75 кг или 94% от общего содержания сахаров. 8 з.п. ф-лы.

1. Способ осахаривания лигноцеллюлозного сырья, включающий подготовку сырья и обработку подготовленного сырья ферментным препаратом, отличающийся тем, что подготовка лигноцеллюлозного сырья включает в себя грубый помол и последующий тонкий помол, а в качестве ферментного препарата используют культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium verruculosum BKM F-3972D.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что грубый помол растительного сырья осуществляют до размеров частиц 1-2 мм одновременно с сушкой путем продувки воздухом с температурой 120-130°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что тонкий помол растительного сырья осуществляют до размеров частиц 1-5 мкм.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве лигноцеллюлозного сырья используют древесные опилки.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве древесных опилок используют опилки деревьев хвойных пород.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что перед тонким помолом древесных опилок из них удаляют смолу экстракцией ацетоном и/или этанолом с модулем 1:7-1:10.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что массовое соотношение ферментного препарата к измельченному сырью составляет 2-5 г на 1 кг сырья.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН в процессе осахаривания поддерживают в пределах 4,8-5,2.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку проводят при интенсивном перемешивании и температуре 43-56°С.