СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛЕПРОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/47 A61K33/42 A61K36/28 A61K33/14 A61K36/48 A61P17/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, и может быть использовано, в частности, в комплексном лечении лепры.

Из практики медицины известен способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции, состоящий в использовании препарата диаминодифенилсульфон (ДДС) в дозе 100 мг/кг комбикорма со дня заражения и до окончания эксперимента (Shepard С.С.Effect of ДДС on established infectoins with Mycobacterium leprae // Int. J. Lepr. - 1967. - Vol.35. - P.52-57). Однако известный способ имеет следующие недостатки: случаи лекарственной устойчивости к препарату; экспериментально установлено, что лечение этим препаратом является недостаточно эффективным, так как наблюдаются побочные явления, связанные с явлениями анемии, токсическим действием препарата на паренхиму и строму печени мышей; длительное применение препарата может оказывать канцерогенное действие на организм экспериментально зараженных животных. Эти недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение терапевтической эффективности способа.

Известен также способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции препаратом корня хрена, содержащего пероксидазу (Маслов А.К., Лужнова С.А., Калянина О.В. Влияние корня хрена на функциональные способности фагоцитов, формулу крови и состояние печени мышей с экспериментальной лепрой // Бюл. эксперим. биол. - 2002. - Т.134, №8. - С.181-183).

К недостаткам известного способа можно отнести: недостаточный антимикробный эффект. Этот недостаток не позволяет получить конкретный технический результат - повышение терапевтической эффективности способа.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции экстрактом из корня солодки голой (Патент №2410111, авторы Л.Т. Сухенко, Г.Н. Назарова, А.К. Маслов. «Способ получения экстракта, обладающего противолепрозной активностью»). Сущность предлагаемого способа состоит в подавлении размножения микобактерий лепры в лапах мышей, зараженных интраплантарно по модели Шепарда, при лечении животных ежедневно буферным экстрактом из корня солодки голой.

Сходство предлагаемого способа с известным состоит в том, что они оба относятся к области медицины, а именно к лепрологии, и включают подавление размножения микобактерий лепры в лапах мышей, зараженных интраплантарно по модели Шепарда, при введении per os животным ежедневно растительный экстракт. Эффективность лечения оценивают по количеству М. leprae в лапках мышей и росту активности миелопероксидазы, являющейся основным бактерицидным фактором в нейтрофильных гранулоцитах (НГ) периферической крови мышей.

К недостаткам известного способа можно отнести:

- буферный экстракт из корня солодки голой обладает недостаточной бактерицидной активностью;

- буферный экстракт из корня солодки голой не долговечен, и срок годности его составляет 7-10 дней;

- уровень гемоглобина при применении буферного экстракта из корня солодки голой повышается, а количество эритроцитов не изменяется по сравнению с интактными животными, что может свидетельствовать о сгущении крови;

- вещества, выделяемые из корня солодки голой, обладают выраженным спазмолитическим действием, а при длительном его использовании действуют как сильное слабительное.

Этот способ принят авторами в качестве прототипа.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для лечения экспериментальной лепрозной инфекции дополнительно к экстракту корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra) применили в равных частях следующие фитопрепараты: траву тысячелистника мелкоцветкового (Achillea micrantha) и соцветия бессмертника песчаного (Helichrisum arenarium).

В клубнях, корневищах и корнях Glycyrrhiza glabra найдено наибольшее количество тритерпеновых сапонинов, птерокарпанов, куместанов, стильбенов, неолигнанов, глицитов, циклитолитов, гетероциклических соединений группы фурана и пирана. Корневища концентрируют Fe, Sr, Se (Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: Учебник. - 4-е изд. / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 627 с.),

В солодковом корне много моно- и дисахаридов. Их общее количество может достигать 20%. В клетках корня содержатся также пектиновые вещества (4-6%), смолистые вещества (2-4%), липиды (3-4%), горькие вещества (2-4%), следы эфирного масла.

Другой важной группой БАВ в клетках солодкового корня являются флавоноиды, содержащие витамин Р. Высокой спазмолитической активностью обладают флавоноиды солодки, рекомендуемые для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. Флавоноиды обладают противовоспалительным, спазмолитическим, противоязвенным и антисекреторным действиями. Однако при длительном его использовании корень солодки действует как сильное слабительное. Данный недостаток можно устранить путем сочетания корней солодки голой с другими действующими веществами растений. Для этого авторами использовались соцветия бессмертника песчаного и листья тысячелистника мелкоцветкового.

В соцветиях бессмертника песчаного содержатся флавоноиды (до 10%): флавон нарингнин и его 5-гликозиды - салипурпозид и его стереоизомер гелихризин; халконовый гликозид - изосалипропозид, флавон апигенин и его 7-гликозид, флавон кемпферол и его 3-гликозиды и др.; производные фталевого ангидрида (фталиды); кумарин скополетин; эфирное масло (0,05%о); дубильные вещества. Препараты из бессмертника (цмина) песчаного применяются как желчегонные средства, используются в гомеопатии.

Лекарственные свойства тысячелистника мелкоцветкового (Achillea micrantha) до сих пор не изучались. При микроскопическом изучении листьев тысячелистника мелкоцветкового было обнаружено сходное строение с листьями тысячелистника обыкновенного. Однако биохимические исследования показали довольно высокое содержание эфирных масел по сравнению с тысячелистником обыкновенным. В клетках соцветий тысячелистника мелкоцветкового содержатся до 1% эфирных масел, а также обнаружены и флавоноиды. Экстракт травы Achillea micrantha можно использовать при воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей.

В связи с этим была изучена противолепрозная активность сбора из вышеперечисленных лекарственных растений. Результаты исследований показали повышение терапевтической эффективности фитопрепаратов и устранение побочного действия.

В настоящее время много исследований посвящено изучению возможности применения фитопрепаратов при различных заболеваниях, в том числе и при хронических инфекционных и гранулематозных заболеваниях (например, при туберкулезе). Ранее нами показано, что в отдельности взятые для изучения фитопрепараты in vitro активно действуют на микроорганизмы (M.tuberculosis, St.aureus), подавляя их рост (Сухенко Л.Т. Изучение механизмов противомикробной активности растений Астраханской флоры /Л.Т. Сухенко, Г.Н. Назарова, Н.В. Бовин // Естественные науки. - 2005. - №4(13). - С.13-24).

По современным представлениям, кислые гидролазы способны разрушить в фаголизосомах фагоцитов только те бактерии, которые были умерщвлены миелопероксидазной системой, неферментными катионными белками, лизоцимом и лактоферрином. При выраженной недостаточности миелопероксидазы фагоцитов последние не способны убивать грибы рода кандида, стафилококки и другие патогенные микроорганизмы.

Анализируя литературные данные, можно с большой степенью достоверности считать, что такой показатель бактерицидной системы фагоцитов, как активность миелопероксидазы, является надежным критерием оценки их фагоцитарной способности.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение терапевтической эффективности способа лечения экспериментальной лепрозной инфекции.

Поставленная задача решается тем, что в качестве терапевтического средства используют растительный сбор, состоящий из измельченных равных весовых частей корня солодки голой (Glycyrrhizaglabra), травы тысячелистника мелкоцветкового (Achillea micrantha) и соцветия бессмертника песчаного (Helichrisum arenarium), экстрагированных 40%-ным водным раствором этилового спирта в соотношении: 1 часть растительного сбора и 5 частей раствора. Хранят при перемешивании в течение 6 суток, затем добавляют к этой смеси равный объем буфера, хранят еще 4 суток в прохладном темном месте при ежедневном встряхивании, фильтруют и трехкратно автоклавируют при 0,5 атм в течение 10 минут.

Буфер содержит, мас.%:

хлористый кальций 0,014;

хлористый калий 0,04;

калий фосфорнокислый однозамещенный 0,006;

магний сернокислый 0,02;

хлористый магний 0,02;

хлористый натрий 0,08;

натрий кислый углекислый 0,035;

натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,024;

глюкоза 0,1.

Подробнее о буфере можно узнать из патента «Способ получения экстракта, обладающего противолепрозной активностью» (RU 2410111 С1, Бюл. №3, 27.01.2011. Авторы: Л.Т. Сухенко, Г.Н. Назарова, А.К. Маслов).

Способ осуществляется следующим образом: подопытных мышей линии СВА с начальным весом 25-30 г заражают интраплантарно (в подушечку правой задней лапы) взвесью M.leprae, выделенных от больных лепрой и пассированных на экспериментальных животных (модель лепры по Шепарду). Доза инфекта составляет 1×10⁴ микробных тел в 0,03 мл взвеси. В рамках одного примера использован один штамм микобактерий лепры.

Все мыши делятся на 4 группы.

Опытные животные (1 группа), спустя 2 месяца после заражения (после развития инфекции), получали per os полученный экстракт через зонд в пищевод ежедневно в дозе 0,4-0,6 мл/кг. Контролем служат мыши той же линии и с тем же начальным весом, получающие кормолекарственную смесь, состоящую из комбикорма. в 1 кг которого содержатся 100 мг основного противолепрозного средства - диаминодифенилсульфона (ДДС), (2 группа), и 3 группа - мыши, не получающие лечения (в качестве плацебо используется дистиллированная вода). 4 группа экспериментальных животных (50 мышей) не заражается и в качестве плацебо получает дистиллированную воду (для проверки отсутствия нежелательных побочных проявлений от введения лекарственных веществ). Все эксперименты по моделированию патологических процессов у животных и выведению их из опыта проводятся в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP). Методы соответствуют этическим нормам, изложенным в Женевской конвенции (1971), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), и в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики» (Минздрав СССР №755 от 12.08.1977). Все опыты проводятся после введения животным этаминала натрия в концентрации 40 мг/кг.

Через 5, 7 и 9 месяцев от начала лечения по 10 мышей из каждой группы забивают (мышей 1, 2 групп и мышей 3 группы из контроля), берут воспалительный инфильтрат и кровь. Кроме того, мышей 4-х групп вскрывали и проводили анализ внутренних органов и кожи.

Количество M.leprae в лапках мышей подсчитывали методом Shepard и McRae (1968). Активность миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (НГ) периферической крови мышей - полуколичественным методом Астальди и Верга.

Способ позволяет повысить фагоцитарную активность макрофагов в лапах животных, что приводит к повышению терапевтической эффективности по сравнению с известным способом.

Предлагаемый способ успешно апробирован на базе экспериментальной лаборатории ФГБУ «НИИЛ Минздравсоцразвития» на 1000 мышах линии СВА с первоначальным весом 25-30 г в течение 2008-2009 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Использовали 200 шт. мышей.

50 мышей заражали, как указано выше, взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного К. (ист. бол. №2662) и пассированных двукратно на мышах.

Через 2 месяца после заражения мышам через зонд в пищевод ежедневно в дозе 0,4 мл/кг давали вышеописанный экстракт.

В качестве контроля группе мышей (50 животных) давали кормолекарственную смесь, содержащую 100 мг порошка ДДС в 1 кг комбикорма. Третья группа мышей (50 животных), зараженных интраплантарно той же взвесью и той же дозой микобактерий лепры в качестве плацебо получала дистиллированную воду (контроль). 4-я группа экспериментальных животных (50 мышей) не заражалась и в качестве плацебо получала дистиллированную воду (интактные).

У 10 мышей из каждой группы в сроки через 3, 5 и 7 месяцев после лечения после введения животным этаминала натрия в концентрации 40 мг/кг брали воспалительный инфильтрат и кровь. Подсчитывали количество М. leprae в лапах мышей по методу Shepard и McRae и определяли активность миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (НГ) периферической крови мышей полуколичественным методом Астальди и Верга.

Результаты подсчета количества микобактерий лепры в лапах мышей и уровень миелопероксидазы (МП) представлены в табл.1.

Таблица 1 Динамика размножения M.leprae и уровень МП в нейтрофилах периферической крови мышей при лечении растительным сбором (в дозе 0,4 мл/кг) (М±m) Показатель Период наблюдения (мес.) Интактные животные Контроль (без лечения) Лечение ДДС Испытуемый экстракт Число микобактерий (10⁶) 3 0 104,09±9,56 11,35±5,46* 6,17±0,90* 5 0 128,76±8,80 13,63±1,06* 9,83±1,99* 7 0 203,82±1,55 20,35±6,67* 13,56±4,34* Уровень МП (усл. ед.) 3 2,19±0,04 1,98±0,01 2,20±0,01 2,23±0,01 5 2,20±0,01 1,69±0,01 2,18±0,03* 2,26±0,01* 7 2,21±0,05 1,59±0,07 2,18±0,02* 2,34±0,01* Примечание. *р<0,05 по сравнению с контролем (без лечения).

Терапия растительным сбором уже после 3-х месяцев лечения растительным сбором экспериментальных животных приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю (в 17 раз), статистически превышающему действие традиционного противолепрозного средства ДДС (в 1,8 раз).Через 5 и 7 месяцев лечения животных экстрактом растительного сбора отмечалась та же тенденция к нормальной физиологической деятельности тканей и клеток в подушечках лапок экспериментальных животных, то есть действие экстракта способствовало подавлению размножения M.leprae в 14 раз больше по отношению к контролю и по отношению к лечению ДДС - в 1,4 раза.

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных растительными экстрактами, выявлено, что исследуемые растительные вещества активировали деятельность клеточных элементов макроорганизма (фагоцитов), доводя фагоцитоз до завершенного, способствуя повышению активности фермента МП, входящего в состав одной из основных бактерицидных систем фагоцитов - миелопероксидазной системы. Активность МП была достаточно высокой к 3-му месяцу терапии в случае лечения растительным экстрактом и ДДС. В контроле (мыши без лечения) активность МП была низкой (табл.1).

Кроме того, по данным вскрытия испытуемых животных определяли уровень токсичности исследуемого препарата на организм в сравнении с интактными (незараженными мышами). Шерсть экспериментальных мышей была опрятного вида, очагов облысения не определялось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Видимые слизистые оболочки были блестящими, гладкими, бледного цвета. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой. Желудок имел обычные размеры, просвет его был заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка была складчатая, однородного розоватого цвета. Раздражения, гиперемии не отмечалось. Слизистая оболочка тонкой кишки была бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки была также гладкой, слегка сероватого цвета.

Таблица 2 Влияние введения экстракта в дозе 0,4 мл/кг веса мыши на показатели гуморальных факторов Показатели Контроль Опыт Эритроциты, 10¹² /л 2,2±0,06 2,5±0,12 Гемоглобин, % 133±9,87 131±9,61 Лейкоциты, % 2,1±0,21 2,5±0,1 Эозинофилы, % 2,8±0,4 2,7±0,8 Лимфоциты, % 60±3,4 55,4±3,6 Моноциты, % 0,2±0,02 0,4±0,03 Палочкоядерные нейтрофилы, % 8,2±0,9 10±0,8 Сегментоядерные нейтрофилы, % 26,5±3,8 29±6,2 АлТ, мккат/л 0,44±0,05 0,41±0,01 АсТ, мккат/л 0,24±0,03 0,27±0,05

Исследование крови (табл.2) животных показало, что растительный сбор не обладает побочным действием.

Таким образом, растительный сбор из Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha при ежедневном интрагастральном введении зараженным M.leprae животным в дозе 0,4 мл/кг способен оказывать эффективное ферментативное антимикробное действие, снижая количество микобактериальных клеток в подушечках лап животных. Этому же способствует и увеличение миелопероксидазной активности клеток крови (нейтрофильных гранулоцитов) - основной системы, осуществляющей начальный киллинг клеток патогенных микроорганизмов, без которого невозможно их дальнейшее «переваривание». В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и ДДС.

На всем протяжении опыта (9 месяцев) растительный сбор, состоящий из корня солодки голой, травы тысячелистника мелкоцветкового и соцветия бессмертника песчаного, экстрагированных раствором спирта и буфера, хранился при комнатной температуре и не потерял своих антибактериальных свойств, а также не обладал побочными действиями, что свидетельствует об эффективности предлагаемого способа лечения экспериментальной лепрозной инфекции.

Пример №2.

Условия эксперимента аналогичны примеру №1.

150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист. бол. №3865) и пассированных трехкратно на мышах. 1-ю группу мышей после заражения лечили растительным сбором в дозе 0,6 мл/кг массы животного в сутки. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 5 и 7 месяцев с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности миелопероксидазы в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.3.

Терапия растительным сбором (1 группа) уже после 3-х месяцев лечения экспериментальных животных растительным экстрактом приводила к значительному подавлению роста М. leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю (в 17 раз), статистически превышающему действие традиционного противолепрозного средства ДДС (в 2 раза). Что статистически превышает действие прототипа (р<0,05).

Таблица 3 Динамика размножения М. leprae и уровень МП в нейтрофилах периферической крови мышей при лечении растительным сбором (в дозе 0,6 мг/кг) (М±т) Показатель Период наблюдения (мес.) Интактные животные Контроль (без лечения) Лечение ДДС Испытуемый экстракт Число микобактерий (10⁶) 3 0 108,55±3,49 12,64±1,78* 6,35±2,75* 5 0 146,23±3,15 16,07±2,39* 10,67±3,01* 7 0 240,05±4,97 23,82±2,63* 15,34±2,52* Уровень МП (усл. ед.) 3 2,19±0,06 1,83±0,06 1,85±0,01 2,1±0,06 5 2,28±0,04 1,71±0,01 2,18±0,05* 2,27±0,03* 7 2,31±0,03 1,62±0,02 2,31±0,04* 2,35±0,02* Примечание. *р<0,05 по сравнению с контролем (без лечения).

Через 5 и 7 месяцев лечения животных экстрактом из растений Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha отмечалась та же тенденция к нормальной физиологической деятельности тканей и клеток в подушечках лапок экспериментальных животных, то есть действие экстракта способствовало подавлению размножения M.leprae в 15 раз больше по отношению к контролю и по отношению к лечению ДДС - в 1,5 раза.

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено, что исследуемые растительные вещества активировали деятельность клеточных элементов макроорганизма (фагоцитов), доводя фагоцитоз до завершенного, способствуя повышению активности фермента МП. Активность МП была достаточно высокой к 3-му месяцу терапии в случае лечения растительным экстрактом и ДДС. В контроле (мыши без лечения) активность МП была низкой. К 7 месяцам активность МП НГ крови в случае лечения исследуемым экстрактом практически не превышала активность МП НГ крови интактных животных (табл.5).

Кроме того, по данным вскрытия испытуемых и интактных животных (незараженных мышей) определяли уровень токсичности исследуемого препарата на организм экспериментальных животных. Шерсть была опрятного вида, очагов облысения не определялось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Видимые слизистые оболочки были блестящими, гладкими, бледного цвета. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой. Желудок имел обычные размеры, просвет его был заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка была складчатая, однородного розоватого цвета. Раздражения, гиперемии не отмечалось. Слизистая оболочка тонкой кишки была бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки была также гладкой, слегка сероватого цвета.

Таблица 4 Влияние введения экстракта в дозе 0,6 мл/кг веса мыши на показатели гуморальных факторов Показатели Контроль Опыт Эритроциты, 10¹²/л 3,6±0,21 3,6±0,27 Гемоглобин, % 140±2,6 139±1,9 Лейкоциты,% 2,3±0,31 3,2±0,3 Эозинофилы, % 2,0±0,01 2,1±0,6 Лимфоциты, % 58,2±4,1 60,4±2,8 Моноциты, % 0,2±0,09 0,1±0,01 Палочкоядерные нейтрофилы, % 9,8±0,6 10,3±0,54 Сегментоядерные нейтрофилы, % 32±2,7 36±2,9 АлТ, мккат/л 0,50±0,01 0,54±0,02 АсТ, мккат/л 0,27±0,07 0,30±0,08

Исследование крови (табл.4) животных показало, что исследуемый экстракт не обладает сенсибилизирующим действием. Следовательно, исследуемый сборный экстракт не токсичен.

Таким образом, экстракт из Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha при ежедневном интрагастральном введении зараженным M.leprae животным в дозе 0,6 мл/кг способен оказывать эффективное ферментативное антимикробное действие, снижая количество микобактериальных клеток в подушечках лап животных. Этому же способствует и увеличение миелопероксидазной активности клеток крови (нейтрофильных гранулоцитов) - основной системы, осуществляющей начальный киллинг клеток патогенных микроорганизмов, без которого невозможно их дальнейшее «переваривание». В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и ДДС.

На всем протяжении опыта (9 месяцев) испытуемый экстракт хранился при комнатной температуре и не потерял своих антибактериальных свойств, а также не обладал побочными действиями.

Пример №3.

Условия эксперимента аналогичны примеру №1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист.бол. №3865) и пассированных трехкратно на мышах. Четвертая группа экспериментальных животных (50 мышей) не заражалась и в качестве плацебо получала дистиллированную воду (интактные). 1-й группе мышей после заражения давали растительный сбор в дозе 0,5 мл/кг массы животных в сутки соответственно. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 5 и 7 месяцев

с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности МП в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.5.

Таблица 5 Динамика размножения M.leprae и уровень МП в нейтрофилах периферической крови мышей при лечении растительным сбором (в дозе 0,5 мл/кг) (М±m) Показатель Период наблюдения (мес.) Интактные животные Контроль (без лечения) Лечение ДДС Испытуемый экстракт Число микобактерий (10⁶) 3 0 99,75±3,49 10,99±2,20* 5,18±1,47* 5 0 110,18±2,85 11,13±1,95* 8,77±1,51* 7 0 174,53±4,64 16,86±2,23* 10,82±2,36* Уровень МG (усл. ед.) 3 2,34±0,05 1,75±0,02 2,12±0,01* 2,35±0,02* 5 2,50±0,02 1,69±0,04 2,40±0,03* 2,42±0,02* 7 2,41±0,03 1,58±0,02 2,48±0,03* 2,52±0,01* Примечание. *р<0,05 по сравнению с контролем (без лечения).

Терапия экстрактом растительного сбора (1 группа) уже после 3-х месяцев лечения экспериментальных животных растительным экстрактом приводила к значительному подавлению роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю (в 19 раз), статистически превышающему действие традиционного противолепрозного средства ДДС (в 2,1 раз), что статистически превышает действие прототипа (р<0,05).

Через 5 и 7 месяцев лечения животных экстрактом из растений Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha отмечалась та же тенденция к нормальной физиологической деятельности тканей и клеток в подушечках лапок экспериментальных животных, то есть действие экстракта способствовало подавлению размножения M.leprae в 15 раз больше по отношению к контролю и по отношению к лечению ДДС - в 1,7 раза.

При цитохимическом исследовании НГ крови мышей, длительно леченных комплексом препаратов, выявлено, что исследуемые растительные вещества активировали деятельность клеточных элементов макроорганизма (фагоцитов), доводя фагоцитоз до завершенного, способствуя повышению активности фермента МП. Активность МП была достаточно высокой к 3-му месяцу терапии в случае лечения растительным экстрактом и ДДС. В контроле (мыши без лечения) активность МП была низкой. К 5, 7 месяцам активность МП НГ крови опытных и интактных (незараженных) животных практически мало отличались (табл.5).

Кроме того, по данным вскрытия испытуемых и интактных животных (не зараженных мышей) определяли уровень токсичности исследуемого препарата на организм экспериментальных животных. Шерсть была опрятного вида, очагов облысения не определялось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Видимые слизистые оболочки были блестящими, гладкими, бледного цвета. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой. Желудок имел обычные размеры, просвет его был заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка была складчатая, однородного розоватого цвета. Раздражения, гиперемии не отмечалось. Слизистая оболочка тонкой кишки была бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки была также гладкой, слегка сероватого цвета.

Таблица 6 Влияние введения экстракта в дозе 0,5 мл/кг веса мыши на показатели гуморальных факторов Показатели Контроль Опыт Эритроциты, 10¹²/л 2,43±0,11 2,25±0,02 Гемоглобин, % 134±1,2 135±1,6 Лейкоциты, % 2,07±0,2 2,6±0,14 Эозинофилы, % 2,6±0,04 3,1±0,5 Лимфоциты, % 56,2±2,6 56,4±3,2 Моноциты, % 0,2±0,07 0,3±0,04 Палочкоядерные нейтрофилы, % 6,8±1,02 8,3±1,1 Сегментоядерные нейтрофилы, % 27±3,5 30,1±5,2 АлТ, мккат/л 0,55±0,08 0,53±0,12 АсТ, мккат/л 0,25±0,02 0,26±0,16

Исследование крови (табл.6) животных показало, что исследуемый экстракт не обладает сенсибилизирующим действием. Следовательно, исследуемый сборный экстракт не токсичен.

Таким образом, экстракт из Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha при ежедневном интрагастральном введении зараженным M.leprae животным в дозе 0,5 мл/кг способен оказывать эффективное ферментативное лизирующее антимикробное действие, снижая количество микобактериальных клеток в подушечках лап животных. Этому же способствует и увеличение миелопероксидазной активности клеток крови (нейтрофильных гранулоцитов) - основной системы, осуществляющей начальный киллинг клеток патогенных микроорганизмов, без которого невозможно их дальнейшее «переваривание». В этом случае отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и ДДС.

На всем протяжении опыта (9 месяцев) испытуемый экстракт хранился при комнатной температуре и не потерял своих антибактериальных свойств, а также не обладал побочными действиями.

Пример №4.

Условия эксперимента аналогичны примеру №1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного К. (ист.бол. №3866) и пассированных двухкратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали экстракт растительного сбора в дозе 0,2 мл/кг массы животных в сутки. Контроль осуществлялся аналогично примеру 1. Животных забивали через 3, 5 и 7 месяцев с момента лечения. Подсчитывали количество микобактерий в лапах мышей и уровень активности МП в НГ периферической крови мышей способом, указанным в примере 1.

Результаты представлены в табл.7.

Из таблицы 7 видно, что через 3, 5 и 7 месяцев лечения количество М.leprae в лапах мышей, леченных растительным сбором и ДДС, было практически одинаковым.

Таблица 7 Динамика размножения M.leprae и уровень МП в нейтрофилах периферической крови мышей при лечении растительным сбором (в дозе 0,2 мл/кг) (М±m) Показатель Период наблюдения (мес.) Интактные животные Контроль (без лечения) Лечение ДДС Испытуемый экстракт Число микобактерий (10⁶) 3 0 114,05±1,39 13,15±1,22* 12,81±4,41* 5 0 158,62±3,05 19,82±1,78* 20,06±6,95* 7 0 216,54±2,27 24,97±1,91* 24,66±1,13* Уровень МП (усл. ед.) 3 2,23±0,07 1,83±0,06 1,85±0,01 2,1±0,06 5 2,29±0,01 1,71±0,01 2,18±0,05* 2,23±0,03* 7 2,30±0,01 1,62±0,02 2,31±0,04* 2,35±0,02* Примечание. *р<0,05 по сравнению с контролем (без лечения).

Кроме того, по данным вскрытия испытуемых и интактных животных (незараженных мышей) определяли уровень токсичности исследуемого препарата на организм экспериментальных животных. Шерсть была опрятного вида, очагов облысения не определялось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой. Желудок имел обычные размеры, просвет его был заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка была складчатая, однородного розоватого цвета. Раздражения, гиперемии не отмечалось. Слизистая оболочка тонкой кишки была бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки была также гладкой, слегка сероватого цвета.

Исследование крови (табл.8) животных показало, что используемый экстракт не обладает побочным действием. Однако увеличение числа моноцитов может свидетельствовать о недостаточном лечении заболевания.

Таким образом, экстракт из Glycyrrhiza glabra, Helichrisum arenarium, Achillea micrantha при ежедневном интрагастральном введении зараженным M.leprae животным в дозе 0,2 мл/кг приводит к снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем, что является показателем активизации процессов завершенного фагоцитоза микроорганизмов. Хотя в этом случае не отмечено преобладание фармакологического эффекта по сравнению с прототипом (лечение экстрактом из корня солодки голой) и не отмечено статистически достоверного преобладания по сравнению с основным препаратом для лечения лепры - ДДС.

Таблица 8 Влияние введения экстракта в дозе 0,2 мл/кг веса мыши на показатели гуморальных факторов Показатели Контроль Опыт Эритроциты, 10¹²/л 2,13±0,14 2,2±0,29 Гемоглобин, % 131±0,03 129±0,46 Лейкоциты, % 3,1±2,1 4,5±0,3 Эозинофилы, % 2,1±0,02 0,7±0,7 Лимфоциты, % 52±2,9 54,5±2,3 Моноциты, % 0,2±0,02 1,06±0,05 Палочкоядерные нейтрофилы, % 7,2±0,82 12±1,2 Сегментоядерные нейтрофилы, % 26±3,3 30,6±4,2 АлТ, мккат/л 0,48±0,55 0,50±0,25 АсТ, мккат/л 0,27±0,9 0,26±0,41

На всем протяжении опыта (9 месяцев) испытуемый экстракт хранился при комнатной температуре и не потерял своих антибактериальных свойств, а также не обладал побочными действиями.

Пример №5.

Условия эксперимента аналогичны примеру №1. 150 мышей линии СВА (3 группы по 50 животных) заражали взвесью микобактерий лепры, выделенных от больного Б. (ист.бол. №3865) и пассированных двукратно на мышах. 1-й группе мышей после заражения давали растительный сбор, как показано в примере №1, но в дозе 1 мл/кг массы животных в сутки. Контроль и показатели определялись аналогично предыдущим примерам. Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9 Динамика размножения М.leprae и уровень МП в нейтрофилах периферической крови мышей при лечении растительным сбором (в дозе 1 мл/кг) (М±m) Показатель Период наблюдения (мес.) Интактные животные Контроль (без лечения) Лечение ДДС Испытуемый экстракт Число 3 0 108,58±1,46 12,70±1,15* 5,65±3,12*   5 0 181,62±1,54 17,31±1,62* 16,08±1,82*   7 0 315,18±5,87 40,83±1,52* 39,43±3,96* Уровень МП (усл. ед.) 3 2,23±0,03 1,76±0,03 2,18±0,04* 2,24±0,07* 5 2,19±0,04 1,7±0,02 2,24±0,02* 2,48±0,02* 7 2,25±0,02 1,58±0,02 2,27±0,01* 2,53±0,02* Примечание. *р<0,05 по сравнению с контролем (без лечения).

После 3-х месяцев лечения экспериментальных животных растительным экстрактом обнаружено значительное подавление роста M.leprae в подушечках лап мышей по отношению к контролю (в 19 раз), статистически превышающее действие традиционного противолепрозного средства ДДС (в 2,3 раз), что статистически превышает действие прототипа (p<0,05).

Через 5 и 7 месяцев лечение растительным сбором оказывало антимикробное действие, статистически не превышающее эффект монотерапии ДДС.

Хотя в случае лечения экстрактом из растений Glycyrrhizaglabra, Helichrisumarenarium, Achilleamicrantha в дозе 1 мл/кг веса мыши при цитохимическом исследовании НГ крови мышей выявлено значительное повышение активности внутриклеточной МП по сравнению с интактными животными (табл.9). Этот факт может объяснить снижение фармакологического эффекта при более длительном лечении высокими дозами экстракта.

Таким образом, лечение экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей растительным сбором в дозе 1 мг/кг массы мыши приводит к достоверному снижению количества возбудителя лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем только после 3-х месяцев лечения. При более длительном лечении отмечено снижение фармакологического эффекта по сравнению с прототипом и ДДС, что связано с чрезмерным повышением миелопероксидазной активности по сравнению с первыми тремя примерами и по отношению к незараженным животным

Кроме того, по данным вскрытия испытуемых и интактных животных (незараженных мышей) определяли уровень токсичности исследуемого препарата на организм экспериментальных животных. Шерсть была опрятного вида, очагов облысения не определялось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Видимые слизистые оболочки были блестящими, гладкими, бледного цвета. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой. Желудок имел обычные размеры, просвет его был заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка была складчатая,

Таблица 10 Влияние введения экстракта в дозе 1 мл/кг веса мыши на показатели гуморальных факторов Показатели Контроль Опыт Эритроциты, 10¹² /л 3,3±0,43 3,5±0,25 Гемоглобин, % 143±0,36 162±6,51 Лейкоциты, % 2,4±0,25 2,5±0,35 Эозинофилы, % 2,5±0,7 6,6±0,2 Лимфоциты, % 52±4,3 59,4±5,1 Моноциты, % 0,2±0,01 0,3±0,03 Палочкоядерные нейтрофилы, % 18,2±0,6 20±0,4 Сегментоядерные нейтрофилы, % 27±2,5 25±5,6 АлТ, мккат/л 0,43±0,03 0,55±0,02 АсТ, мккат/л 0,23±0,02 0,25±0,06

неоднородного цвета (от розоватого до красного). Отмечалось раздражение слизистой оболочка кишечника.

Исследование крови (табл.10) животных показало, что при интрагастральном введении сборного экстракта в дозе 1 мл/кг веса мыши наблюдается увеличение гемоглобина при неизменном количестве эритроцитов. Это может свидетельствовать о сгущении крови, связанном с дефицитом витамина В₁₂, фолиевой кислоты или о недостаточном функциональном состоянии селезенки.

Увеличение числа эозинофилов говорит об аллергической реакции организма экспериментальных животных на растительные компоненты растений.

Наблюдалось некоторое увеличение фермента АлТ, что может свидетельствовать о негативном влиянии сборного экстракта на печень экспериментальных мышей.

Таким образом, анализ приведенных примеров показывает, что лучшие результаты в отношении подавления роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей (антимикробный эффект) достигаются при лечении экспериментально зараженных микобактериями лепры мышей растительным сбором, содержащим корень солодки голой, траву тысячелистника мелкоцветкового и соцветия бессмертника песчаного в дозе 0,4-0,6 мл/кг массы животного, вводимые ежесуточно интрагастрально, что приводит к снижению количества возбудителей лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем (мыши без лечения) и по сравнению с лечением ДДС. При снижении дозы экстракта до 0,2 мл/кг массы тела животного отмечен худший терапевтический эффект по сравнению с прототипом.

При повышении доз до 1 мл/кг массы тела мыши отмечался и несколько лучший, но статистически недостоверный (р>0,05) антибактериальный эффект по сравнению с приведенной вначале дозой. Однако по данным вскрытия и исследованию крови животных наблюдалось некоторое негативное влияние исследуемого препарата на организм экспериментальных животных.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что ранее в фитотерапии экспериментальной лепрозной инфекции не использовалось сочетание с корнем солодки голой таких растений, как тысячелистник мелкоцветковый и цмин песчаный. Приготовление подобного растительного сбора активизирует большой набор биологических веществ, что повышает терапевтический эффект способа по сравнению с прототипом (только экстракт из корня солодки голой). Кроме того, авторами исследований показано отсутствие токсического влияния на макроорганизм в ходе лечения экспериментальной лепрозной инфекции.

Это отличие позволило получить положительный результат в виде:

- значительного подавления роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей с экспериментальной лепрозной инфекцией по сравнению с прототипом;

- предлагаемый способ позволяет повысить активность завершенного фагоцитоза M.leprae в макрофагах животных, что приводит к повышению терапевтической эффективности по сравнению с известным способом;

- определение доз растительного сбора, при которых отсутствовали побочные действия. Предлагаемый способ может быть рекомендован для осуществления в экспериментальных лабораториях системы здравоохранения и в дальнейшем использован в комплексной терапии больных лепрой.

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для лечения экспериментальной лепрозной инфекции. Для подавления размножения микобактерий лепры в лапах мышей, зараженных интраплантарно по методу Шепарда, используют терапевтические средства. При этом в качестве терапевтических средств используют растительный сбор. Сбор состоит из измельченных равных весовых частей корня солодки голой Glycyrrhiza glabra, травы тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha и соцветия бессмертника песчаного Helichrisum arenarium. Этот сбор экстрагируют приготовленным 40% водным раствором медицинского этилового спирта в соотношении 1 части сырья к 5 частям раствора и хранят при перемешивании в течение 6 суток. Затем добавляют к этой смеси равный объем буфера, содержащего в мас.%: хлористый кальций 0,014, хлористый калий 0,04, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,006, магний сернокислый 0,02, хлористый магний 0,02, хлористый натрий 0,08, натрий кислый углекислый 0,035, натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,024, глюкозу 0,1. Хранят еще 4 суток в прохладном месте при ежедневном встряхивании, фильтруют и трехкратно автоклавируют при 0,5 атм в течение 10 минут с последующим введением полученного экстракта экспериментальным мышам в дозе 0,4-0,6 мг/кг массы тела ежедневно через зонд в пищевод. Предлагаемое изобретение обеспечивает повышение терапевтической эффективности лечения за счет значительного подавления роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей, повышения активности завершенного фагоцитоза М. leprae в макрофагах животных, оптимального подбора доз при отсутствии побочных эффектов. 5 пр., 10 табл.

Способ лечения экспериментальной лепрозной инфекции, состоящий в подавлении размножения микобактерий лепры в лапах мышей, зараженных интраплантарно по методу Шепарда, отличающийся тем, что в качестве терапевтических средств используют растительный сбор, состоящий из измельченных равных весовых частей корня солодки голой Glycyrrhiza glabra, травы тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha и соцветия бессмертника песчаного Helichrisum arenarium, который экстрагируют приготовленным 40%-ным водным раствором медицинского этилового спирта в соотношении 1 части сырья к 5 частям раствора и хранят при перемешивании в течение 6 суток, затем добавляют к этой смеси равный объем буфера, содержащего в мас.%: хлористый кальций 0,014, хлористый калий 0,04, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,006, магний сернокислый 0,02, хлористый магний 0,02, хлористый натрий 0,08, натрий кислый углекислый 0,035, натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,024, глюкозу 0,1, хранят еще 4 суток в прохладном месте при ежедневном встряхивании, фильтруют и трехкратно автоклавируют при 0,5 атм в течение 10 мин с последующим введением полученного экстракта экспериментальным мышам в дозе 0,4-0,6 мг/кг массы тела ежедневно через зонд в пищевод.