СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕПРОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/00 C12N1/20 G09B23/28 C12Q1/00 C12R1/32 

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для моделирования лепрозной инфекции на лабораторных животных.

Из практики медицины известен способ стимуляции размножения микобактерий лепры в организме интраплантарно зараженной мыши, состоящий в том, что для подавления иммунитета, мышей до заражения подвергают тимэктомии и облучению кобальтовой пушкой в дозе 900 рентген (Rees R.J.W. Enhanced susceptibillity of thymectomiced and irradiated mice to infection with Mycobacterium leprae // Nature. 1966. V. 211, N 5049. Р. 657-658). При использовании этого способа достигается увеличение количества микобактерий в среднем на два порядка через 5 месяцев после заражения, а через 11 месяцев некоторая генерализация инфекции (бактериемия). К недостаткам приведенного способа следует отнести трудоемкость исполнения, связанного со сложными процедурами, требующими определенной квалификации, а также специальные условия содержания тимэктомированных животных.

Известен также способ моделирования лепрозной инфекции у мышей, когда до интраплантарного заражения добиваются предварительного снижения моноцитопоэза у животных (Вишневецкий Ф.Е. Юшин М.Ю. Кравцов В.Д. Фрейдлин И.С. Аркадьева Г. Е. Урляпова Н.Г. Способ моделирования лепры // А.С. N 1439665). Воздействие на макрофагальное звено иммунитета достигается многократным дренированием брюшной полости стимулированных раствором Хенкса животных. При этом через 6 месяцев после заражения удается добиться большего прироста биомассы в лапе по сравнению с контролем и в ряде случаев генерализации лепрозной инфекции с образованием лепроматозных структур во внутренних органах. К недостаткам способа следует отнести трудоемкость и травматичность операций (10-12 процедур дренажа брюшной полости мышей пастеровской пипеткой с диаметром капилляра 1,5-2 мм), а также большую вероятность нарушения стерильности.

Наиболее близким предлагаемому является способ моделирования лепрозной инфекции, заключающийся в том, что мышам в подушечку задней лапы в составе суспензии микобактерий лепры вводят синтетический тетрапептид-тафцин в дозах 0,2, 2 и 20 мкг на мышь (Вишневецкий Ф.Е. Фрейдлин И.С. Ющенко А.А. Вишневецкий Р.Ф. Анохина В.В. Урляпова Н.Г. Юшин М.Ю. Эскина И.М. Применение тафцина в экспериментальной лепрологии // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1991. N 8. С. 181-183). В ряде опытов тафцин вводился внутрибрюшинно в дозе 2 мкг на мышь еженедельно в течение всего срока эксперимента (до 7 месяцев). При осуществлении известного способа с добавлением тафцина к инокулируемой интраплантарной взвеси микобактерий лепры добиваются ускорения размножения микобактерий через 5 месяцев после заражения в 12 раз по сравнению с контролем.

Однако известный способ имеет недостатки:
ускорение размножения микобактерий лепры достигается медленнее лишь в 10-12 раз по сравнению с контролем:
вероятно низкая воспроизводимость результатов ввиду того, что тафцин известен как стимулятор фагоцитирующих клеток и обладает протективным эффектом при ряде инфекционных заболеваний, а по данным Iver R.R. Prasad H.K. Bhutani L. K. Rao D.N. Effect of tuftsin stimulation on the microbial activity exerted by blood monocytes-macrophages of leprosy patients // Int. J. Immunopharmac. 1990. Vol. 12. P. 859-869 макрофаги, полученные от здоровых лиц и больных погранично-туберкулоидной и туберкулоидной лепрой (ВТ, ТТ) демонстрируют устойчивое усиление фагоцитоза при стимуляции тафцином и медленное снижение микробицидного ответа.

Этот способ принят авторами в качестве прототипа.

Целью предлагаемого способа является ускорение размножения микобактерий лепры.

Поставленная цель достигается в изобретении тем, что за 1-2 ч до интраплантарного заражения мышей взвесью микобактерий лепры, пассированных от человека на мышах, в лапку мышей вводят раствор перекиси водорода в объеме 0,03-0,05 мл на мышь.

Отличительной особенностью осуществления способа является использование перекиси водорода в соответствующих дозировках. Кроме того, при осуществлении способа применяется неиспользуемый ранее метод введения перекиси водорода за 1-2 ч до заражения.

Сущность предлагаемого способа моделирования лепрозной инфекции с целью ускорения размножения микобактерий лепры заключается в следующем: за 1-2 ч до заражения мышам в подушечку правой задней лапы вводят 0,6%-ный раствор перекиси водорода в количестве 0,03-0,05 мл. Затем через 1-2 ч в подушечку той же лапы производят инокуляцию 0,03 мл взвеси микобактерий лепры, содержащей 10⁴ микробных тел. В качестве контроля этой же взвесью и в том же количестве микробных тел, но без предварительного введения перекиси водорода заражают группу мышей.

При осуществлении способа использовали взвесь микобактерий лепры, полученных из лепром нелеченной больной лепроматозным типом лепры и пропассированных двукратно интраплантарно на мышах.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в НИИ по изучению лепры в течение 1991-1393 гг. на 300 мышах линии CxBd с первоначальным весом 25-30 г.

Ниже приводятся результаты апробации. Все указанные опыты проведены с применением одной и той же взвеси микобактерий лепры.

Пример 1
50 мышам линии CxBd за 1 ч до заражения взвесью микобактерий лепры в подушечку правой задней лапы вводили 0,03 мл 0.6%-ного раствора перекиси водорода, приготовленного в стерильных условиях. Через 1 ч мышей интраплантарно (в ту же лапу) заражали взвесью микобактерий лепры (10⁴ микробных тел на мышь в объеме О,03 мл). В качестве контроля 50 мышам вводили ту же взвесь микобактерий лепры интраплантарно, в том же количестве и объеме, но без предварительного введения перекиси водорода.

Мышей забивали группами опыт-контроль по 5-6 животных из группы в сроки 3, 5, 7, 9 и 11 месяцев после заражения. Подсчитывалось количество микобактерий в лапе по методу Шепарда (Shepard C.C. McRae D.H. A method of counting acid-fast bacteria // Int. J. Lepr. 1968. Vol. 36. P. 78-82). Одновременно проводили исследование мазков-отпечатков из органов животных (легкое, печень, почка, селезенка) на присутствие микобактериальных клеток. При наличии микобактерий во внутренних органах эти органы брались для электронно-микроскопического изучения. Количество микобактериальных клеток во внутренних органах животных оценивалось по следующей схеме: ± наличие единичных кислотоустойчивых зерен в 1 поле зрения микроскопа; ± 1-20 кислотоустойчивых (к/у) микобактерий в 1 п/зр; ++ 20-50 к/у микобактерий в 1 п/зр; +++- много к/у микобактерий в 1 п/зр.

В табл. 1а приведены показатели подсчета количества микобактерий на лапу в опытной и контрольной сериях, а в табл. 16 результаты исследования мазков-отпечатков из органов животных.

Заключение. Предварительное введение (за 1 ч до заражения) интраплантарно мышам 0,03 мл 0,6%-ного раствора перекиси водорода приводит к достоверному ускорению размножения микобактерий лепры в подушечке лапы по сравнению с контролем. Через 5 месяцев после заражения соотношение количества микобактерий в опытной и контрольной сериях составило 27,5 1.

Через 5 месяцев с момента заражения отмечено появление к/у зерен, а через 7 месяцев много микобактериальных клеток в легких животных. К 9 месяцу отмечается большое количество микобактерий в селезенке мышей. При электронно-микроскопическом исследовании констатировано образование лепроматозных структур в вышеназванных органах животных с наличием микобактерий лепры.

Пример 2
Условия эксперимента аналогичны примеру 1. Дозировка 0,6%-ной перекиси водорода составила 0,05 мл. Перекись водорода вводилась интраплантарно за 2 ч до заражения. Опыт 50 мышей. Результаты опытов представлены в табл. 2а и табл. 2б.

Заключение. Введение за 2 ч до заражения 0,6%-ной перекиси водорода интраплантарно в объеме 0,05 мл приводит к достоверному ускорению роста микобактерий лепры в подушечке лапы мышей по сравнению с контролем. Через 5 месяцев после заражения отмечалось наличие кислотоустойчивых микобактерий в легких и позже в селезенке животных с развитием типичных лепроматозных структур.

Пример 3.

Условия эксперимента аналогичны примеру 1. Введено 0,04 мл 0,6%-ной перекиси водорода интраплантарно мышам за 1,5 ч до заражения. Опыт 50 мышей. Результаты опытов представлены в табл. 3а и табл. 3б.

Заключение. Введение за 1,5 ч до заражения 0,6%-ной перекиси водорода интраплантарно в объеме 0,04 мл приводит к достоверному ускорению роста микобактерий лепры в подушечке лап мышей по сравнению с контролем. Через 5-7 месяцев после заражения отмечается наличие микобактерий и лепроматозных структур в тканях легкого и селезенки мышей.

Пример N 4
Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 0,6%-ная перекись водорода вводилась интраплантарно мышам в количестве 0,02 мл за 0,5 ч до заражения. Опыт 50 мышей. Результаты представлены в табл. 4а и табл. 4б.

Заключение. Введение 0,6%-ной перекиси водорода интраплантарно мышам в объеме 0,02 мл за 0,5 ч до заражения не приводит к достоверному ускорению размножения микобактерий лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем. Микобактерий во внутренних органах животных не обнаружено.

Пример N 5
Условия эксперимента аналогичны примеру 1. 0,6%-ная перекись водорода вводилась интраплантарно мышам в объеме 0,07 мл за 3 ч до заражения. Опыт 50 мышей. Результаты представлены в табл. 5а и табл. 5б.

Заключение. Введение 0,6%-ной перекиси водорода в объеме 0,07 мл за 3 ч до заражения не приводит к достоверному ускорению размножения микобактерий лепры в подушечках лап мышей по сравнению с контролем. Микобактерий во внутренних органах животных не обнаружено.

Анализ приведенных примеров показывает, что наиболее стабильные результаты в отношении ускорения роста микобактерий лепры в подушечках лап мышей, а также генерализация процесса достигаются при дозировке 0,03-0,05 мл 0,6%-ной перекиси водорода, введенной за 1-2 ч до заражения.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что в предложенных способах моделирования лепры перекись водорода не применялась. Предлагаемым способом достигается ускорение роста микобактерий лепры по сравнению с прототипом в 2,5 раза.

Примененное в заявляемом способе направленное воздействие на фагоциты с помощью перекиси водорода (по данным проведенных авторами исследований, действующей на миелопероксидазную систему) является существенным отличием в подходе к моделированию лепры на иммунологически интактных мышах. Это отличие позволило получить положительный эффект в виде значительного сокращения сроков достоверного увеличения количества микобактерий в месте инокуляции и развития генерализации процесса в виде появления лепроматозных структур с наличием большого количества микобактерий лепры в легких и селезенке мышей через 5-7 месяцев после заражения.

Осуществление предлагаемого способа не требует дорогостоящих препаратов, технически не сложно в выполнении.

Таким образом, авторами представлен никем ранее не предлагаемый способ моделирования лепрозной инфекции, решающий основную задачу ускорение размножения микобактерий лепры.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для внедрения в экспериментальных лабораториях системы здравоохранения, занимающихся вопросами лепрологии.

Использование: медицина, лепрология, моделирование лепрозной инфекции на лабораторных животных. Сущность изобретения: за 1-2 ч до интраплантарного заражения мышей взвесью микобактерий лепры, пассируемых от человека на мышах, в лапу мыши вводят 0,6%-ный раствор перекиси водорода в объеме 0,03-0,05 мл на мышь. Способ приводит к достоверному ускорению роста микобактерий лепры в месте инокуляции и развитию генерализации процесса в виде появления лепроматозных структур в легких и селезенке мышей через 5-7 месяцев после заражения. 10 табл.

Способ моделирования лепрозной инфекции путем интраплантарного заражения мышей взвесью микобактерий лепры, отличающийся тем, что за 1 2 ч до интраплантарного заражения мышей взвесью микобактерий лепры в лапу мыши вводят 0,6% -ный раствор перекиси водорода в объеме 0,03 0,05 мл на мышь.