СПОСОБ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛЕПРОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции.

Из практики медицины известен способ вакцинации против лепры путем применения неспецифической противотуберкулезной вакцины BCG. В эксперименте способ заключается в предварительной (за 32 дня до заражения M.leprae) внутрикожной вакцинации мышей вакциной BCG (Шепард Ч. Сравнение эффективности двух лиофилизированных вакцин БЦЖ против заражения мышей Mycobacterium leprae // Бюл. ВОЗ, 1968, т.34, с. 130-135). Данный способ через 6 месяцев после заражения обеспечивает протективный эффект, колеблющийся в пределах от 0,21 до 0,83, а через 9 месяцев - от 0,1 до 0,8 (протективный эффект определяли путем подсчета разности логарифмов: lg среднего количества M.leprae в лапах мышей контрольной группы минус lg среднего количества M.leprae в лапах мышей опытной группы).

Основным недостатком способа является низкая эффективность противолепрозной защиты.

Известен также способ иммунологической защиты при экспериментальной лепрозной инфекции, при котором в качестве вакцины использовали M.vaccae. Способ состоит в том, что M.vaccae вводили внутрикожно мышам в дозе 1 • 10⁷ микобактерий на мышь за 28 дней до заражения (Shepard C.C., Landingham R.V., Walker L. L. Searches among mycobacterial cultures for antileprosy vaccines // Infect. and Immun. 1980, v. 29, N 3, p. 1034-1039). Этот способ позволяет достичь торможения развития M.leprae в лапе мыши на 0,41 (на 6 месяцев) и 0,95 (на 9 месяцев).

Недостатком способа является низкая степень защиты против лепрозной инфекции.

Наиболее близким к предлагаемому является способ иммунологической защиты против экспериментальной лепрозной инфекции, заключающийся в том, что за 28 дней до заражения M.leprae мышам внутрикожно вводили 3•10⁶ убитых микобактерий лепры (Shepard C.C. Vaccination of mice against M.leprae infection// Int. J. Lepr. 1976, v. 44, N 1-2, p.222-226). При осуществлении известного способа вакцинации мышей через 6 месяцев после заражения достигается протективный эффект, равный 1,6.

К недостаткам способа следует отнести:
- недостаточно выраженный протективный эффект;
- необходимость предварительного моделирования лепрозной инфекции на животных с целью наработки бактериальной массы M.leprae, используемой в качестве вакцины;
- невозможность полной очистки M.leprae от тканей организма-хозяина, что обуславливает вероятность развития аллергических и токсических реакций у прививаемых;
- отсутствие надежных методов стандартизации отдельных партий вакцины.

Этот способ принят авторами в качестве прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является усиление протективного эффекта при экспериментальной лепрозной инфекции.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в качестве вакцинного препарата используют культивируемые M.lufu.

Отличительной особенностью осуществления способа является использование в качестве вакционного препарата культивируемых M.lufu, ранее не используемых для профилактики лепры.

Проведенный анализ патентной научной литературы показал, что в известных способах вакцинопрофилактики лепры M.lufu не применялись. По данным научной литературы M.lufu пригодны как тест-штамм для первичного скрининга противолепрозных препаратов in vitro.

В заявленном способе применены культивируемые M.lufu в качестве вакцинного препарата для профилактики экспериментальной лепрозной инфекции, что используется впервые и является оригинальным.

В настоящее время существует несколько основных подходов к созданию вакцинных препаратов, обладающих протективными свойствами при лепре: это использование убитых M.leprae, выделенных из тканей экспериментально зараженных девятипоясных броненосцев; применение вакцины BCG; а также сочетание вакцины BCG с убитыми M.leprae. Разрабатывается и изучается в эксперименте протективное действие вакцин второго поколения, основанных на клонировании и экспрессии генов M.leprae в E.coli или вирусе коровьей оспы. Одним из подходов к получению вакцин при лепре также является использование культивируемых микобактерий. В экспериментах на модели Шепарда изучали протективный эффект M. bovis (BCG), M.chelonei, M.nonchromogenicum, M.phlei, M.smegmatis, M.vaccae и др. В полевых условиях испытываются вакцины, содержащие убитые культивируемые микобактерии, принадлежащие комплексу M.avium (ICRC; W), а также M.vaccae. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются M.leprae, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой для создания вакцинных препаратов. Получение этих препаратов осложняется еще и тем, что M.leprae, полученное в результате пассажа на лабораторных животных, необходимо выделить из инфицированных тканей организма-хозяина. Процесс очистки возбудителя лепры от тканей экспериментальных животных представляет собой сложный, трудоемкий, многоэтапный процесс, требующий участия квалифицированного персонала, специального оборудования и реагентов, что в свою очередь также затрудняет задачу получения вакцины.

Применение M.lufu в качестве вакцинного препарата является существенным отличием в подходе к созданию протективного эффекта при экспериментальной лепре и именно это отличие позволило получить более выраженный протективный эффект по сравнению с другими известными способами вакцинации при лепре. Кроме того, предлагаемый способ позволяет отказаться от использования в качестве вакцины M.leprae, которые не способны расти на искусственных питательных средах, а бактериальная масса M.leprae, полученная на экспериментально зараженных животных (мышах, крысах, броненосцах) требует последующей очистки от тканей макроорганизма.

Отсутствие общепринятого способа культивирования M.leprae на питательных средах затрудняет получение высокоэффективной противолепрозной вакцины.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для приготовления вакцинных препаратов M.lufu выращивали на среде Левенштейна-Йенсена (2 недели) и синхронизировали (+4^oC) 72 часа. Часть M.lufu перед синхронизацией выращивали на среде Школьниковой. M.lufu, выращенные на среде Школьниковой, использовали как живые, так и убитые. Для сравнения протективного эффекта, вызванного M. lufu, в качестве вакцинных препаратов использовали M.leprae (живые и убитые), M.vaccae (живые), стандартную вакцину BCG. Контролем служили животные, зараженные интраплантарно M.leprae, которым вакцинные препараты не вводили. M.vaccae выращивали на среде Левенштейна-Йенсена (2 недели) и синхронизировали при +4^oC 72 часа. Для приготовления вакцин из M.leprae использовали пассируемый на мышах штамм M.leprae (3 пассаж), выделенных непосредственно из кожных поражений больного лепроматозным типом лепры. С целью получения убитых вакцинных препаратов взвеси микобактерий автоклавировали при 120^oC в течение 30 минут. После автоклавирования осуществляли контрольной посев микобактерий на среду Левенштейна-Йенсена.

Эксперименты проводили на 100 мышах-самцах линии CBA. Вакцинные препараты в виде суспензии микобактерий вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 1•10⁷ микробных тел на мышь однократно за 1 неделю до заражения.

Животных заражали по методу Шепарда интраплантарно M.leprae в дозе 1 • 10⁴ микробных тел на мышь (Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads in mice// J.Exp. Med. 1960, v. 112, p. 445-454). В качестве материала для заражения использовали суспензию микобактерий, приготовленную из пассивируемого на мышах штамма M.leprae (3 пассаж), выделенных от нелеченого больного лепроматозной лепрой. Животных забивали на 5 и 9 месяцы после заражения. Степень протективной активности препаратов оценивали путем подсчета количества микобактерий в лапе по методу Шепарда (Shepard C.C., McRae D.H. A method of counting acid-fast bacteria//Int.J. Lepr. 1968, v.36, p.78-82).

Изложенная сущность изобретения поясняется табл. 1, где представлены результаты протективной активности вакцинных препаратов из различных микобактерий в сравнении с контрольными группами.

Таким образом, в табл. 1 показано значительное снижение количества микобактерий в лапах экспериментально зараженных животных при вакцинации их M. lufu по сравнению с вакцинацией M.leprae. При использовании в качестве вакцины живых M.lufu разница между контрольной и опытной группой составляет 2-3 порядка, тогда как при вакцинации животных M.leprae эта разница не превышает одного порядка.

Для определения показателей протективной активности вакцинных препаратов высчитывали разницу lg количества микобактерий в лапах мышей контрольной и опытных групп. Результаты приведены в табл. 2.

Таким образом, из представленной табл. 2 видно, что наиболее высокие показатели протективного действия отмечаются через 9 месяцев после заражения при использовании в качестве вакцины живых M.lufu, выращенных как на жидкой, так и на плотной питательной среде.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в НИИ по изучению лепры в 1994-1996 годах.

Ниже приводятся результаты апробации способа.

Пример 1.

Для приготовления вакцинных препаратов M. vaccae выращивали на среде Левенштейна-Йенсена (2 недели) и синхронизировали при +4^oC 72 часа. Вакцинные препараты в виде суспензии микобактерий вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 1•10⁷ микробных тел на мышь однократно за 1 неделю до заражения.

Животных заражали по методу Шепарда интраплантарно M.leprae в дозе 1•10⁴ микробных тел на мышь (Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads in mice// J.Exp. Med. 1960, v. 112, p. 445-454). В качестве материала для заражения использовали суспензию микобактерий, приготовленную из пассивируемого на мышах штамма M. leprae (3 пассаж), выделенного от нелеченого больного лепроматозной лепрой. Контролем служили зараженные животные, которым вакцинные препараты не вводили. Животных забивали на 5 и 9 месяцы после заражения. Степень протективной активности препаратов оценивали путем подсчета количества микобактерий в лапе по методу Шепарда (Shepard C. C. , McRae D.H. A method of counting acid-fast bacteria//Int. J. Lepr. 1968, v. 36, p.78-82). Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о низкой протективной активности вакцины из M.vaccae (на 5-й месяц - 0,07; на 9-й месяц - 0,49).

Пример 2.

Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве вакцинного препарата использовали стандартную вакцину BCG. Результаты представлены в табл. 4.

Результаты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о низкой протективной активности стандартной вакцины BCG (на 5-й месяц - 0,01; на 9-й месяц - 0,31).

Предлагаемым способом достигается выраженный протективный эффект при экспериментальной лепрозной инфекции, который на 2-3 порядка выше по сравнению с прототипом. Исключается необходимость предварительного моделирования лепрозной инфекции на животных с целью накопления бактериальной массы, используемой в качестве вакцины. Снижается вероятность возникновения аллергических и токсических реакций у прививаемых. Достигается упрощение стандартизации партий вакцин, поскольку вакцинный препарат готовят непосредственно из культивируемых микобактерий.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано, в частности, для иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции. При вакцинации животных перед интраплантарным заражением в качестве вакцинного препарата вводят культивируемые M.lufu. Способ позволяет усилить протективный эффект, снизить вероятность возникновения аллергических и токсических реакций. 4 табл.

Способ иммунопрофилактики лепры в эксперименте, заключающийся в вакцинации животных перед интраплантарным заражением, отличающийся тем, что в качестве вакционного препарата используют культивируемые М. lufu.