СОЕДИНЕНИЯ 2-(2-ОКСОИНДОЛИН-3-ИЛИДЕН)МЕТИЛ-5-(2-ГИДРОКСИ-3-МОРФОЛИН-4-ИЛПРОПИЛ)-6,7 ДИГИДРО-1-Н-ПИРРОЛ[3,2-С]ПИРИДИН-4(5Н)-ОНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗЫ Российский патент 2013 года по МПК C07D417/04 C07D209/30 C07D209/04 A61K31/437 A61P35/00 

Область техники

Данное изобретение относится к серии новых конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина, в частности к новым производным 2-(2-оксоиндолин-3-илиден)метил-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-6,7-дигидро-1Н-пиррол[3,2-с]пиридин-4(5Н)-она, к их получению, к фармацевтическим композициям, содержащим такие производные, и к применению таких производных в качестве терапевтических агентов, в частности в качестве ингибиторов протеинкиназ.

Предшествующий уровень техники

Передача сигнала в клетке является фундаментальным механизмом, посредством которого внеклеточные сигналы перенаправляются во внутреннее пространство клеток и в дальнейшем регулируют различные клеточные процессы. Эти сигналы регулируют множество физиологических ответов в клетке, включая пролиферацию, дифференциацию, апоптоз и подвижность. Внеклеточные сигналы принимают форму разнообразных растворимых факторов, включая факторы роста, а также паракринные, аутокринные и эндокринные факторы. Посредством связывания со специфичными трансмембранными рецепторами лиганды факторов роста передают внеклеточные сигналы на внутриклеточные сигнальные пути, вызывая тем самым ответ индивидуальной клетки на внеклеточные сигналы. Многие из этих процессов передачи сигнала используют обратимый процесс фосфорилирования белков, в который вовлечены специфичные протеинкиназы и фосфатазы.

Протеинкиназы (ПК) играют решающую роль в процессе передачи сигнала. Они переносят гамма-фосфатную группу АТФ на специфический аминокислотный остаток в функциональном белке, что приводит в результате к серии биологических ответов. Протеинкиназы классифицируют на две группы в соответствии с аминокислотной специфичностью в качестве субстрата в процессе фосфорилирования: серин/треонинкиназы (СТК) и протеинтирозинкиназы (ПТК).

Механизм фосфорилирования тирозина широко распространен в процессе передачи сигнала и контролирует несколько клеточных функций, таких как митоз, развитие клеточного цикла и дифференциация и т.д. (Hanks and Hunter, 1995, FASEB J. 9:576-596; Cadena and Gill, 1992, FASEB J. 6:2332-2337; Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391; Vandergeer et al., 1994, Annu. Rev. Cell Biol. 10:251-337). Показано, что мутация, нерегулируемый или чрезмерно высокий уровень экспрессии протеинтирозинкиназ приводит к переходу нормальной клетки к неопластическому фенотипу (Chiao et al., 1994, Cancer Metast. Rev. 9:63-80; Hunter, 1991, Cell 64:249-270).

Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) был идентифицирован как неспецифический фактор роста, действующий на эндотелиальную клетку сосудов, и было показано, что он имеет разнообразные функции, такие как стимуляция пролиферации эндотелиальных клеток, повышение проницаемости микрососудов и индукция ангиогенеза (Hanks and Hunter, 1995, FASEB J. 9:576-596). Известно, что ФРЭС является наиболее эффективным и непосредственно действующим ангиогенным белком. Он является диффундирующим эндотелиальным клеточно-специфичным митогеном и фактором роста сосудов (Ferrara N et al., Endocr Rev, 1997, 18, 4-25; Tofimura Tet al., Hum Pathol, 1998, 29, 986-991). Семейство ФРЭС (VEGF) в настоящее время включает шесть известных членов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (ПлФР, PDF), представляющих собой димерные гликопротеины. Все члены семейства ФРЭС содержат характерные регулярно расположенные восьмицистеиновые остатки, относящиеся к мотиву, называемому "цистеиновым узлом". Авторы Li ling et al. (Li ling et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2002, 34(1), 21-27) выявили высокую экспрессию ФРЭС в злокачественных опухолевых клетках, а также высокую экспрессию Flk-1, которая подразумевает существование как аутокринной, так и паракринной петель ФРЭС внутри опухоли. Существует четкая корреляция экспрессии ФРЭС с плотностью внутриопухолевой микрососудистой сети, и существует корреляция концентрации ФРЭС в тканях с прогнозом солидной опухоли, такой как рак молочной железы, рак легкого, рак простаты и колоректальный рак. Известно, что гипоксия играет решающую роль в стимуляции экспрессии ФРЭС. В дополнение к повышению скорости транскрипции гена, гипоксия, индуцирующая экспрессию гена ФРЭС в опухолевой клетке, также способствует стабилизации иРНК ФРЭС. Идентифицированы три различных члена, которые принадлежат к семейству VEGFR (РФРЭС): VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/Flk-1/KDR и VEGFR-4/Flt-4. VEGFR-1 и VEGFR-2 принадлежат к рецепторам тирозинкиназы, расположенным на поверхности клетки, экспрессия которых, главным образом, ограничена клетками эндотелия сосудов опухоли. Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и рецептор фактора роста эндотелия сосудов (РФРЭС) играют важную роль в процессе опухолевого ангиогенеза, и их оценивают как важную мишень противораковой биотерапии.

Обсуждают пять стратегий, направленных на ФРЭС(VEGF) и РФРЭС(VEGFR) для противоопухолевой терапии, как описано ниже: 1. Генотерапия (Ellis LM et al. J Biol Chem 1998, 273, 1052-1057): ФРЭС и РФРЭС вовлечены в положительную регуляцию опухолевого ангиогенеза. Генотерапия снижает экспрессию ФРЭС/РФРЭС или прерывает пути передачи сигнала с ингибированием их биологических активностей. 2. Моноклональные антитела анти-VEGF/VEGFR (Gordon M et al. Proc Am Soc Clin Oncol, 1998, 17, 2IIa): моноклональные антитела против ФРЭС/РФРЭС блокируют секретируемые ФРЭС и РФРЭС и прерывают внутриклеточную передачу сигнала, запускаемую ФРЭС, с ингибированием ангиогенеза. 3. Низкомолекулярные ингибиторы: серия соединений su, разработанная Sugen. 4. Растворимый РФРЭС: он связывается с ФРЭС, но не влияет на передачу сигнала. 5. Направленная терапия: два основных рецептора ФРЭС Flt-1 и Flk-1/KDR экспрессируются в клетках эндотелия сосудов опухоли, но не могут быть обнаружены при присоединении к эндотелию сосудов нормальной ткани. Следовательно, ФРЭС и РФРЭС обеспечивают специфичную мишень для противоопухолевой терапии. Для противоопухолевой терапии ФРЭС можно комбинировать с другими противоопухолевыми агентами, токсинами, радионуклидами.

Настоящее изобретение направлено на разработку аналогов формулы (I), основываясь на ингибиторе тирозинкиназы SU-14813 и эффективном противораковом агенте, которым являются конденсированные с пирролом шестичленные азагетероциклические производные, представленные на формуле А. Соединения по изобретению обладают очевидными структурными отличиями от существующих соединений на предшествующем уровне техники, и они также проявляют большую эффективность и большую функциальность.

Описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на конкретные соединения конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина, имеющие формулу (I), в частности, на новые ингибиторы протеинтирозинкиназы, соединения 2-(2-оксоиндолин-3-илиден)метил-5-(2-гидроксил-3-морфолин-4-илпропил)-6,7-дигидро-1Н-пиррол[3,2-с]пиридин-4(5Н)-она, их таутомеры, энантиомеры, физиологически приемлемые соли, метаболиты, метаболитные пролекарства и их активности в регуляции активностей протеинкиназ.

где каждый из R₁, R₂, R₃, R₄ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, арила, C_5-6 гетероарила, имеющего от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, -OR₅, -NR₅R₆ и -NR₅COR₆, где указанный арил или С_5-6 гетероарил, имеющий от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкоксила и галогена;

каждый из R₅ и R₆ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, где указанный алкил является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из арила, галогенарила, гидроксила и алкоксила.

Репрезентативные соединения по данному изобретению включают следующие не ограничивающие их соединения:

или их фармацевтически приемлемые соли,

где фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению представляют собой соли, образованные настоящими соединениями и яблочной или малеиновой кислотами.

Другой аспект данного изобретения направлен на фармацевтическую композицию, ингибирующую протеинкиназы и содержащую соединения конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина, имеющие формулу (I), или их фармацевтически приемлемые соли, носители или эксципиенты.

Другой аспект данного изобретения направлен на способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, включающий приведение в контакт данной протеинкиназы с соединениями конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина, имеющими формулу (I), или их фармацевтически приемлемыми солями, носителями или эксципиентами. Указанные протеинкиназы выбраны из рецепторных тирозинкиназ (РТК), нерецепторных протеинтирозинкиназ (ПТК) и серин/треонинпротеинкиназ (СТПК).

В другом аспекте данное изобретение направлено на применение соединений конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина, имеющих формулу (I), для получения лекарственного средства для лечения расстройств, связанных с протеинкиназой, где расстройства, связанные с протеинкиназой, выбраны из расстройств, связанных со следующими протеинкиназами: EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, PDGFR, VEGFR-2, c-Kit, c-Met, FGFR и Flt3.

Другой аспект данного изобретения представляет собой способ получения конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированный морфолина, имеющих формулу (I), или их фармацевтически приемлемых солей, где данный способ получения включает следующие стадии:

нагревание в атмосфере азота оптически активного соединения 1-амино-3-морфолин-4-илпропан-2-ола (Ia) с 2-трет-бутиловым, 4-этиловым диэфиром 5-карбоксиметил-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты в ацетонитриле в присутствии 1-гидроксибензотриазола и N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимида с получением хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib);

нагревание в атмосфере аргона хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib) с соляной кислотой в этаноле до образования флегмы с получением оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic);

последующее нагревание оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic) с бораном в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) до образования флегмы с получением путем избирательного восстановления этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id);

последующее нагревание в атмосфере аргона этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id) с моногидратом гидроксида лития в гликоле до образования флегмы с получением циклизованного продукта, представляющего собой оптически активный конденсированный с пирролом шестичленный азагетероцикл (Ie);

взаимодействие оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероцикла (Ie) с оксихлоридом фосфора и N,N-диметилформамидом (ДМФ) в безводном дихлорметане при комнатной температуре с получением путем реакции формилирования оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If);

на последней стадии нагревание оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If) с различными индолинонами в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиперидин, в течение 2~12 часов с получением целевого продукта, относящегося к хиральным конденсированным с пирролом шестичленным азагетероциклическим производным гидроксилированного морфолина формулы (I);

где R₁, R₂, R₃, R₄ представляют собой такие, как описано выше.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, приведенные ниже термины, используемые в описании и формуле изобретения, имеют значения, обсуждаемые ниже.

"Алкил" относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, включающей прямоцепочечные и разветвленноцепочечные группы из 1-20 атомов углерода. Предпочтительно алкильная группа представляет собой алкил среднего размера, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, 2-пропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, пентил и тому подобные. Более предпочтительно, он представляет собой низший алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, 2-пропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, и тому подобные. Алкильная группа может быть замещена или не замещена. В случае замещении замещающая группа (группы) может быть выбрана из группы, состоящей из галогена, гидроксила, алкоксила, арила, гетероарила, галогенарила, арилоксила, карбоновой кислоты, эфира карбоновой кислоты, -OR₅, -NR₅R₆, -COR₅ и -NR₅COR₆.

"Арил" относится к группам, имеющим по меньшей мере одно ароматическое кольцо, то есть имеющим конъюгированную систему пи-электронов, включая полностью углеродную циклическую арильную, гетероарильную и биарильную группу. Данная арильная группа может быть замещена или не замещена. В случае замещении замещающая группа (группы) может быть выбрана из группы, состоящей из галогена, алкоксила, алкила, гидроксила, арилоксила, карбоновой кислоты, эфира карбоновой кислоты, -OR₅, -NR₅R₆, -COR₅ и -NR₅COR₆.

"Гетероарил" относится к арилу, имеющему от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из группы, состоящей из О, S и N, в качестве атомов, находящихся в кольце, где остальные атомы в кольце представляют собой С. Указанное кольцо представляет собой 5- или 6-членное кольцо. Примеры гетероарильных групп включают фурил, тиенил, пиридил, пирролил, N-алкилпирролил, пиримидинил, пиразинил, имидазолил и подобные. Гетероарильная группа может быть замещена или не замещена. В случае замещения замещающая группа (группы) может быть выбрана из группы, состоящей из галогена, алкоксила, алкила, гидроксила, арилоксила, карбоновой кислоты, эфира карбоновой кислоты, -OR₅, -NR₅R₆, -COR₅ и -NR₅COR₆.

"Гидроксил" относится к группе -ОН.

"Алкоксил" относится к обеим группам -О-(алкил) и -O-(незамещенный циклоалкил). Показательные неограничивающие примеры включают метокси, этокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклогексилокси и подобные. Алкоксильная группа может быть замещена или не замещена. В случае замещения замещающая группа (группы) может быть выбрана из группы, состоящей из галогена, гидроксила, алкоксила, арила, гетероарила, галогенарила, арилоксила, карбоновой кислоты, эфира карбоновой кислоты, -OR₅, -NR₅R₆, -COR₅ и -NR₅COR₆.

"Арилоксил" относится к обеим группам -O-арил и -O-гетероарил, где арил и гетероарил являются такими, как определено выше. Показательные неограничивающие примеры включают фенокси, пиридинилокси, фуранилокси, тиенилокси, пиримидинилокси, пиразинилокси и подобные, и их производные. Арилоксильная группа может быть замещена или не замещена. В случае замещения замещающая группа (группы) может быть выбрана из группы, состоящей из галогена, алкоксила, алкила, гидроксила, арилоксила, карбоновой кислоты, эфира карбоновой кислоты, -OR₅, -NR₅R₆, -COR₅ и -NR₅COR₆.

"Галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду, предпочтительно фтору или хлору.

"Галогеналкокси" относится к -О-(галогеналкил). Показательные неограничивающие примеры включают трифторметокси, трибромэтокси и подобные.

"Карбоновая кислота" относится к (алкил) С(=O)ОН.

"Карбоксилат" относится к (алкил) С(=O)O (алкил).

"Необязательный" или "необязательно" означает, что описанное далее событие или обстоятельство может иметь или не иметь место, и что описание включает случаи, где событие или обстоятельство может иметь или не иметь место. Например, "гетероциклическая группа, необязательно замещенная алкильной группой" означает, что алкил может присутствовать или отсутствовать, и описание включает ситуации, где гетероциклическая группа замещена алкильной группой, и ситуации, где гетероциклическая группа не замещена алкильной группой.

"Фармацевтическая композиция" относится к смеси из одного или более чем одного соединений, описанных в данном документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые эксципиенты. Цель фармацевтической композиции состоит в облегчении введения соединения в организм.

Способы получения

С целью выполнения задачи настоящего изобретения в изобретении применено следующее техническое решение:

Способ получения соединений конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, включающий следующие стадии:

в качестве исходного вещества используют оптически активное соединение 1-амино-3-морфолин-4-илпропан-2-ола (Ia) (полученное в соответствии с патентом US 20040209937), нагревание в атмосфере азота оптически активного 1-амино-3-морфолин-4-илпропан-2-ола (Ia) с 2-трет-бутиловым, 4-этиловым диэфиром 5-карбоксиметил-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты в ацетонитриле до образования флегмы в присутствии 1-гидроксибензотриазола и N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимида с получением хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib); нагревание в атмосфере аргона хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib) с соляной кислотой в этаноле до образования флегмы с получением оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic); последующее нагревание в безводном тетрагидрофуране оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic) с бораном до образования флегмы и получения путем избирательного восстановления этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id); последующее нагревание в атмосфере аргона этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id) с моногидратом гидроксида лития в гликоле до образования флегмы с получением циклизованного продукта оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетеро цикла (Ie); взаимодействие оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероцикла (Ie) с оксихлоридом фосфора и N,N-диметилформамидом в безводном дихлорметане при комнатной температуре с получением путем реакции формилирования оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If); на последней стадии нагревание оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If) с различными индолинонами в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиперидин в течение 2~12 часов с получением целевого продукта, относящегося к хиральным конденсированным с пирролом шестичленным гетероциклическим производным гидроксилированного морфолина формулы (I), где ключевой методикой является избирательное восстановление субстрата (Ic) бораном и циклизация субстрата (Id), катализируемая щелочным катализатором моногидратом гидроксида лития. Что касается последнего, нет соответствующих ссылок на подход к созданию такой конденсированной с пирролом шестичленной лактамовой структуры.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его соль в эффективной терапевтической дозе, а также фармацевтически приемлемые носители.

Данное изобретение далее относится к применению соединений по изобретению формулы (I) или их солей при получении лекарственного средства, такого как ингибитор протеинкиназы.

Предпочтительные осуществления

Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения, но эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Структуру соединения идентифицировали с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или масс-спектрометрии (МС). Химические сдвиги ЯМР (δ) приведены в миллионных долях (млн^-1). ЯМР определяли с помощью прибора Bruker AVANCE-400. Растворитель представлял собой дейтерированный хлороформ (CDCl₃) и дейтерированный диметилсульфоксид (ДМСО-d6) с тетраметилсиланом (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (млн^-1).

МС определяли с помощью масс-спектрометра FINNIGAN LCQAd (ИЭР, ионизация электрораспылением).

Тонклослойный силикагель представлял собой пластину силикагеля Yantai Huanghai HSGF254 или Qingdao GF254.

В колоночной хроматографии обычно использовали силикагель Yantai Huanghai 200-300 меш в качестве носителя.

ДМСО-D₆: дейтерированный диметилсульфоксид.

CDCl₃: дейтерированный хлороформ.

Примеры получения

Пример 1

(R,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Стадия 1

(S)-2-Трет-бутиловый, 4-этиловый диэфир 5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты

(S)-1-Амино-3-морфолин-4-илпропан-2-ол формулы 1а (15,125 г, 94,5 ммоль), 2-трет-бутиловый, 4-этиловый диэфир 5-карбоксиметил-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты (32,34 г, 104 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (25,5 г, 189,06 ммоль) и N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимид (36,2 г, 189,06 ммоль) растворяли в 450 мл ацетонитрила при перемешивании при комнатной температуре, и реакционную смесь перемешивали при 50°С на масляной бане в течение 3 часов. Реакция была завершена, когда тонкослойная хроматография (ТСХ) показала исчезновение исходных веществ, и растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 150 мл насыщенного рассола. Смесь экстрагировали смесью растворителей этилацетата и тетрагидрофурана (V:V=4:1, 200 мл × 5). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали для удаления высушивающего агента. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением масла (75 г). Масло очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, (S)-2-трет-бутилового, 4-этилового диэфира 5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты 1b (30 г, выход 70%) в виде светло-коричневого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 454,4 [М+1]

Стадия 2

Этиловый эфир (S)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты

(S)-2-Трет-бутил, 4-этиловый диэфир 5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты формулы 1b (25,7 г, 56,7 ммоль) растворяли в 70 мл безводного этанола при перемешивании в атмосфере аргона, а затем к раствору добавляли по каплям 71 мл соляной кислоты (12 Н) в бане с водой со льдом. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали. Реакционную систему перемешивали при 60°С на масляной бане в течение 1,5 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и реакционную систему доводили до pH примерно 7 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия в бане, содержащей сухой лед-ацетон, и образовывалось большое количество осадков. Смесь фильтровали и отфильтровальный осадок промывали этанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя и остаток доводили до pH примерно 10 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия. Смесь экстрагировали дихлорметаном (150 мл × 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, этилового эфира (S)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 1 с (16,9 г, выход 84%) в виде темно-зеленого масла.

По данным МС m/z (ИЭР): 354,3 [М+1]

Стадия 3

Этиловый эфир (S)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты

Этиловый эфир (S)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 1 с (16,9 г, 47,9 ммоль) растворяли в 143,6 мл безводного тетрагидрофурана в атмосфере аргона, а затем к раствору добавляли комплекс боран-тетрагидрофуран в тетрагидрофуране (143,6 мл, 1 моль/л, 143,6 ммоль) в бане с водой со льдом. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали. Реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и кипятили с обратным холодильником при 95°С на масляной бане в течение 1 часа. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 150 мл соляной кислоты (2 Н). Смесь перемешивали в течение 0,5 часа, а затем добавляли 50 мл ледяной воды. Смесь доводили до pH примерно 10 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия и экстрагировали этилацетатом (200 мл × 2). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, этилового эфира (S)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 1d (15,6 г, выход 96%) в виде коричневого масла. По данным МС m/z (ИЭР): 340,3 [М+1]

Стадия 4

(R)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Этиловый эфир (S)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 1d (16,2 г, 47,9 ммоль) и моногидрат гидроксида лития (8 г, 190,6 ммоль) растворяли в 50 мл гликоля при перемешивании в атмосфере аргона. Реакционную систему перемешивали при 135°С на масляной бане в течение 50 минут. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 150 мл насыщенного рассола. Смесь экстрагировали дихлорметаном (150 мл × 5). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (150 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением масла (12,3 г). Масло очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 1е (7.9 г, выход 60,6%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 294,2 [М+1]

Стадия 5

(R)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид

Оксихлорид фосфора (674 мкл, 4.04 ммоль) и N,N-диметилформамид (963 мкл, 12,32 ммоль) растворяли в 21,18 мл дихлорметана при перемешивании при комнатной температуре и реакционный раствор перемешивали в течение 15 минут, при этом поддерживая температуру -10°С в бане с водой со льдом. (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он формулы 1е (790 мг, 2,7 ммоль) растворяли в 10 мл дихлорметана при перемешивании, а затем этот раствор добавляли по каплям к вышеописанной реакционной системе. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали и реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение дополнительных 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и реакционную систему охлаждали ледяной водой и перемешивали в течение 15 минут. Смесь доводили до pH примерно 12 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия и экстрагировали смесью растворителей дихлорметана и метанола (V:V=20:1, 100 мл × 8). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (150 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением сырого продукта (800 мг). Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке,

(R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегида формулы 1f (650 мг, выход 75%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 322,6 [М+1]

Стадия 6

(R,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидро-пирроло[3,2-с]пиридин-4-он

(R)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 1f (200 г, 0,623 ммоль), 5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он (84,67 мг, 0,56 ммоль) и пиперидин (30,8 мкл, 0,31 ммоль) растворяли в 1,09 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную систему перемешивали при 80°С на масляной бане в темноте в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и масляную баню убирали. Реакционной системе давали охладиться до комнатной температуры для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке, (R,Z)-2-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 1 (256 мг, 90%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 455,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,674 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,945 (s, 1H, NH-группа индола), 7,771~7,800 (m, 1H, -ArH), 7,762 (s, 1H, -СН=С), 6,927~6,978 (dd, 1H, -ArH), 6,842~6,874 (d, 1H, -ArH), 4,707~4,719 (d, 1H, -ОН), 3,900~3,915 (m, 1H, -CHO), 3,704~3,748 (dd, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца, содержащего N амидного происхождения), 3,616~3,695 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,563~3,585 (t, 4Н, 2×-CH₂O морфолина), 3,105~3,158 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,433 (t, 2H, CH₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,545 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,420~2,431 (m, 2H, -CH₂N, -CH₂N морфолина), 2,420~2,431 (m, 2H, -CH₂N, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,304~2,330 (t, 2H, внутренняя CH₂N-группа морфолина).

Пример 2

(R,Z)-2-(5-Хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано в стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 5-хлор-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(R,Z)-2-(5-хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфо лин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 2 (42 мг, выход 64%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 471,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,727 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,039 (s, 1H, NH-группа индола), 8,003 (m, 1H, -ArH), 7,814 (s, 1H, -СН=С), 7,166~7,141 (dd, 1H, -ArH), 6,890-6,869 (d, 1H, -АгН), 4,713-4,700 (d, 1H, -ОН), 3,907-3,892 (m, 1H, -CHO), 3,626~3,567 (t, 4H, 2×-CH₂O-группы морфолина), 3,152~3,099 (dd, 1H, наружная CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,027~2,994 (t, 2H, CH₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,547 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,328~2,290 (t, 2H, внутренняя CH₂N-группа морфолина).

Пример 3

2-[(Z)-4-(2,3-Дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-[(R)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Стадия 1

4-(4,4,5,5-Тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-индол

4-Бром-1Н-индол формулы 3а (29,4 г, 150 ммоль) растворяли в 600 мл диметилсульфоксида при перемешивании в атмосфере аргона, а затем к раствору добавляли бис(пинаколато)дибор (41,9 г, 165 ммоль), ацетат калия (44,1 г, 450 ммоль) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (3,6 г, 4,8 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при 80°С на масляной бане в течение 22 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и к реакционной смеси добавляли 2 л воды. Смесь экстрагировали этилацетатом (2 л × 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (2 л × 5), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле и перекристаллизовали с получением соединения, указанного в заголовке, 4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-индола формулы 3b (20 г, выход 60%) в виде белого твердого вещества. По данным МС m/z (ИЭР): 243,9 [М+1]

Стадия 2

4-(2,3-Дифторфенил)-1Н-индол

4-(4,4,5,5-Тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-индол формулы 3b (1,22 г, 5 ммоль) растворяли в 20 мл тетрагидрофурана при перемешивании в атмосфере аргона, а затем к раствору добавляли 1-бром-2,3-дифторбензол (0,97 г, 5 ммоль), тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,17 г, 0,15 ммоль) и 7 мл раствора гидроксида натрия (2 М). После завершения добавления реакционную систему перемешивали при 75°С на масляной бане в течение ночи. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь естественным путем охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (10 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении. Полученное в результате твердое вещество очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, 4-(2,3-дифторфенил)-1Н-индола формулы 3 с (800 мг, выход 70%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 228,4 [М-1]

Стадия 3

4-(2,3-Дифторфенил)-1,3-дигидроиндол-2-он

4-(2,3-Дифторфенил)-1Н-индол формулы 3 с (744 мг, 3,25 ммоль) растворяли в 12 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре, к раствору последовательно добавляли 21 мл трет-бутанола, 6,4 мл ледяной уксусной кислоты и трибромид пиридиния (3,12 г, 9,7 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов, а затем к смеси добавляли 16 мл ледяной уксусной кислоты и цинковую пыль (1,1 г, 16,25 ммоль). Реакционную смесь перемешивали еще в течение 1 часа, фильтровали для удаления остатка и концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли 30 мл этилацетата, последовательно промывали 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и 10 мл насыщенного рассола, сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали для удаления высушивающего агента. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, 4-(2,3-дифторфенил)-1,3-дигидроиндол-2-она формулы 3d (780 мг, выход 97%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 246,6 [М+1]

Стадия 4

2-[(Z)-4-(2,3-Дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-[(R)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

(R)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 1f (50 мг, 0,156 ммоль), 4-(2,3-дифторфенил)-1,3-дигидроиндол-2-он 3d (34,3 мг, 0,14 ммоль) и пиперидин (7,7 мкл, 0,078 ммоль) растворяли в 0,3 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную систему перемешивали при 80°С на масляной бане в темноте в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и масляную баню убирали. Реакционную систему охлаждали естественным путем до комнатной температуры для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке, 2-[(Z)-4-(2,3-дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-[(R)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 3 (56 мг, выход 73%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 549,3 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,583 (s, 1Н, NH-группа пиррола), 11,164 (s, 1H, NH-группа индола), 7,647~7,604 (m, 1H, -ArH), 7,462~7,411 (m, 1H, -ArH), 7,342~7,308 (m, 1H, -ArH), 7,277~7,239 (m, 1H, -ArH), 7,017~6,997 (d, 1H, -ArH), 6,898~6,879 (d, 1H, -ArH), 6,716 (s, 1H, -CH=C), 4,671 (s, 1H, -OH), 3,854 (m, 1H, -CHO), 3,673~3,540 (m, 7H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,124~3,077 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,986~2,954 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,402~2,392 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,279-2,265 (d, 2H, CH₂N-группа морфолина), 1,884 (s, 3H, пиррол-СН₃).

Пример 4

(R,Z)-2-(5-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 5-бром-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(R,Z)-2-(5-бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 4 (24 мг, выход 50%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 517,6 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,723 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,047 (s, 1H, NH-группа индола), 8,131 (s, 1H, -ArH), 7,820 (s, 1H, -СН=С), 7,292~7,271 (dd, 1H, -ArH), 6,847~6,827 (d, 1H, -ArH), 4,713~4,702 (d, 1H, -ОН), 3,897 (m, 1H, -CHO), 3,626~3,569 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,153~3,101 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,029-2,995 (t, 2Н, СН₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,549 (s, 3H, пиррол -СН₃), 2,308 (t, 2Н, CH₂N-группа морфолина).

Пример 5

(S,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидро-пирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Стадия 1

(R)-2-Трет-бутиловый, 4-этиловый диэфир 5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты

(R)-1-Амино-3-морфолин-4-илпропан-2-ол формулы 5а (15,125 г, 94,5 ммоль), 2-трет-бутиловый, 4-этиловый диэфир 5-карбоксиметил-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты (32,34 г, 104 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (25,5 г, 189,06 ммоль) и N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимид (36,2 г, 189,06 ммоль) растворяли в 450 мл ацетонитрила при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при 50°С на масляной бане в течение 3 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 150 мл насыщенного рассола. Смесь экстрагировали смесью растворителей этилацетата и тетрагидрофурана (V:V=4:1, 200 мл×5). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали с получением масла (75 г). Это масло очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, (R)-2-трет-бутилового, 4-этилового диэфира

5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты формулы 5b (30 г, выход 70%) в виде светло-коричневого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 454,4 [М+1]

Стадия 2

Этиловый эфир (R)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н- пиррол-3-карбоновой кислоты

В атмосфере аргона 2-трет-бутиловый, 4-этиловый диэфир 5-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой (R)-кислоты формулы 5b (23 г, 50,77 ммоль) растворяли в 60 мл безводного этанола при перемешивании, а затем к раствору добавляли по каплям 63,5 мл соляной кислоты (12 Н) в бане с водой со льдом. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали и реакционную систему перемешивали при 60°С на масляной бане в течение 1,5 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную систему доводили до pH примерно 7 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия в бане, содержащей сухой лед-ацетон, и образовывалось множество осадков. Смесь фильтровали, и осадок от фильтрования промывали этанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя, и остаток доводили до pH примерно 10 раствором гидроксида натрия (10 Н). Смесь экстрагировали дихлорметаном (150 мл×3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, этилового эфира

(R)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 5 с (14,6 г, выход 81,6%) в виде желто-зеленого масла.

По данным МС m/z (ИЭР): 354.8[М+1]

Стадия 3

Этиловый эфир (R)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3- карбоновой кислоты

Этиловый эфир (R)-2-[(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропилкарбамоил)-метил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 5 с (2,332 г, 6,6 ммоль) растворяли в 23 мл безводного тетрагидрофурана в атмосфере аргона, а затем к раствору добавляли по каплям комплекс боран-тетрагидрофуран в тетрагидрофуране (23,12 мл, 1 моль/л, 23,12 ммоль) в бане с водой со льдом. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали. Реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и кипятили с обратным холодильником при 95°С на масляной бане в течение 1 часа. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 5 мл соляной кислоты (2 Н). Смесь перемешивали в течение 0,5 часа, а затем к смеси добавляли 5 мл ледяной воды. Смесь доводили до pH примерно 10 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия. Смесь экстрагировали этилацетатом (100 мл × 2). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (50 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, этилового эфира

(R)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 5d (2,1 г, выход 93,75%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 340,9 [М+1]

Стадия 4

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Этиловый эфир (R)-2-[2-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропиламино)-этил]-4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты формулы 5d (2,1 г, 6,2 ммоль) и моногидрат гидроксида лития (1,56 г, 37 ммоль) растворяли в 25 мл гликоля при перемешивании в атмосфере аргона. Реакционную систему перемешивали при 140°С на масляной бане в течение 50 минут. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. После того как тонкослойная хроматография показала исчезновение исходных веществ, растворитель выпаривали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 50 мл насыщенного рассола. Смесь экстрагировали дихлорметаном (80 мл × 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (80 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 5е (610 г, выход 33,9%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 294,5 [М+1]

Стадия 5

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид

Оксихлорид фосфора (500 мкл, 1,3 ммоль) и N,N-диметилформамид (704 мкл, 9 ммоль) растворяли в 15 мл безводного дихлорметана при перемешивании при комнатной температуре и реакционный раствор перемешивали в течение 15 минут, поддерживая при этом температуру -10°С в бане с водой со льдом. (S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он формулы 5е (586 мг, 2 ммоль) растворяли в 8 мл дихлорметана при перемешивании, а затем раствор добавляли по каплям к вышеописанной реакционной системе. После завершения добавления баню с водой со льдом убирали. Реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение дополнительных 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь охлаждали ледяной водой и перемешивали в течение 15 минут. Смесь доводили до pH примерно 12 с помощью 10 Н раствора гидроксида натрия. Смесь экстрагировали смесью растворителей дихлорметана и метанола (V:V=20:1, 100 мл × 5). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали для удаления высушивающего агента и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегида формулы 5f (490 мг, выход 78,8%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 322,1 [М+1]

Стадия 6

(S,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (490 мг, 1,53 ммоль), 5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он (219 мг, 1,45 ммоль) и пиперидин (100 мкл, 1,0 ммоль) растворяли в 5 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную систему перемешивали при 80°С на масляной бане в темноте в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и масляную баню убирали. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке, (S,Z)-2-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 5 (460 мг, 69,9%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 455,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,674 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,945 (s, 1H, NH-группа индола), 7,771~7,800 (m, 1H, -ArH), 7,762 (s, 1H, -СН=С), 6,927~6,978 (dd, 1H, -ArH), 6,842~6,874 (d, 1H, -ArH), 4,707-4,719 (d, 1H, -OH), 3,900~3,915 (m, 1H, -CHO), 3,704~3,748 (dd, 2H, внутренняя CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,616~3,695 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца, содержащего N амидного происхождения), 3,563~3,585 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,105~3,158 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,433 (t, 2H, CH₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,545 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,420~2,431 (m, 2H, -CH₂N, внутренняя CH₂N-группа морфолина), 2,420~2,431 (m, 2H, -CH₂N, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,304~2,330 (t, 2H, внутренняя CH₂N-группа морфолина).

Пример 6

(S,Z)-2-(5-Хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 5-хлор-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(S,Z)-2-(5-хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 6 (87 мг, выход 85%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 471,6 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,727 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,038 (s, 1H, NH-группа индола), 8,006~8,001 (m, 1H, -ArH), 7,813 (s, 1H, -СН=С), 7,166~7,140 (dd, 1H, -ArH), 6,889~6,869 (d, 1H, -ArH), 4,712-4,700 (d, 1H, -OH), 3,893 (m, 1H, -CHO), 3,723~3,689 (dd, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,657~3,641 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,578~3,556 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,152~3,099 (dd, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,026~2,993 (t, 2H, СН₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,547 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,424~2,412 (m, 4H, -CH₂N, внутренняя CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,311~2,290 (t, 2H, внутренняя CH₂N-группа морфолина).

Пример 7

2-(Z)-[4-(2,3-Дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-[(S)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 4-(2,3-дифторфенил)-1,3-дигидроиндол-2-оном формулы 3d в качестве исходных веществ с получением 2-(Z)-[4-(2,3-дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-[(S)-2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 7 (49 мг, выход 73%) в виде красного твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 549,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,583 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,164 (s, 1H, NH-группа индола), 7,604~7,647 (m, 1H, -ArH), 7,411~7,464 (m, 1H, -ArH), 7,308~7,342 (m, 1H, -ArH), 7,239~7,277 (m, 1H, -ArH), 6,997~7,017 (d, 1H, -ArH), 6,879~6,898 (d, 1H, -ArH), 6,716 (s, 1H, -CH=C), 4,671 (s, 1H, -OH), 3,854 (m, 1H, -CHO), 3,540~3,673 (m, 7H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,095-3,124 (q, 1H, наружная CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,954~2,986 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,392~2,402 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,265~2,279 (d, 2H, CH₂N-группа морфолина), 1,884 (s, 3H, пиррол-СН₃).

Пример 8

(S,Z)-2-(5-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 5-бром-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением (S,Z)-2-(5-бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 8 (49 мг, выход 78%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 515,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,720 (s, 1Н, NH-группа пиррола), 11,042 (s, 1H, NH-группа индола), 8,127 (s, 1H, -ArH), 7,813 (s, 1H, -CH=C), 7,290~7,265 (dd, 1H, -ArH), 6,844~6,823 (d, 1H, -ArH), 4,712~4,699 (d, 1H, -ОН), 3,907 (m, 1H, -CHO), 3,578~3,555 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,151~3,098 (dd, 1H, наружная CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,025~2,992 (t, 2Н, CH₂-группа шестичленного кольца, соединенного с пирролом), 2,547 (s, 3Н, пиррол -СН₃), 2,306~2,290 (t, 2Н, внутренняя CH₂N-группа морфолина).

Пример 9

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидроксиацетамид

Стадия 1

(5-Фтор-2,4-динитрофенил)-уксусная кислота

(3-Фторфенил)-уксусную кислоту формулы 9а (31,5 г, 0,204 моль) добавляли к 64 мл серной кислоты (98%) при комнатной температуре, и к этому раствору добавляли по каплям 100 мл смеси растворителей азотной кислоты (65%-68%) и серной кислоты (98%) (V:V=1:1), поддерживая при этом температуру 35°С. После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при 35°С. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. К реакционной смеси добавляли лед, и смесь фильтровали после оттаивания с получением соединения, указанного в заголовке, (5-фтор-2,4-динитрофенил)-уксусной кислоты формулы 9b (49 мг) в виде светло-желтого масла.

По данным МС m/z (ИЭР): 243,5 [М-1].

Стадия 2

(2,4-Диамино-5-фторфенил)-уксусная кислота

(5-Фтор-2,4-динитрофенил)-уксусную кислоту формулы 9b (10 г, 38,7 ммоль) растворяли в 150 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли палладий на активированном угле (5%, 1,5 г). Реакционную смесь подвергали гидрогенизации при 0,3 МПа водорода. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Вышеописанную смесь дважды фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, (2,4-диамино-5-фторфенил)-уксусной кислоты формулы 9 с (7,12 г) в виде коричневого твердого вещества, которое непосредственно использовали в следующей реакции.

Стадия 3

6-Амино-5-фториндол-2-он

(2,4-Диамино-5-фторфенил)-уксусную кислоту формулы 9с (7,12 г, 38,7 ммоль) растворяли в 100 мл соляной кислоты (1 М) при перемешивании при комнатной температуре, и реакционный раствор нагревали до образования флегмы в течение 1 часа. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры с последующим охлаждением в бане с водой со льдом, а затем добавляли по каплям 100 мл раствора гидроксида натрия (1 М) для нейтрализации реакционного раствора. Смесь экстрагировали этилацетатом (125 мл×4). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (100 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, 5-фтор-6-амино-1,3-дигидроиндол-2-она формулы 9d (5,3 г, выход 82,8%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 165,3 [М-1].

Стадия 4

(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-метиловый эфир уксусной кислоты

5-Фтор-6-аминоиндол-2-он формулы 9d (500 мг, 3,0 ммоль) растворяли в 10 мл тетрагидрофурана при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 0,4 мл пиридина. После перемешивания до хорошего смешивания реакционную систему охлаждали до -40°С в бане, содержащей сухой лед и ацетон. Хлоркарбонилметиловый эфир (420 мг, 3,0 ммоль) растворяли в 10 мл тетрагидрофурана, а затем раствор добавляли по каплям к вышеописанной реакционной системе. После завершения добавления баню, содержащую сухой лед и ацетон, убирали. Реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи, пока ТСХ не показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь фильтровали, и отфильтрованный осадок трижды промывали водой с получением соединения, указанного в заголовке, (5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-метилового эфира уксусной кислоты формулы 9е (562 мг, выход 70,4%) в виде серого твердого вещества.

По данным МС: 265,3 [М-1].

Стадия 5

N-(5-Фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидроксиацетамид

(5-Фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-метиловый эфир уксусной кислоты формулы 9е (58 мг, 0,22 ммоль) растворяли в 1 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 1 мл воды и гидроксид натрия (15 мг, 0,375 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение дополнительного 1 часа. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Вышеописанную смесь фильтровали, отфильтрованный осадок трижды промывали водой и сушили с получением соединения, указанного в заголовке, N-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидроксиацетамида формулы 9f (46 мг, выход 93,8%) в виде серого твердого вещества.

По данным МС: 223,7 [М-1]

Стадия 6

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидроксиацетамид

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (40 мг, 0,125 ммоль) растворяли в 2 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли N-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидроксиацетамид формулы 9f (25,1 мг, 0,112 ммоль). После завершения добавления смесь перемешивали до полного растворения, а затем к реакционному раствору добавляли пиперидин (50 мкл, 0,5 ммоль). После завершения добавления реакционную систему перемешивали при 80°С на масляной бане в темноте в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и масляную баню убирали. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке,

(S,Z)-N-{5-фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидроксиацетамида формулы 9 (51 мг, выход 80%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 528,3 [М+1].

Пример 10

(S,Z)-2-[5-Фтор-6-(4-фторбензиламино)-2-оксо-1,2-дигидро-индол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Стадия 1

5-Фтор-6-(4-метилбензиламино)-1,3-дигидроиндол-2-он

5-Фтор-6-амино-1,3-дигидроиндол-2-он формулы 9d (2,26 г, 13,6 ммоль) растворяли в 40 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре. Раствор охлаждали до 0°С в бане с водой со льдом, а затем к раствору добавляли 4-фторбензальдегид (1,5 мл, 13,6 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем к смеси добавляли боргидрид натрия (1,08 г, 28,5 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры и добавляли ледяную воду для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали. Отфильтрованный осадок промывали водой (50 мл × 3) и очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением соединения, указанного в заголовке, 5-фтор-6-(4-метилбензиламино)-1,3-дигидроиндол-2-она формулы 10а (1,67 г, 45%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 275 [М+1]

Стадия 2

(S,Z)-2-[5-Фтор-6-(4-фторбензиламино)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (40 мг, 0,125 ммоль) растворяли в 2 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 5-фтор-6-(4-метилбензиламино)-1,3-дигидроиндол-2-он формулы 10а (30,7 мг, 0,112 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали до полного растворения, а затем к реакционному раствору добавляли пиперидин (0,05 мл, 0,5 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь кипятили с обратным холодильником на масляной бане в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры, фильтровали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, (S,Z)-2-[5-фтор-6-(4-фторбензиламино)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 10 (18 мг, 27,8%) в виде серого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 578,6 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,503 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,557 (s, 1H, NH-группа индола), 7,584~7,614 (d, 1H, -ArH), 7,359~7,400 (m, 2H, -ArH), 7,359 (s, 1H, -CH=C), 7,140~7,184 (t, 2H, -ArH), 6,426 (m, 1H, -NH), 6,039~6,057 (d, 1H, -ArH), 4,684~4,696 (d, 1H, -OH), 4,346-4,361 (d, 2H, -C=CCH₂N), 3,893 (m, 1H, -CHO), 3,667~3,713 (d, 2H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца), 3,596~3,627 (q, 1H, наружный СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,564 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,07~3,12 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,928~2,961 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,468 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,417 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,297 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 11

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидрокси-2-метилпропионамид

Стадия 1

1-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-1-метил-этиловый эфир уксусной кислоты

5-Фтор-6-аминоиндол-2-он формулы 9d (410 мг, 2,47 ммоль) растворяли в 10 мл тетрагидрофурана при перемешивании при комнатной температуре, раствор охлаждали до -45°С в бане, содержащей сухой лед и ацетон, а затем к раствору добавляли 332 мкл пиридина. 2-Ацетоксиизобутирилхлорид (423 мг, 2,71 ммоль) растворяли в 10 мл тетрагидрофурана, а затем раствор добавляли по каплям к вышеописанному реакционному раствору. После завершения добавления баню, содержащую сухой лед и ацетон убирали. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь фильтровали, и отфильтрованный осадок промывали водой и сушили с получением соединения, указанного в заголовке, 1-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-1-метилэтилового эфира уксусной кислоты формулы 11а (792 мг), в виде белого твердого вещества, которое непосредственно использовали в дальнейшей реакции.

По данным МС m/z (ИЭР): 293,7 [М-1].

Стадия 2

N-(5-Фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидрокси-2-метилпропион амид

1-(5-Фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-илкарбамоил)-1-метилэтиловый эфир уксусной кислоты формулы 11а (2,035 мг, 6,9 ммоль) растворяли в 20 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 20 мл раствора гидроксида натрия (0,7 М). Реакционный раствор перемешивали в течение 4 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и вышеописанный раствор нейтрализовали соляной кислотой (1 М) и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле и сушили с получением N-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидрокси-2-метилпропионамида формулы 11b (900 мг, выход 59,2%) в виде белого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 253,6 [М+1].

Стадия 3

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидрокси-2-метилпропионамид

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (40 мг, 0,125 ммоль), N-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидрокси-2-метилпропионамид формулы 11b (28,3 мг, 0,112 ммоль) и пиперидин (50 мкл, 0,5 ммоль) растворяли в 2 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре. Реакционную систему перемешивали при 80°С на масляной бане в темноте в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и масляную баню убирали. Реакционную систему охлаждали естественным путем до комнатной температуры для осаждения твердых веществ. Полученные в результате твердые вещества фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке, (S,Z)-N-{5-фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидрокси-2-метилпропионамида формулы 11 (46 мг, 74%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 556,9 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,656 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,951 (s, 1H, NH-группа индола), 9,282 (s, 1H, -NHCO), 7,873~7,901 (d, 1H, -ArH), 7,778~7,794 (m, 1H, -ArH), 7,670 (s, 1H, -CH=C), 6,052 (s, 1H, -ОНС(СН₃)₂), 4,698 (d, 1H, ОН), 3,893 (m, 1H, -CHO), 3,667~3,713 (d, 2H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца), 3,596~3,627 (q, 1H, наружный СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,557~3,578 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,09~3,125 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,961~3,012 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,524 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,412~2,424 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,297~2,308 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина), 1,376 (s, 6H, 2×-СН₃).

Пример 12

(S,Z)-2-(7-Бром-5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Стадия 1

7-Бром-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он

5-Фтор-1,3-дигидроиндол-2-он формулы 12а (1,5 г, 0,01 ммоль) растворяли в 15 мл ацетонитрила при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли по каплям N-бромсукцинимид (1,8 г, 0,01 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение ночи, и образовалось большое количество осадков. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и реакционную смесь фильтровали с получением 7-бром-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-она формулы 12b (2 г, 87%) в виде серого твердого вещества. По данным МС m/z (ИЭР): 228,3 [М-1].

Стадия 2

(S,Z)-2-(7-Бром-5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (40 мг, 0,125 ммоль) растворяли в 2 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 7-бром-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-он формулы 12b (25,8 мг, 0,112 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали до полного растворения, а затем к раствору добавляли пиперидин (0,05 мл, 0,5 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь нагревали до образования флегмы на масляной бане в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ, и реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры и фильтровали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке,

(S,Z)-2-(7-бром-5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 12 (45 мг, 75,4%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 533,6 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,689 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,196 (s, 1H, NH-группа индола), 7,860~7,866 (d, 1H, -ArH), 7,784 (s, 1H, -СН=С), 7,232~7,260 (m, 1H, -ArH), 4,703~4,716 (d, 1H, -ОН), 3,896~2,909 (m, 1H, -CHO), 3,631~3,747 (m, 3H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,555~3,578 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,097-3,150 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,015~3,048 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,548 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,411~2,424 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,291-2,307 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 13

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-метоксиацетамид

Стадия 1

5-Фтор-6-метоксиацетамидо-2-оксоиндол

5-Фтор-6-аминоиндол-2-он формулы 9d (2,028 г, 12,2 ммоль) растворяли в 30 мл тетрагидрофурана при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 1,3 мл пиридина. Реакционную систему охлаждали до -50°С в бане, содержащей сухой лед и этанол. Метоксиацетилхлорид (1,35 г, 12,5 ммоль) растворяли в 20 мл тетрагидрофурана при перемешивании, а затем этот раствор добавляли по каплям к вышеописанной реакционной системе. После завершения добавления баню, содержащую сухой лед и этанол, убирали. Реакционной системе давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи, пока ТСХ не показывала исчезновение исходных веществ. Полученное в результате твердое вещество фильтровали, промывали водой (10 мл × 3) и перекристаллизовали из метанола с получением соединения, указанного в заголовке, 5-фтор-6-метоксиацетамидо-2-оксоиндола формулы 13а (1,18 г, выход 40,6%) в виде серого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 239,3 [М+1]

Стадия 2

(S,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-метоксиацетамид

(S)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегид формулы 5f (40 мг, 0,125 ммоль) растворяли в 2 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 5-фтор-6-метоксиацетамидо-2-оксоиндол формулы 13а (26,7 мг, 0,112 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали до полного растворения, а затем к раствору добавляли пиперидин (0,05 мл, 0,5 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь нагревали до образования флегмы на масляной бане в течение 2 часов. Реакция была завершена, когда ТСХ показывала исчезновение исходных веществ. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры и фильтровали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке,

(S,Z)-N-{5-фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-метоксиацетамида формулы 13 (52 мг, выход 85,8%) в виде желтого твердого вещества.

МС m/z (ИЭР): 542,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,666 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,919 (s, 1Н, NH-группа индола), 9,313 (s, 1H, -NHCO), 7,841~7,869 (d, 1H, -ArH), 7,672 (s, 1H, -CH=C), 7,546~7,562 (m, 1H, -ArH), 4,703~4,716 (d, 1H, -ОН), 4,062 (s, 2H, -CH₂O), 3,896~2,909 (m, 1H, -СНО), 3,652~3,720 (m, 3Н, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,556~3,578 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,404 (s, 3Н, -СН₃О), 3,097~3,150 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,982~3,015 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,523 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,414~2,425 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,291~2,307 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 14

(R,Z)-2-(7-Бром-5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 7-бром-5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-оном формулы 12b в качестве исходных веществ с получением (R,Z)-2-(7-бром-5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 14 (20 мг, выход 40%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 533,6 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,691 (s, 1Н, NH-группа пиррола), 11,204 (s, 1H, NH-группа индола), 7,874-7,851 (d, 1H, -ArH), 7,797 (s, 1H, -CH=C), 7,269~7,243 (m, 1H, -ArH), 4,710~4,698 (d, 1H, -ОН), 3,900~3,890 (m, 1H, -CHO), 3,759~3,611 (m, 3H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,572~3,550 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,148-3,095 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,047~3,014 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,548 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,418~2,323 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,302~2,285 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 15

(R,Z)-2-[5-Фтор-6-(4-фторбензиламино)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 5-фтор-6-(4-метилбензиламино)-1,3-дигидроиндол-2-оном формулы 10а в качестве исходных веществ, с получением (R,Z)-2-[5-фтор-6-(4-фторбензиламино)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 15 (53 мг, выход 65,6%) в виде темно-красного твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 578,7 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,504 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,558 (s, 1H, NH-группа индола), 7,614~7,585 (d, 1H, -ArH), 7,400~7,379 (m, 2H, -ArH), 7,359 (s, 1H, -СН=С), 7,140-7,191 (t, 2H, -ArH), 6,431 (m, 1H, -NH), 6,058-6,040 (d, 1H, -ArH), 4,698~4,686 (d, 1H, -ОН), 4,346~4,361 (d, 2H, -C=CCH₂N), 3,894 (m, 1H, -CHO), 3,731~3,668 (d, 2H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца), 3,644~3,612 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,596~3,553 (t, 4H, 2×-СН₂О группы морфолина), 3,135~3,082 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,928~2,961 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,468 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,419~2,408 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,299~2,289 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 16

(R,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-метоксиацетамид

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 5-фтор-6-метоксиацетамидо-2-оксоиндолом формулы 13а в качестве исходных веществ с получением (R,Z)-N-{5-фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-метоксиацетамида формулы 16 (60 мг, выход 87%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 543,0 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,668 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,923 (s, 1H, NH-группа индола), 9,320 (s, 1H, -NHCO), 7,875~7,847 (d, 1H, -ArH), 7,678 (s, 1H, -CH=C), 7,562~7,546 (m, 1H, -ArH), 4,711~4,699 (d, 1H, -ОН), 4,063 (s, 2H, -CH₂O), 3,729-3,653 (m, 3Н, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,579~3,556 (t, 4Н, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,404 (s, 3Н, -СН₃О), 2,983~3,017 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,525 (s, 3Н, пиррол-СН₃), 2,412~2,424 (m, 4Н, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,289~2,306 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 17

(R,Z)-N-{5-Фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидрокси-2-метилпропионамид

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и N-(5-фтор-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-гидрокси-2-метилпропионамидом формулы 11b в качестве исходных веществ с получением (R,Z)-N-{5-фтор-3-[5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6, 7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил}-2-гидрокси-2-метилпропионамида формулы 17 (71 мг, выход 82%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 556,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,658 (s, 1H, NH-группа пиррола), 10,954 (s, 1H, NH-группа индола), 9,289 (s, 1H, -NHCO), 7,875-7,903 (d, 1H, -ArH), 7,796~7,780 (m, 1H, -ArH), 7,672 (s, 1H, -CH=C), 6,055 (s, 1H, -ОНС(СН₃)₂), 4,701 (d, 1H, ОН), 3,722 (m, 1H, -CHO), 3,655~3,691 (d, 2H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца), 3,639 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,559~3,580 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 2,986~3,019 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,526 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,415~2,425 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,299~2,309 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина), 1,378 (s, 6H, 2×-СН₃).

Пример 18

(R,Z)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-2-(2-оксо-4-пиридин-4-ил-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 1, с (R)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 1f, полученным на стадии 5 примера 1, и 4-пиридин-4-ил-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(R,Z)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-2-(2-оксо-4-пиридин-4-ил-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 18 (58 мг, выход 72,5%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 514,2 [М+1]

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,573 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,149 (s, 1H, NH-группа индола), 7,742~7,770 (d, 2H, N-CH=пиридина), 7,500~7,513 (d, 2H, -СН=пиридина), 7,226~7,265 (t, 1H, -ArH), 6,976~6,995 (t, 1H, -ArH), 6,813~6,834 (d, 2H, -CH=C, -ArH), 4,666~4,677 (d, 1H, -ОН), 3,854 (m, 1H, -CHO), 3,541~3,688 (m, 7H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,063~3,115 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,946~2,979 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,394 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,264~2,278 (d, 2H, CH₂N морфолина), 1,810~1,822 (s, 3Н, пиррол-СН₃).

Пример 19

(S,Z)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-2-(5-метокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 6-метокси-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(S,Z)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-2-(5-метокси-2-оксо-1,2-дигидроин дол-3-илиденметил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 19 (40 мг, выход 76,6%) в виде красного твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 467,2 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,846 (s, 1Н, NH-группа пиррола), 10,742 (s, 1H, NH-группа индола), 7,696 (s, 1H, -СН=С), 7,490~7,495 (m, 1H, -ArH), 6,728~6,792 (m, 2H, -ArH), 4,699~4,711 (d, 1H, -ОН), 3,896~3,909 (m, 1H, -CHO), 3,783 (s, 3H, -СН₃О), 3,689~3,732 (m, 2H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца), 3,654 (m, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,558~3,580 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,097~3,150 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,978~3,011 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,543 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,414~2,425 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,299~2,308 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 20

(S,Z)-2-[4-(2,6-Дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 4-(2,6-дифторфенил)-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(S,Z)-2-[4-(2,6-дифторфенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 20 (52 мг, выход 84,7%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 549,3 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,604 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,171 (s, 1H, NH-группа индола), 7,646~7,666 (m, 1H, -ArH), 7,338~7,380 (m, 2H, -ArH), 7,244-7,282 (m, 1H, -ArH), 7,008~7,027 (m, 1H, -ArH), 6,900~6,919 (m, 1H, -ArH), 6,657 (s, 1H, -CH=C), 4,672~4,683 (d, 1H, -OH), 3,855~3,868 (m, 1H, -CHO), 3,541~3,673 (m, 7H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,077~3,130 (q, 1H, наружная CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,955~2,988 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,394 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,266~2,280 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина), 1,856 (s, 3H, пиррол-СН₃).

Пример 21

(S,Z)-5-(2-Гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-2-[5-(4-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 5-(4-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(S,Z)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-2-[5-(4-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 21 (53 мг, выход 87,2%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 543,3 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,708 (s, 1Н, NH-группа пиррола), 11,004 (s, 1H, NH-группа индола), 7,321~7,852 (m, 1H, -ArH), 7,673 (s, 1H, -СН=С), 7,582~7,604 (m, 2H, -ArH), 7,254~7,277 (m, 1H, -ArH), 7,070 (m, 1H, -ArH), 7,016~7,038 (d, 2H, -ArH), 4,704~4,716 (d, 1H, -OH), 3,855-3,868 (m, 1H, -CHO), 3,806 (s, 3H, -СН₃О), 3,659~3,728 (m, 3H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная CH₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,559~3,581 (t, 4Н, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,077~3,130 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 2,990~3,024 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,539 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,415~2,427 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,294~2,311 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 22

(S,Z)-2-(4-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он

Соединение, указанное в заголовке, получали в таких же условиях, как описано для стадии 6 примера 5, с (S)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пирроло[3,2-с]пиридин-2-карбальдегидом формулы 5f, полученным на стадии 5 примера 5, и 4-бром-1,3-дигидроиндол-2-оном в качестве исходных веществ с получением

(S,Z)-2-(4-бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 22 (43 мг, выход 74,5%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 515,2 [М+1].

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): 13,670 (s, 1H, NH-группа пиррола), 11,189 (s, 1H, NH-группа индола), 8,562 (s, 1H, -СН=С), 7,201~7,221 (m, 1H, -ArH), 7,042~7,081 (m, 1H, -ArH), 6,920~6,938 (m, 1H, -ArH), 4,709~4,721 (d, 1H, -ОН), 3,902~3,915 (m, 1H, -СНО), 3,631~3,745 (m, 3H, внутренняя CH₂N-группа шестичленного кольца, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,558~3,580 (t, 4H, 2×-CH₂O группы морфолина), 3,090~3,143 (q, 1H, наружная СН₂-группа шестичленного кольца с N амидного происхождения), 3,011~3,035 (t, 2H, внутренняя СН₂-группа шестичленного кольца), 2,479 (s, 3H, пиррол-СН₃), 2,413~2,426 (m, 4H, CH₂N-группа морфолина, наружная CH₂N-группа морфолина), 2,293~2,311 (m, 2H, CH₂N-группа морфолина).

Пример 23

Малеат (R,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она

(R,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он формулы 1 (709 мг, 1,562 ммоль) и цис-бутендикарбоновую кислоту (217 мг, 1,874 ммоль) растворяли в 150 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре. После перемешивания для хорошего смешивания реакционную смесь нагревали при 40°С на масляной бане в течение 20 минут и фильтровали при пониженном давлении. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли 50 мл ацетонитрила. После завершения добавления смесь нагревали до образования флегмы в течение 20 минут.Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали при пониженном давлении с получением соединения, указанного в заголовке, малеата (R,Z)-2-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 23 (811 мг, выход 91,1%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 455,2 [М+1].

Пример 24

Малат (R,Z)-2-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она

2-Гидроксиянтарную кислоту (231 мг, 1,72 ммоль) растворяли в 100 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре, а затем к раствору отдельными порциями добавляли (R,Z)-2-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-он формулы 1 (560 мг, 1,233 ммоль), 200 мл метанола и 100 мл воды. После завершения добавления реакционную систему нагревали при 50°С на масляной бане в темноте до получения прозрачного раствора. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя с получением желтого твердого вещества. Полученное в результате твердое вещество растворяли в 100 мл ацетонитрила и смесь нагревали до образования флегмы в темноте в течение 1,5 часов. Масляную баню убирали. Реакционную смесь охлаждали естественным путем до комнатной температуры и фильтровали с получением соединения, указанного в заголовке, малата

(R,Z)-2-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-5-(2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-3-метил-1,5,6,7-тетрагидропирроло[3,2-с]пиридин-4-она формулы 24 (718 мг, выход 99%) в виде желтого твердого вещества.

По данным МС m/z (ИЭР): 455,2 [М+1].

Биологические анализы

Пример 1: Анализ ингибирования клеточной пролиферации

Приведенный ниже in vitro анализ можно использовать для определения уровня активности и воздействия различных соединений по данному изобретению посредством эксперимента по ингибированию пролиферации (клеточной токсичностью) на клетках Homo sapiens HUVEC, которые обладают высокой экспрессией РФРЭС.

Клеточный анализ, описанный в данном документе, используют для тестирования антиангиогенной активности и активности ингибирования пролиферации, а также воздействия соединений посредством РФРЭС на раковые клетки in vitro. Этот эффект и активность представлены значением IC₅₀, которое уничтожает раковые клетки. Общие методики анализа являются такими, как описано ниже: Клетки Homo sapiens, которые в высокой степени экспрессируют РФРЭС, отбирали и высевали в 96-луночный культуральный планшет в подходящей концентрации (например, 5000 клеток/мл среды). Затем клетки инкубировали в инкубаторе с диоксидом углерода (CO₂) до достижения ими 85% конфлюентности. Затем клеточную культуральную среду заменяли свежей средой с добавлением тестируемых соединений в серийных концентрациях (обычно 6 или 7 концентрациях). Затем клетки помещали обратно в инкубатор и культивировали непрерывно в течение 72 часов. Спустя 72 часа клетки, обработанные соединениями, анализировали на состояние их пролиферации, используя способ с сульфородамином В (SRB). Значение IC₅₀ соединений на тестируемые клетки вычисляли путем использования данных, касающихся степени ингибирования серийными концентрациями тестируемых соединений.

Материалы и методы

(а) Диметилсульфоксид (Sinophma chemical reagent compony, № по каталогу Т20050806)

(б) Клетки HUVEC (приобретенные в Институте биохимии и клеточной биологии)

(в) Клеточные культуральные планшеты Falcon 100 мм (Baton Dickison Labware, Baton Dickison and company, № по каталогу 18677)

(г) 96-луночные планшеты для клеточных культур Corning (Corning Incorporated, № по каталогу 3599)

(д) Пипетка Fisher (Fisher Scientific, № по каталогу 03-692-164)

(е) Клеточная среда DMEM/F12 (Gibco, № по каталогу 12400-024)

(ж) Фетальная бычья сыворотка (ФБС), австралийского происхождения (Gibco, № по каталогу 10099-141)

(з) Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) (Gibco, № по каталогу 10010-072)

(и) 0,25% Трипсин-ЭДТА (Gibco, № по каталогу 25200-056)

(к) Сульфородамин В (Sigma, № по каталогу 3520-42-1)

(л) Уксусная кислота (Sinophma chemical reagent compony, № по каталогу Т20060508)

(м) Трихлоруксусная кислота (Sinophma chemical reagent compony, № по каталогу Т20060305)

(н) Основание Трис (Amresco, № по каталогу 0826)

(о) Биологический ламинарный бокс класса II А/В3 (ThermoForma, № по каталогу НВ0053-03)

(п) СО₂ инкубатор с водяной рубашкой серии II (ThermoForma, модель 3111)

(р) Центрифуга (Fisher Scientific Marathon 8 k, № по каталогу 0027-02)

(с) Планшет-ридер Novastar Plate (BMG Labtech, № по каталогу 700-0081)

(т) Орбитальный встряхиватель (Qilinbeier, № по каталогу TS-1)

Протокол

Приведенный ниже протокол используют для анализа клеточной токсичности (антипролиферативной активности, которая выражена в виде значения IC₅₀) тестируемых соединений по изобретению на клетках HUVEC:

1. Клетки HUVEC культивировали с ростовой средой (DMEM/F12, с добавлением 10% ФБС) в 100 мм культуральном планшете Corning при 37°С, 5% CO₂ до конфлюентности.

2. Клетки HUVEC промывали холодным раствором ФСБ, затем клетки собирали с помощью трипсинизации и высевали в 96-луночные культуральные планшеты Corning при концентрации 50000 клеток/мл, причем на каждом планшете оставляли 6 пустых лунок в качестве фона планшета.

3. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах при 37°С, 5% СО₂, до 85% конфлюентности.

4. Исходный раствор соединения готовили путем использования ДМСО для растворения соединений-кандидатов до концентрации 20 мМ. Затем ДМСО использовали для разведения исходного раствора до серийной концентрации для получения образцов растворов тестируемых соединений (например, 2 мМ, 1 мМ, 0,2 мМ, 20 мкМ, 2 мкМ, 0,2 мкМ).

5. Клеточную культуральную среду (DMEM/F12 + 10% ФБС) использовали для разведения раствора соединения, приготовленного ранее. Каждую концентрацию раствора тестируемого соединения разводили в 20 раз путем добавления 5 мкл раствора соединения в ДМСО к 95 мкл культуральной среды, а затем тщательно перемешивали на вортексе. Это должно обеспечивать конечную концентрацию ДМСО в культуральной среде клеток HUVEC менее 0,5%.

6. После прикрепления клеток HUVEC ко дну лунки и достижения 85% конфлюентности культуральную среду заменяли свежей средой DMEM/F12 с добавлением 10% ФБС. 180 мкл среды добавляли в каждую лунку, затем добавляли 20 мкл разведенного раствора тестируемого соединения, приготовленного на стадии 5. К клеткам группы отрицательного контроля вместо этого добавляли 20 мкл культуральной среды, содержащей 0,5% чистого ДМСО. Таким образом, клетки HUVEC подвергали воздействию каждого тестируемого соединения в конечной концентрации 100 мкМ, 10 мкМ, 5 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ, 0,01 мкМ и 0,001 мкМ.

7. Культуральные планшеты помещали обратно в инкубатор и культивировали в течение 72 часов при 37°С, 5% СО₂.

8. 72 часов спустя культуральные планшеты переносили из инкубатора в стерильную рабочую зону.

9. Фиксирующий раствор (50% трихлоруксусной кислоты, ТХУ) готовили путем добавления химически чистой воды к ТХУ; клетки фиксировали путем осторожного наслаивания 50 мкл холодного раствора ТХУ на поверхность ростовой среды.

10. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 часа, а затем несколько раз промывали дистиллированной водой для удаления ТХУ, сывороточных белков и т.д. Планшеты сушили на воздухе и хранили при 4°С до использования. Фоновое поглощение измеряли в лунках, инкубируемых только с ростовой средой.

11. 0,4% раствор сульфородамина В готовили путем использования 10% раствора уксусной кислоты. 50 мкл раствора сульфородамина В добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов.

12. Клетки окрашивали в течение 30 минут.

13. Готовили промывочный раствор 10% уксусной кислоты. По окончании окрашивания раствор для окрашивания удаляли и клетки быстро промывали 10% уксусной кислотой. Вышеописанную операцию повторяли до удаления несвязавшегося красителя. Время промывок поддверживали минимальным с целью уменьшения десорбции красителя, связанного с белком. После промывания культуры сушили на воздухе.

14. Затем связавшийся краситель растворяли в объеме раствора сульфородамина В для солюбилизации (10 мМ Трис), который был равен исходному объему культуральной среды (обычно 200 мкл). Все культуры инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре на орбитальном встряхивателе для ускорения процесса растворения.

15. Поглощение измеряли с помощью спектрофотометрии при длине волны 565 нм. Фоновое поглощение 96-луночных планшетов при 690 нм измеряли и вычитали из измерения при 565 нм.

16. Степень ингибирования (СИ) вычисляли, как описано ниже:

СИ = 100×(поглощение контрольных клеток - поглощение клеток, подвергнутых воздействию соединения при каждой концентрации) / поглощение контрольных клеток %.

Значение IC₅₀ можно вычислить на основании СИ соединениями при различных градиентах концентрации.

Активность соединений по изобретению

Биологическую активность соединений по изобретению тестируют, используя анализ, описанный выше. Значения IC₅₀ вычислены и показаны в приведенной ниже таблице:

Пример № IC₅₀ (РФРЭС/HUVEC) (мкМ) 1 0,027 2 2,4 3 0,84 5 0,012 20 0,01

Пример 2: Анализ киназы VEGF-R2

Данный анализ используют для измерения киназной активности in vitro рекомбинантного человеческого VEGF-R2 в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА).

Материалы и реагенты

(а) Промывочный буфер (буфер ФСБ-Т): 1 × ФСБ (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,4 мМ KH₂PO₄, pH 7,2) с добавлением 0,05% Твин-20.

(б) 1% Бычий сывороточный альбумин (БСА, Calbiochem #136593) в буфере ФСБ-Т.

(в) Останавливающий раствор: 50 мМ ЭДТА, pH 8,0.

(г) DELFIA® меченный европием антимышиный IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124).

(д) DELFIA® усиливающий раствор (PerkinElmer Life Sciences #1244-105).

(e) DELFIA® 96-луночный желтый планшет, покрытый стерптавидином (PerkinElmer Life Sciences #AAAND-0005).

(ж) Рекомбинантная человеческая киназа VEGFR-2 (поставляемая в 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ (дитиотреитол), 15 мМ восстановленном глутатионе и 20% глицерине). (Cell signaling technology #7787).

(з) 10 мМ раствор АТФ (Cell signaling technology #9804).

(и) Биотинилированный пептид-предшественник гастрина (Tyr87) (Cell signaling technology #1310).

(к) Мышиные антитела к фосфотирозину mAb (P-Tyr-100) (Cell signaling technology #9411).

(л) Буфер для тирозинкиназы HTScan™ (4x).

1x киназный буфер:

60 мМ ХЕПЕС

5 мМ MgCl₂

5 мМ MnCl₂

3 мкМ Na₃VO₄

1,25 М ДТТ (1000x) (Cell signaling technology).

Методика

Использовали приведенный ниже протокол:

1. Тестируемые соединения разводили ДМСО до желаемой конечной концентрации. 1 мкл тестируемого соединения, отрицательный контроль и бланк-контроль (анализ отрицательного контроля и контроля пустой пробы по реагенту, который не содержит какого-либо тестируемого соединения) добавляли для каждого анализа.

2. 6 мкМ пептидный субстрат (Tyr87) разводили дистиллированной водой (dH₂O) в соотношении 1:1; 15 мкм добавляли в каждый анализ.

3. Киназу VEGFR-2 помещали с -80°С сразу на лед и оттаивали во льду.

4. 2,2 мкг фермента VEGFR-2 добавляли в ферментационную пробирку.

5. 10 мкл ДТТ (1,25 М) добавляли к 2,5 мл буфера для тирозинкиназы 4x HTScan™ (240 мМ ХЕПЕС, pH 7,5, 20 мМ MgCl₂, 20 мМ MnCl₂, 12 мкМ Na₃VO₄) для приготовления ДТТ/киназного буфера.

6. 0,75 мл ДТТ/киназного буфера переносили в ферментационную пробирку для приготовления 4х реакционной смеси и 7,5 мкл 4х реакционной смеси добавляли в каждый анализ.

7. 2 мкл АТФ (10 мМ) добавляли к 498 мкл dH₂O и 7,5 мкл добавляли в каждый анализ.

Конечные условия анализа для 30 мкл реакционной системы

60 мМ ХЕПЕС pH 7,5

5 мМ MgCl₂

5 мМ MnCl₂

3 мкМ Na₃VO₄

1,25 мМ ДТТ

10 мк МАТФ

1,5 мкМ пептид-субстрат

22 нг киназы VEGFR-2

8. Реакционную пробирку инкубировали при 25°С в течение 30 минут.

9. Добавляли 30 мкл останавливающего раствора (50 мМ ЭДТА, pH 8.0) для остановки реакции.

10. 25 мкл каждой реакционной среды и 75 мкл dH₂O переносили в 96-луночный планшет, покрытый стрептавидином с последующим шейкированием при комнатной температуре в течение 60 минут.

11. Каждую лунку промывали три раза 200 мкл буфера ФСБ-Т. Планшет отстукивали на бумажном полотенце для удаления избыточной жидкости.

12. Первичные антитела, мышиные антитела к фосфотирозину mAb (Р-Tyr-100) разводили в соотношении 1:1000 буфером ФСБ-Т, содержащим 1% БСА, и по 100 мкл разведенных первичных антител добавляли в каждую лунку.

13. Планшет инкубировали при шейкировании при комнатной температуре в течение 60 минут.

14. Стадию промывки проводили, как описано в стадии 11.

15. Меченный европием антимышиный IgG разводили в соотношении 1:500 буфером ФСБ-Т, содержащим 1% БСА, 100 мкл разведенных антител добавляли в каждую лунку.

16. Планшет инкубировали при шейкировании при комнатной температуре в течение 30 минут.

17. Каждую лунку промывали пять раз 200 мкл буфера ФСБ-Т. Планшет отстукивали на бумажном полотенце для удаления избыточной жидкости.

18. В каждую лунку добавляли 100 мкл усиливающего раствора DELFIA®.

19. Планшет инкубировали при шейкировании при комнатной температуре в течение 5 минут.

20. Интенсивность флуоресценции определяли при длине волны 615 нм в режиме флуоресценции с временным разрешением на планшет-ридере.

Вычисление степени ингибирования:

СИ (%) = 100-100·(Х-В)/(N-B)

Х = Значение флуоресценции лунки, содержащей тестируемое соединение

N = Значение флуоресценции положительного контроля

В = Бланк

Значение IC₅₀ можно вычислить на основании СИ соединениями при различных градиентах концентрации.

Активность соединений по изобретению

Биохимическую активность соединений по изобретению тестируют, используя вышеописанный анализ. Значения IC₅ измерены и представлены в приведенной ниже таблице:

Пример № IC₅₀ (РФРЭС/био) (мкМ) 1 0,001 4 0,998 11 0,003 13 0,13 16 0,11 17 0,004

Изобретение относится к соединению, имеющему формулу (I), или к его фармацевтически приемлемым солям:

где каждый из R₁, R₂, R₃, R₄ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, арила, C_5-6 гетероарила, имеющего от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, -OR₅, -NR₅R₆, и -NR₅COR₆, где указанный арил или С_5-6 гетероарил, имеющий от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкоксила и галогена; каждый из R₅ и R₆ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, где указанный алкил является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из арила, галогенарила, гидроксила и алкоксила. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, ингибирующей протеинкиназы и содержащей соедиенние формулы I, к способу получения соединения формулы I, к применению данных соединений для получения лекарственного средства для лечения расстройств, связанных с протеинкиназой, а также к способу модулирования каталитической активности протеинкиназы. 6 н. и 4 з.п.ф-лы, 24 прим.

1. Соединения, имеющие формулу (I), или их фармацевтически приемлемые соли:

где каждый из R₁, R₂, R₃, R₄ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, арила, C_5-6 гетероарила, имеющего от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, -OR₅, -NR₅R₆, и -NR₅COR₆, где указанный арил или С_5-6 гетероарил, имеющий от одного до трех гетероатомов в кольце, выбранных из О, S и N, является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из алкила, алкоксила и галогена;
каждый из R₅ и R₆ независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода и алкила, где указанный алкил является незамещенным или дополнительно замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из арила, галогенарила, гидроксила и алкоксила.

2. Соединения конденсированных с пирролом шестичленных гетероциклических производных гидроксилированного морфолина или их фармацевтически приемлемые соли по п.1, где указанные соединения включают:

3. Фармацевтическая композиция, ингибирующая протеинкиназы и содержащая соединение, относящееся к конденсированным с пирролом шестичленным азагетероциклическим производным гидроксилированного морфолина, или фармацевтически приемлемые соли данного соединения в эффективной терапевтической дозе по любому из пп.1 или 2, а также фармацевтически приемлемый носитель.

4. Соединения конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина или их фармацевтически приемлемые соли по п.1, где указанные фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, образованные указанными соединениями и яблочной или малеиновой кислотами.

5. Способ получения соединений, конденсированных с пирролом шестичленных азагетероциклических производных гидроксилированного морфолина или их фармацевтически приемлемых солей по п.1, включающий приведенные ниже стадии:
нагревание в атмосфере азота оптически активного соединения 1-амино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ола (Ia) с 2-трет-бутиловым, 4-этиловым диэфиром 5-карбоксиметил-3-метил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты в ацетонитриле в присутствии 1-гидроксибензотриазола и N-этил-N'-(диметиламинопропил)-карбодиимида с получением хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib);

нагревание в атмосфере аргона хирального диэфира амида пирролдикарбоновой кислоты (Ib) с соляной кислотой в этаноле до образования флегмы с получением оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic);

последующее нагревание оптически активного этилового эфира пирроламида (Ic) с бораном в безводном тетрагидрофуране до образования флегмы с получением путем избирательного восстановления этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id);

последующее нагревание в атмосфере аргона этилового эфира хирально замещенного пиррола (Id) с моногидратом гидроксида лития в гликоле до образования флегмы с получением циклизованного продукта, представляющего собой оптически активный конденсированный с пирролом шестичленный азагетероцикл (Ie);

взаимодействие оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероцикла (Ie) с оксихлоридом фосфора и N,N-диметилформамидом в безводном дихлорметане при комнатной температуре с получением путем реакции формилирования оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If);

на последней стадии нагревание оптически активного конденсированного с пирролом шестичленного азагетероциклического формальдегида (If) с различными индолинонами в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиперидин, в течение 2~12 ч с получением целевого продукта, относящегося к хиральным конденсированным с пирролом шестичленным азагетероциклическим производным гидроксилированного морфолина формулы (I)

6. Способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, включающий приведение в контакт указанной протеинкиназы с конденсированными с пирролом шестичленными азагетероциклическими производными гидроксилированного морфолина или их фармацевтически приемлемыми солями по любому из пп.1-4.

7. Способ по п.6, где указанные протеинкиназы выбраны из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ (РТК), нерецепторных протеинтирозинкиназ (ПТК) и сериновых/треониновых протеинкиназ (СТПК).

8. Применение соединений по п.1 для получения лекарственного средства для лечения расстройств, связанных с протеинкиназой.

9. Применение по п.8, где указанные расстройства, связанные с протеинкиназой, выбраны из расстройств, связанных со следующими протеинкиназами: VEGFR-2, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, PDGFR, c-Kit, c-Met, FGFR и Flt3.

10. Способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, включающий приведение в контакт указанной протеинкиназы с фармацевтической композицией по п.3.