СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СТЕРОИДНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ ИСТИННОЙ АКАНТОЛИТИЧЕСКОЙ ПУЗЫРЧАТКОЙ НА ОСНОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ВТОРИЧНЫХ МЕССЕНДЖЕРОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Настоящее изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики стероидной резистентности при лечении больных истинной акантолитической пузырчаткой.

Истинная акантолитическая пузырчатка - тяжелое, неуклонно прогрессирующее аутоиммунное заболевание, характеризующееся хроническим волнообразным течением с поражением кожных покровов и слизистых оболочек вследствие акантолиза, тенденцией к генерализации, нарушением общего состояния, качества жизни больного и сомнительным прогнозом.

Заболеваемость истинной акантолитической пузырчаткой колеблется от 0,42 до 1,62 на 100.000 населения и встречается одинаково часто как у женщин, так и у мужчин, преимущественно в возрасте 50-60 лет. Основой патогенеза истинной акантолитической пузырчатки является акантолиз, возникающий в результате выработки антител, преимущественно IgG1/IgG4, к собственным межклеточным контактам - десмосомам.

Несмотря на успехи отечественных и зарубежных исследователей в совершенствовании методов лечения данного заболевания, проблема терапии истинной акантолитической пузырчатки не теряет своей актуальности.

При истинной акантолитической пузырчатке не существует противопоказаний для назначения системных глюкокортикоидов, так как до эры стероидной терапии все больные истинной акантолитической пузырчаткой погибали в течение первого года от начала заболевания. Летальные исходы больных истинной акантолитической пузырчаткой наступают вследствие прогрессирования основного заболевания. Однако в последние годы наиболее частой причиной смерти больных являются осложнения терапии системными глюкокортикоидами. Вопросы о начальной дозе системных глюкокортикоидов, быстроте ее снижения, о применении поддерживающей дозы с 1963 г. и до настоящего времени остаются дискутабельными: в процессе лечения необходимо добиться ремиссии истинной акантолитической пузырчатки и при этом уменьшить количество осложнений, развивающихся при приеме системных глюкокортикоидов. В настоящее время, согласно данным зарубежных и отечественных авторов максимальная доза системных глюкокортикоидов 90-150 мг в сутки. Однако применение даже очень высоких суточных доз системных глюкокортикоидов не всегда проводит к достижению полной ремиссии. Некоторые больные оказываются резистентными к монотерапии системными глюкокортикоидами, а исследования, посвященные стероидной резистентности, носят описательный клинический характер.

За последние годы появились новые данные о молекулярных механизмах действия системных глюкокортикоидов на клеточном уровне. Установлено, что определенную роль в реализации эффекта системных глюкокортикоидов играют вторичные мессенджеры: инозитолтрифосфат - IP3, ионы кальция - Са²⁺.

По данным литературы не обнаружено информации о роли вторичных мессенджеров при стероидной резистентности у больных истинной акантолитической пузырчаткой. Изменения в системе вторичных мессенджеров в случае стероидной резистентности были установлены только при бронхиальной астме и остром лейкозе.

Технической задачей настоящего изобретения является выявление больных истинной акантолитической пузырчаткой с резистенстностью к терапии системными глюкокортикоидами в процессе клинико-лабораторной диагностики, основанное на исследовании системы вторичных мессенджеров (изменение ионов кальция и инозитолтрифосфата), для повышения эффективности проводимого лечения, минимизации побочных эффектов терапии системными глюкокортикоидами и повышение качества жизни пациента.

Технический результат достигается тем, что для выявления больных истинной акантолитической пузырчаткой, резистентных к терапии системными глюкокортикоидами, разработан диагностический алгоритм, основанный на проведении биохимического исследования периферической крови человека, с последующим качественным анализом лимфоцитов, включающий: исследование плазматической мембраны лимфоцитов на проницаемость для ионов кальция, а также исследование генома лимфоцитов для индикации образования инозитолтрифосфата. Изменения в системе вторичных мессенджеров (ионов кальция и инозитолтрифосфата) являются проявлением стероидной резистентности и позволяют прогнозировать клиническую эффективность системных глюкокортикоидов и своевременно назначать дополнительную терапию иммуносупрессорами и цитостатиками.

Способ реализуется следующим образом: из периферической крови человека выделяют лимфоциты на градиенте изопак-фиколла плотностью 1077, затем выделенные клетки помещают в 10 мл буфера и обрабатывают митогеном - конканавалином А.

Внутриклеточный уровень свободных ионов кальция определяют с помощью флуоресцентного индикатора (Фиг.1). Определяют исходный контрольный уровень Са²⁺ (нМ), уровень Са²⁺ через 2 мин наблюдения при добавлении 25 мкг/мл митогена конканавалина А в отсутствие и в присутствии глкокортикоида 3 мкм преднизолона. Для измерения инозитолтрифосфата в лимфоцитах используется метод ионообменной хроматографии на органической смоле (Фиг.2). В качестве метки применялся мио-³н-инозитол, который во время инкубации с клетками встраивается в полярные головки мембранных фосфолипидов. Определяют исходный контрольный уровень меченого инозитола в пробах (нМ) по сравнению с пробами, которые не содержали лимфоциты, но в них был внесен меченый инозитол (blank контроль), уровень меченого инозитола через 12 ч инкубации с лимфоцитами при добавлении 25 мкг/мл митогена конканавалина А в отсутствие и в присутствии глкокортикоида 3 мкм преднизолона.

При действии системных глюкокортикоидов (преднизолон) на митоген-индуцированный уровень кальция в лимфоцитах больных истинной акантолитической пузырчаткой позволяет их разделить на две группы. Больные, у которых ингибирующий эффект преднизолона на рост уровня кальция выражен значительно (уменьшение индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А внутриклеточного уровня кальция в лимфоцитах при добавлении системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составляет 16% и более), относятся к стероидчувствительным. Отсутствие или слабое кальцийблокирующее действие гормонами на митоген-индуцированный уровень кальция характерно для стероидрезистентных больных (уменьшение индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А внутриклеточного уровня кальция в лимфоцитах при добавлении системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составляет 15% и менее).

При действии системного глюкокортикоида на митоген-индуцированный уровень инозитолтрифосфата в группах больных с гормончувствительной и гормонрезистентной формой истинной акантолитической пузырчатки показано, что в первой группе больных уровень инозитолтрифосфата составляет 10-15% от контрольных значений (р<0,02), тогда как во второй группе он достоверно не меняется.

При исследовании других показателей системы вторичных мессенджеров (циклического адепозинмонофосфата, уровня цитоплазматического РН в лимфоцитах и связывания меченных глюкокортикоидов цитозольной и ядерной фракциями лимфоцитов) у больных истинной акантолитичсской пузырчаткой без стероидной резистентности и при таковой достоверных различий показателей не обнаруживают. Поэтому изменения ионов кальция и инозитолтрифосфата являются проявлением стероидной резистентности, позволяют прогнозировать клиническую эффективность системных глюкокортикоидов и своевременно назначать дополнительную терапию иммуносупрессорами или цитостатиками.

Основными отличиями и преимуществами предлагаемого способа являются: 1) данный диагностический алгоритм выявления стероидорезистентности к терапии системными глюкокортикоидами у больных истинной акантолитической пузырчаткой разработан и применен впервые; 2) с помощью данного способа возможна реализация индивидуального подхода к лечению больных истинной акантолитической пузырчаткой; 3) данный способ дает возможность прогнозирования клинической эффективности терапии системными глюкокортикоидами; 4) диагностика стероидной резистентности, основанная на реализации данного метода, позволяет своевременно назначать адъювантную терапию (иммуносупрессоры или цитостатики); 5) применение данного способа позволяет уменьшать количество осложнений, возникающих при одновременном назначении системных глюкокортикоидов и адъювантной терапии, у больных истинной акантолитической пузырчаткой, чувствительных к системным глюкокортикоидам, за счет лечения их без иммуносупрессоров или цитостатиков.

Предлагаемый способ позволяет преодолеть следующие недостатки лечения больных истинной акантолитической пузырчаткой: 1) большое количество осложнений при необоснованном назначении системных глюкокортикоидов и адъювантной терапии у больных истинной акантолитической пузырчаткой, чувствительных к системных глюкокортикоидам; 2) высокая суточная доза системных глюкокортикоидов с отстроченным переходом на поддерживающую дозу с применением иммуносупрессоров и цитостатиков.

Предлагаемый способ позволил выделить вторичные мессенджеры, являющиеся маркерами стероидной резистентности, ионы кальция и инозитолтрифосфат, а также повысить качество жизни больного истинной акантолитической пузырчаткой в результате индивидуального подхода к терапии, снизить экономические затраты на лечение.

Способ выявления стероидной разистентности у больных истинной акантолитичсской пузырчаткой на основании исследования системы вторичных мессенджеров дополняется примерами.

Пример 1.

Больная К., 63 лет, поступила на стационарное лечение. Диагноз истинная акантолитическая пузырчатка был подтвержден цитологическим, гистологическим и иммуногистохимическим методами исследования.

Перед назначением максимальной суточной дозы системных глюкокортикоидов было проведено исследование показателей системы вторичных мессенджеров (ионов кальция и инозитолтрифосфата). При исследовании лимфоцитов больной К. выявлена чувствительность к системным глюкокортикоидам (преднизолон) в виде изменения уровня ионов кальция и инозитолтрифосфата в лимфоцитах больной, обработанных митогеном. Уменьшение внутриклеточного уровня кальция в лимфоцитах, индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А (210±18 нМ), при добавлении системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составило 162±14 нМ или 77%. Увеличение внутриклеточного уровня инозитолтрифосфата в лимфоцитах, индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А, в присутствии системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составило 22% по сравнению с исходным контрольным значением. По результатам оценки больная была отнесена к стероид-чувствительной форме заболевания. Больной была назначена максимальная суточная доза системных глюкокортикоидов - 100 мг (16 дней). Клиническая эффективность данной терапии была определена по отсутствию новых высыпаний и регрессу на 50% существующих повреждений кожи и слизистых. В дальнейшем доза системных глюкокортикоидов была снижена до поддерживающей, которую больная получает в течение последних 7 лет.

Пример 2.

Больной Р., 45 лет, поступил на стационарное лечение. Диагноз истинная акантолитическая пузырчатка подтвержден на основании клинических, цитологических, патоморфологических и иммуногистохимических методов исследования.

Перед назначением 100 мг/сут системных глюкокортикоидов больному было произведено исследование лимфоцитов крови на наличие стероидорезистентности (анализ изменения ионов кальция и инозитолтрифосфата в лимфоцитах) с положительным результатом в виде отсутствия колебаний ионов кальция и инозитолтрифосфата в лимфоцитах больного, обработанных конканавалином А при действии преднизолона. Уменьшение внутриклеточного уровня кальция в лимфоцитах, индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А (212±19 нМ), при добавлении системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составило 201±11 нМ или 5,2%. Увеличение внутриклеточного уровня инозитолтрифосфата в лимфоцитах, индуцированного добавлением 25 мкг/мл конканавалина А, в присутствии системного глюкокортикоида преднизолона в концентрации 3 мкМ составило 84% по сравнению с исходным контрольным значением (в отсутствие митогена). По результатам оценки больной был отнесен к стероид-резистентной форме заболевания. Больному была добавлена адъювантная терапия в виде азатиоприна. Такая комбинация препаратов позволила снизить дозу системных глюкокортикоидов до поддерживающей при отсутствии рецидивов. Поражение кожных покровов и слизистых подверглось активному регрессу.

Таким образом, у больных истинной акантолитической пузырчаткой со стероидной резистентостью наблюдается изменение биохимической реактивности в системе вторичных мессенджеров к специфическим эффектам системных глюкокортикоидов как на уровне плазматической мембраны (проницаемость для ионов кальция), так и на уровне генома (регуляция образования инозитолтрифосфат). Исследование этих показателей позволяет прогнозировать клиническую эффективность системных глюкокортикоидов и своевременно назначать дополнительную терапию иммуносупрессорами или цитостатиками.

Настоящее изобретение относится к экспертизе и описывает способ выявления стероидной резистентности у больных истинной акантолитической пузырчаткой, основанный на анализе изменений вторичных мессенджеров, при котором производят забор лимфоцитов периферической крови у больного истинной акантолитической пузырчаткой, обрабатывают их конканавалином А, определяют уровень инозитолтрифосфата в лимфоцитах с помощью метода ионообменной хроматографии на органической смоле до назначения терапии системными глюкокортикоидами, и после назначения терапии системными глюкокортикоидами, и при уменьшении внутриклеточного уровня инозитолтрифосфата в лимфоцитах в присутствии системного глюкокортикоида на 10-15% форму заболевания больного относят к стероидчувствительной, а при отсутствии изменения уровня форму заболевания относят к стероидрезистентной. Способ позволяет выявить больных истинной акантолитической пузырчаткой, резистентных к терапии системными глюкокортикоидами для более быстрого достижения ремиссии заболевания и подбора адекватной терапии, снижения лечебных доз системных глюкокортикоидов на поддерживающие при отсутствии рецидива заболевания. 2 пр., 2 ил.

Способ выявления стероидной резистентности у больных истинной акантолитической пузырчаткой, основанный на анализе изменений вторичных мессенджеров, характеризующийся тем, что производят забор лимфоцитов периферической крови у больного истинной акантолитической пузырчаткой, обрабатывают их конканавалином А, определяют уровень инозитолтрифосфата в лимфоцитах с помощью метода ионообменной хроматографии на органической смоле до назначения терапии системными глюкокортикоидами, и после назначения терапии системными глюкокортикоидами, и при уменьшении внутриклеточного уровня инозитолтрифосфата в лимфоцитах в присутствии системного глюкокортикоида на 10-15% форму заболевания больного относят к стероидчувствительной, а при отсутствии изменения уровня форму заболевания относят к стероидрезистентной.