НОВАЯ ЭФФЕКТИВНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/00 G01N33/569 A61P31/06 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу скрининга для идентификации новых лекарственных средств для лечения туберкулеза, а также к способу диагностики для идентификации клинических штаммов, устойчивых к этим новым лекарственным средствам.

Уровень техники

Туберкулез (ТБ) остается лидирующей причиной смертности, вызываемой единственным инфекционным агентом, Mycobacterium tuberculosis. Этот патоген в форме латентной инфекции присутствует у трети мировой популяции. На сегодняшний день лекарственная терапия ТБ состоит из коктейля лекарственных средств первой и второй линии. Фактическая терапия ТБ занимает от шести до девяти месяцев, что приводит к значительной токсичности и лекарственной резистентности. С появлением лекарственных средств против ТБ часто встречаются лекарственно-резистентные штаммы M. tuberculosis. В действительности, микобактерии обладают природной резистентностью к большинству используемых антибиотиков благодаря своей необычной клеточной стенке. Более того, полагают, что за приобретенную лекарственную резистентность отвечают генетические изменения. Штаммы М. tuberculosis, резистентные к растущему числу лекарственных средств второй линии, используемых для лечения лекарственно-резистентного туберкулеза (ЛР-ТБ), становятся угрозой здоровью людей по всему миру (1). Соответственно, существует острая необходимость в лекарственных средствах для лечения туберкулеза. В частности, человечеству необходимы новые лекарственные средства с новым механизмом действия, активные в отношении лекарственно-резистентных штаммов. Соответственно, срочно необходима идентификация новых лекарственных мишеней (2).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того, что белок Rv3790 из Mycobacterium tuberculosis (кодирующую его последовательность ДНК можно получить по адресу http://genolist.pasteur.fr/TubercuList (общемировой интернет-сервер TubercuList; координаты гена Rv3790: с 4162306 по 4163718) является мишенью бензотиазиноновых лекарственных средств, нового класса молекул, которые, по-видимому, являются весьма многообещающими в лечении туберкулеза («Новые тиазиноновые производные, их получение и их применение в качестве антибактериальных средств», патентная заявка № PCT/EP2006/004942, на имя Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology e.V.Hans-Knöll-Institute (HKI).

Было продемонстрировано, что белки Rv3790 и Rv3791 работают взаимосвязано, и они вовлечены в биосинтез арабиногалактана (3). Арабиногалактан является основным компонентом клеточной стенки микобактерий, который ковалентно связывает внешний слой миколовых кислот с пептидогликаном. В частности, оба Rv3790 и Rv3791 важны для трансформации декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу (3). Открытие позволяет предположить, что бензотиазиноновые лекарственные средства нарушают биосинтез клеточной стенки микобактерий. Следует отметить, что с помощью транспозонного мутагенеза на базе Himar1 в штамме H37Rv оба гена rv3790-rv3791 были описаны как необходимые (4).

Авторами было обнаружено, что мутации в С-конце белка Rv3790, а также его сверхэкспрессия, придают высокий уровень устойчивости к лекарственным средства - производным бензотиазинона - у Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG и Mycobacterium smegmatis. Гены rv3790 дикого типа и мутированные, а также rv3791, были клонированы и сверхэкспрессированы в Escherichia coli.

Чувствительные к бензотиазиноновым производным ортологи Rv3790 были найдены у микроорганизмов следующих родов: Nocardia, Rhodococcus и Corynebacterium.

Можно высказать гипотезу, что превосходные результаты, полученные в лабораторных исследованиях бензотиазиноновых производных, коррелируют с открытым ингибирующим действием в отношении Rv3790. Эти данные могут служить основанием для новых исследований в области лекарственных средств, действующих против белка Rv3790. Поэтому белок Rv3790 и родственные ему гомологи, в частности ортологи, представляют собой не только оптимальные мишени для лекарственных средств, принадлежащих классу бензотиазинонов, но также являются многообещающей мишенью для поиска новых лекарственных средств, используемых для борьбы с инфекциями, вызываемыми Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia, Rhodococcus и Corynebacterium.

Поэтому задача настоящего изобретения относится к способу скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения туберкулеза путем нарушения биосинтеза алабиногалактана, причем указанный способ включает в себя стадию приведения в контакт клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующей белок, выполняющий превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом, с потенциальным лекарственным средством, и последующей оценки процента ингибирования с помощью потенциального лекарственного средства относительно контроля (M. tuberculosis, трансформированных только вектором pSODIT-2) в аналитическом тесте.

Предпочтительно, чтобы аналитический тест представлял собой in vitro аналитический тест антибактериальной активности или ферментативный тест.

Другая задача настоящего изобретения представляет собой получение клеточной культуры из мутантных штаммов Mycobacterium tuberculosis (имеющих замену аминокислоты цистеина в 387 положении на серин или глицин) для использования в качестве контрольного инструмента в способе по настоящему изобретению.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является получение рекомбинантного белка Rv3790 дикого типа и его мутантных форм для метода анализа ферментативной активности и способа скрининга для идентификации новых лекарственных средств.

Открытие того, что белки типа Rv3790, кодируемые мутантными генами, отвечают за резистентность к лекарственным средствам, нарушающим биосинтез арабиногалактана, такими как бензотиазиноновые лекарственные средства, будет иметь важное значение для диагностики и лечения лекарственно-резистентных штаммов микобактерий.

Поэтому другая задача настоящего изобретения относится к быстрому способу диагностики лекарственно-резистентных штаммов микобактерий, который включает в себя амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (5) внутренней области гена rv3790 из штамма Mycobacterium tuberculosis, выделенного из пациента с ТБ, перекрывающей кодон 387, и анализ ДНК-последовательности на присутствие идентифицированных мутаций, ответственных за резистентность к лекарственным средствам, нарушающим биосинтез арабиногалактана, таким как бензотиазиноны.

В контексте настоящего изобретения термин «лекарственное средство, нарушающее биосинтез арабиногалактана», означает молекулу, которая предупреждает превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу путем блокирования или подавления экспрессии белка, осуществляющего превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом.

Другой задачей настоящего изобретения являются ингибиторы белка Rv3790, полученные способом скрининга по изобретению, а также способ лечения туберкулеза с помощью таких ингибиторов, причем такие ингибиторы предпочтительно выбраны из бензотиазинонов (или других молекул, метаболизм которых продуцирует бензотиазиноны), моноклональных антител против Rv3790, антисмысловых РНК-последовательностей или вакцин.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показан анализ множественного выравнивания ортологов Rv3790 из нескольких родов актинобактерий;

на фиг.2 показана ДНК-последовательность гена rv3790.

Подробное описание изобретения

Первой задачей настоящего изобретения является способ скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения туберкулеза путем нарушения биосинтеза арабиногалактана, где указанный способ включает в себя стадию внесения в контакт клеточных культур Mycobacterium tuberculosis (трансформированных pSODIT-2/Rv3790), сверхэкспрессирующих белок, выполняющий превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом, с потенциальным лекарственным средством, и последующей оценки процента ингибирования, вызываемого потенциальным лекарственным средством, относительно контроля в аналитическом тесте.

Предпочтительно, чтобы аналитический тест представлял собой in vitro аналитический тест антибактериальной активности или ферментативный тест.

В антибактериальном тесте оценку процента ингибирования предпочтительно проводить, определяя минимальные ингибирующие концентрации (МИК). МИК определяют как наименьшую концентрацию противомикробного средства, которая ингибирует визуальный рост микроорганизмов после соответствующей инкубации.

Каждое потенциальное лекарственное средство также тестируют на клеточной культуре M. tuberculosis, трансформированной только одним вектором pSODIT-2.

В качестве контроля можно использовать изониазид, который представляет собой референсное лекарственное средство в лечении туберкулеза.

В качестве альтернативы или дополнения можно провести другой контрольный эксперимент, в котором не используется никакое потенциальное лекарственное средство, то есть с 0% ингибирования. Далее оценивают % ингибирования, полученный с использованием потенциального лекарственного средства, относительно такого контроля.

Указанную стадию внесения клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis в контакт с потенциальным лекарственным средством можно провести, помещая препарат клеток на один или несколько растворов потенциального лекарственного средства при различных концентрациях лекарственного средства в подходящей среде.

Потенциальное лекарственное средство обычно тестируют в соответствующей форме, которая позволяет хороший контакт между веществом и клеточной культурой. Предпочтительно использование потенциального лекарственного средства в растворе или суспензии. Потенциальное лекарственное средство используют в количестве, которое зависит от нескольких факторов, в том числе от молекулярного веса вещества, его растворимости и т.п.

Для вычисления МИК (минимальной ингибирующей концентрации) для каждого потенциального лекарственного средства предпочтительно использовать две или более его концентрации.

Предпочтительной средой является твердая среда Middlebrook 7H11 (Difco). Более предпочтительно добавление к этой среде олеиновой кислоты, бычьего сывороточного альбумина, декстрозы и каталазы (OADC). Эта среда является типовой для штаммов микобактерий.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является получение рекомбинантного белка Rv3790 дикого типа и его мутантных форм из клеток Escherichia coli для метода анализа ферментативной активности (по способу, описанному в ссылке 3) и способа скрининга для идентификации новых лекарственных средств. Ферментативный скрининг можно проводить с использованием рекомбинантного фермента Rv3790 в реакционной смеси, содержащей FAD, NAD⁺, NADPH и радиоактивно меченную декапренилфосфорил-рибозу (DPR), которая посредством ферментативной реакции превращается в декапренилфосфорил-D-Araf (DPA). Эта реакция является контрольным экспериментом. Проводят другой эксперимент, в котором повторяют процедуру в присутствии потенциального лекарственного средства. Детектируют количество таким образом образуемого DPA и вычисляют % ингибирования ферментативной реакции, вызванный потенциальным лекарственным средством. Образование DPA определяют по стандартным процедурам, хорошо известным опытному специалисту, таким как процедуры, описанные в ссылке (3).

Способ скрининга по изобретению может также включать в себя in vivo оценку активности потенциальных лекарственных средств, которые прошли стадию скрининга in vitro. Эту in vivo оценку можно провести, как описано ниже, в частности, введением потенциального лекарственного средства в соответствии с определенными схемами введения мышам с гематогенно диссеминированным штаммом туберкулезом относительно контрольного лекарственного средства и относительно плацебо.

Предпочтительным контрольным лекарственным средством является изониазид.

Предпочтительно использовать мышей линии BALB/c.

Предпочтительным туберкулезным штаммом является вирулентная культура Mycobacterium tuberculosis H37Rv, более предпочтительно, в концентрации 5×10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц) в физиологическом буфере.

Скрининговая доза потенциального лекарственного средства может варьировать в широком диапазоне дозировок, в зависимости от нескольких факторов, таких как МИК, вычисленная из результатов приведенного выше теста in vitro, или LD₅₀, которую можно определить для такого средства. В общем, доза потенциального лекарственного средства, используемая в настоящем способе скрининга in vivo, будет ниже его LD₅₀.

Предпочтительно вводить лекарственное средство перорально в виде суспензии в подходящем буфере.

Предпочтительно проводить лечение ежедневно, 6 раз в неделю.

Для определения эффективности каждой схемы лечения регистрируют макроскопические изменения в паренхимных органах мышей, рост микобактерий из патологического материала на твердой среде, а также бактериоскопический индекс поражения органов. Также проводят качественный и количественный анализ макроскопических изменений в печени, селезенке и легких и вычисляют индекс поражения (по 4-бальной шкале).

Дополнительная задача настоящего изобретения относится к способу диагностики лекарственно-резистентных штаммов микобактерий. Способ диагностики включает в себя амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (5) гена rv3790 из штамма Mycobacterium tuberculosis, выделенного из пациента с ТБ, и анализ ДНК-последовательности на присутствие идентифицированных мутаций.

Предпочтительно, способ включает в себя амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (5) внутренней области гена rv3790 из штамма Mycobacterium tuberculosis, выделенного из пациента с ТБ, перекрывающей кодон 387, и анализ ДНК-последовательности на присутствие идентифицированных мутаций (замену цистеина на глицин или серин), ответственных за резистентность к лекарственным средствам, нарушающим биосинтез арабиногалактана, таким как бензотиазиноны.

Другой задачей настоящего изобретения являются ингибиторы белка Rv3790, которые можно получить способом скрининга по изобретению, а также способ лечения туберкулеза с помощью таких ингибиторов, причем такие ингибиторы предпочтительно выбраны из бензотиазинонов (или других молекул, метаболизм которых продуцирует бензотиазиноны), моноклональных антител, полученных против Rv3790, антисмысловых РНК-последовательностей или вакцин.

Лекарственные средства, нарушающие биосинтез арабиногалактана

Лекарственные средства, которые можно получить с помощью способа скрининга по изобретению, предпочтительно, выбраны из моноклональных антител против белка Rv3790 и антисмысловых РНК-последовательностей для гена rv3790, причем такие лекарственные средства показывают % ингибирования выше 50% в in vitro скрининге и/или % ингибирования выше 50% в in vivo антибактериальном тесте по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанными лекарственными средствами являются моноклональные антитела против белка Rv3790. Такие антитела можно получить с помощью стандартных процедур, в том числе описанных в литературе (6, 7).

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанными лекарственными средствами являются антисмысловые последовательности гена rv3790.

Настоящее изобретение относится к антисмысловым олигомерам, имеющим последовательность, эффективную для ингибирования или блокирования экспрессии гена или последовательности мРНК, кодирующих белок Rv3790. Антисмысловая технология, в которой для ингибирования экспрессии продуктов генов-мишеней используют специфические олигонуклеотиды, разрабатывается в качестве метода терапии против болезней человека. Для оптимизации антисмысловых олигонуклеотидных антагонистов доступны несколько критериев выбора. Например, рекомендуется выбирать последовательности с содержанием GC 50% или выше. Предпочтительные последовательности захватывают инициирующий кодон AUG белка-мишени, а расположение в кодирующей области и 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) работает в равной степени хорошо. Обычно длина таких последовательностей составляет примерно 18-30 нуклеотидов. Было найдено, что более длинные олигомеры сильнее ингибируют мишень, что указывает на то, что предпочтительная длина составляет примерно 25 элементов для первых олигонуклеотидов, выбранных в качестве антисмысловых реагентов. Обычно, с учетом эти критериев выбирают три олигонуклеотидных последовательности и сравнивают их антагонистическую активность с контрольными олигонуклеотидными последовательностями, такими как «обратные» олигонуклеотиды или нуклеотиды, у которых рандомизировано каждое четвертое основание антисмысловой последовательности. Поэтому предпочтительной последовательностью для создания антисмысловых олигомерных последовательностей к rv3790 является 25-элементная последовательность из мРНК-последовательности rv3790: AUG UUG AGC GUG GGA GCU ACC ACU A. Полная последовательность гена rv3790 размещена по адресу in http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/ под наименованием гена rv3790. Полная ДНК-последовательность rv3790 приведена на фиг.2. Такие предпочтительные смысловые последовательности используются для конструирования антисмысловых олигонуклеотидных агентов (и соответствующих контролей) для проведения сравнения in vitro в качестве ингибиторов белка Rv3790. Эти данные in vitro позволяют предсказать пользу при клиническом применении у людей антисмысловых агентов аналогичной конструкции.

Еще один дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения также может относиться к вакцинам, образованным последовательностью или включающим последовательность белка Rv3790.

Способ лечения

Настоящее изобретение дополнительно охватывает способ лечения пациента, пораженного туберкулезом, причем способ включает введение указанному пациенту антибактериально эффективного количества лекарственного средства, нарушающего биосинтез арабиногалактана путем блокирования или подавления экспрессии белка, осуществляющего превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу.

Предпочтительно, таким лекарственным средством является бензотиазиноновая молекула или моноклональные антитела против Rv3790, или антисмысловые РНК-последовательности к гену rv3790.

Предпочтительно, способ лечения дополнительно включает введение антибактериального лекарственного средства против Mycobacterium tuberculosis, имеющего другой механизм действия, такого как изониазид.

Вводимая доза указанного лекарственного средства, нарушающего биосинтез арабиногалактанов, может варьировать в широком диапазоне в зависимости от активности ингибитора, тяжести заболевания, состояния пациента, его веса и возраста, а также пути введения, определяемого лечащим врачом.

Обычно лекарственное средство можно использовать в дозировках в пределах от 0,001 мг до 50 мг на кг веса тела, от 1 до 4 раз в день.

Также заявлено применение лекарственного средства, нарушающего биосинтез арабиногалактана, определенного выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения туберкулеза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Определение in vitro минимальной ингибирующей активности (МИК) потенциального лекарственного средства против микобактерий

Использовали единичную колонию штамма M. tuberculosis для заражения среды Middlebrook 7H9, обогащенной 10% OADC и 0,05% Tween 80 (Difco). Эта среда является типовой для штаммов микобактерий.

Культуру инкубировали при 37°C до экспоненциальной фазы роста (OD₆₀₀ нм = 1→~10⁸ КОЕ/мл). Приготавливали разведения такой культуры и использовали для посева на твердую среду ~10⁵ КОЕ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИК НА ТВЕРДОЙ СРЕДЕ

Приготавливали чашки с агаром Middlebrook 7H11 (Difco), содержащим 10% OADC, добавляя увеличивающиеся количества лекарственных средств. Для определения МИК каждого потенциального лекарственного средства предпочтительно использовать несколько его концентраций. На среду высевали разведения культуры, и чашки инкубировали при 37°C в течение 21 дня. Ингибирование роста оценивали визуально.

Определение in vivo ингибирующей активности потенциальных лекарственных средств против Mycobacterium tuberculosis в мышиной модели ТБ

Для определения фармакотерапевтической эффективности можно использовать мышей линии BALB/c с экспериментально гематогенно диссеминированным туберкулезом.

Мышей инфицировали 2-недельной вирулентной культурой Mycobacterium tuberculosis H37Rv с помощью внутривенной инъекции (в хвостовую вену) суспензией микобактерий в дозировке 5×10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц) в 0,5 мл физиологического растворе. Всех экспериментальных животных разделяли на группы в зависимости от используемой схемы лечения.

Лечение начинали на следующий день после инфекции. Лекарственные средства вводили перорально в виде суспензии в карбоксиметилцеллюлозе в воде с небольшим количеством ПЭГ-400. Фармакотерапию проводили ежедневно 6 раз в неделю.

Затем животных умерщвляли. Для определения каждой схемы лечения регистрировали макроскопические изменения в паренхимных органах мышей, рост микобактерий из патологического материала на твердой среде, а также бактериоскопический индекс поражения органов. Также проводили качественный и количественный анализ макроскопических изменений в печени, селезенке и легких и вычисляли индекс поражения (по 4-бальной шкале).

Макроскопическую оценку эффективности каждой схемы лечения выражали индексом эффективности, вычисленным с использованием следующей формулы:

Индекс эффективности = 100% - индекс поражения исследуемой группы/Индекс поражения контрольной группы × 100

Микробиологическая оценка включает культивирование для определения КОЕ в паренхимных органах. Для этой цели правое легкое и отдельно селезенку гомогенизировали в 6% серной кислоте, центрифугировали, промывали водой и физиологическим раствором. Полученную биомассу (примерно 0,5 мл) разводили 1,0 мл физиологического раствора и гомогенизировали. Эту суспензию тестируемых органов (0,5 мл) разводили физиологическим раствором в 100 и 1000 раз и распределяли на твердой среде Finn-2. Культуры инкубировали при 37°С в течение 1 месяца и проверяли еженедельно, начиная с 10-го дня. Через 28 дней подсчитывали КОЕ.

Получение рекомбинантного Rv3790

Для получения экспрессии белка в Е. coli были протестированы несколько условий роста в присутствии или отсутствие изопропил-β-тиогалактозида (IPTG) в качестве индуктора при концентрациях в диапазоне от 0,125 мМ до 1 мМ. Все культуры инкубировали при 37°C в течение 2 часов, при 27°C в течение 2 и 4 часов и при 20°C в течение 2 и 20 часов. Клетки собирали центрифугированием и полученные белковые экстракты анализировали разделением в ДСН-ПААГ. Рекомбинантные белки очищали согласно инструкциям производителя (Qiagen).

Определение Rv3790 в качестве мишени для бензотиазинонов

Для идентификации молекулярной мишени бензотиазинонов следовали двум различным научным/техническим подходам:

а) Трансформация М. smegmatis космидной библиотекой Mycobacterium smegmatis и отбор на резистентность к бензотиазинонам;

б) Стандартный мутагенез: поиск спонтанных мутаций путем высевания культур микобактерий на среду, содержащую бензотиазиноны.

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) различных бензотиазинонов для M. smegmatis mc²155, M. bovis BCG и M. tuberculosis H37Rv определяли, как описано выше, на твердой среде Middlebrook 7H11 с добавленными олеиновой кислотой, бычьим сывороточным альбумином, декстрозой и каталазой (OADC).

Внимание было направлено на наиболее активный бензотиазинон: 10526038. МИК также определяли для изониазида в качестве контрольного средства. МИК для 10526038 и изониазида показаны в таблице 1.

Таблица 1 МИК для 10526038 и изониазида для различных видов микобактерий Штаммы МИК   10526038 [нг/мл] Изониазид [мкг/мл] M. smegmatis mc ² 155 4 16 M. bovis BCG 2 0,05 M. tuberculosis H37Rv 0,75 0,05

Подход (а)

Геномная библиотека M. smegmatis mc²155 была сконструирована с использованием космидного вектора pYUB18 и трансформирована в M. smegmatis mc²155; рекомбинантные клоны отбирали, высевая трансформанты на различные концентрации бензотиазинонов (варьирующие от 16 нг/мл до 64 нг/мл). Были отобраны две космиды, отвечающие за резистентность к бензотиазинону (8-кратное превышение МИК, 8Х-МИК), частично определены их нуклеотидные последовательности и проведено их сравнение с последовательностью генома M. smegmatis mc²155 (www.tiger.org). Эти космиды имели перекрывающуюся вставку размером 22 т.п.о. С помощью субклонирования общей области генома был идентифицирован ген, отвечающий за резистентность к 10526038. Этот ген, длиной 1383 п.о., кодирует гипотетическую оксидоредуктазу (MSMEG_6382), высоко гомологичную белку Rv3790 из M. tuberculosis (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Было продемонстрировано, что белки Rv3790 и Rv3791 работают взаимосвязано, и они вовлечены в биосинтез арабиногалактана, основного компонента клеточной стенки микобактерий. Они оба важны для трансформации декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу (3).

Следует отметить, что с помощью транспозонного мутагенеза на базе Himar1 в штамме H37Rv оба гена rv3790-rv3791 были описаны как необходимые для жизни M. tuberculosis (4). Ген rv3790 был клонирован в экспрессионный вектор pSODIT-2 и трансформирован в следующие штаммы: M. smegmatis, M. bovis BCG и M. tuberculosis. Как показано в таблице 2, сверхэкспрессия Rv3790 придает высокий уровень резистентности к 10526038 всем трем видам микобактерий.

Таблица 2 МИК 10526038 для различных видов микобактерий, сверхэкспрессирующих Rv3790 Плазмида МИК 10526038 (уровень резистентности)   M. smegmatis [нг/мл] M. bovis BCG [нг/мл] M. tuberculosis [нг/мл] pSODIT2 4 2 0,75 Rv3790/pSODIT-2 256 (32X-MIC) 32 (8X-МИК) 500 (333X-МИК)

Подход (b)

Были выделены спонтанно возникающие мутанты соответственно в M. smegmatis, M. bovis BCG и M. tuberculosis.

Результаты, полученные в M. smegmatis mc ² 155

Для идентификации клеточной мишени бензотиазинонов, с помощью спонтанного стандартного мутагенеза были выделены мутанты M. smegmatis mc²155, резистентные к бензотиазинону 10526038, посредством высевания ~10¹⁰ клеток на твердую среду, содержащую различные концентрации средства, варьирующие от 10 до 30-кратной МИК для штамма дикого типа. Резистентные мутанты выделяли с частотой от 10^-7 до 10^-9. Результаты этого отбора показаны в таблице 3.

Таблица 3 Спонтанные мутанты M. smegmatis, резистентные к 10526038 Мутанты M. smegmatis Концентрация 10526038, используемая для выделения Частота выделения Уровень резистентности MN 47; 48 30X-МИК 5•10^-9 500X-МИК MN 81; 84 30X-МИК 5•10^-9 ≥4000X-МИК

У четырех мутантов M. smegmatis (MN47, MN48 и MN81, MN84) с разным уровнем резистентности к 10526038 (500/>4000X-МИК) была определена нуклеотидная последовательность гена MSMEG_6382 и расположенной выше области длиной 200 п.о. Эту нуклеотидную область сравнивали с последовательностью дикого типа (www.tiger.org). В нуклеотидных последовательностях из резистентных штаммов M. smegmatis были идентифицированы две точечные мутации. Эти две мутации расположены в одном кодоне, но относятся к разным нуклеотидам в соответствии с различным уровнем резистентности, как показано в таблице 4.

Таблица 4 Мутации, идентифицированные в резистентных штаммах M. smegmatis. Мутированные нуклеотиды подчеркнуты Штаммы M. smegmatis МИК (уровень резистентности) Кодон Аминокислота (394) Дикий тип 4 нг/мл Tgc Цистеин Мутант MN47, MN48 4 мкг/мл (500Х-МИК) Ggc Глицин Мутант MN81, MN84 >16 мкг/мл (≥4000Х-МИК) Tcc Серин

Результаты, полученные в M. bovis BCG Pasteur

Для идентификации клеточной мишени бензотиазинонов, были выделены высоко резистентные мутанты M. bovis BCG посредством высевания ~10¹⁰ клеток на твердую среду, содержащую различные концентрации 10526038, варьирующие от 5- до 40-кратной МИК для штамма дикого типа. Резистентные мутанты получали с частотой 10^-8. Результаты этого отбора показаны в таблице 5.

Таблица 5 Спонтанные мутанты M. bovis, резистентные к 10526038 Мутанты M. Bovis Концентрация 10526038, используемая для выделения Частота выделения Уровень резистентности BN1-8 40X-МИК 1,8•10^-8 ≥8000X-МИК

Определение нуклеотидной последовательности гена, гомологичного rv3790, проводили для восьми мутантов M. bovis. Точечная мутация была идентифицирована в соответствующем кодоне, мутированном в M. smegmatis. У всех 8 мутантов был мутирован второй нуклеотид, меняющий аминокислоту с цистеина дикого типа на серин, как показано в таблице 6.

Таблица 6 Мутации, идентифицированные в резистентных штаммах M. bovis. Мутированные нуклеотиды подчеркнуты Штаммы M. bovis МИК (уровень резистентности) Кодон Аминокислота (387) Дикий тип 2 нг/мл Tgc Цистеин Мутант BN1-8 >16 мкг/мл (≥8000Х-МИК) Tcc Серин

Результаты, полученные в M. tuberculosis H37Rv

Для обнаружения мишени бензотиазинонов в M. tuberculosis (Mtb), авторами изобретения были выделены некоторые спонтанно резистентные мутанты Mtb. МИК для 10526038 в Mtb является очень низкой, составляя 1,5 нг/мл (в отличие от 0,05 мкг/мл для изониазида).

Выделение резистентных мутантов проводили на среде 7Н11 (типовой для микобактерий) с добавлением лекарственного средства 10526038 при различных концентрациях. Использовали четыре независимых культуры Mtb при O.D.₆₀₀=1. Аликвоты (250 мкл) четырех культур высевали на следующие концентрации лекарственных средств: 10Х МИК, 40Х МИК, 70Х МИК, 150Х МИК и 300Х МИК. Были получены спонтанные резистентные мутанты Mtb при всех концентрациях лекарственных средств за исключением 10Х МИК. В таблице 7 показаны выделенные мутанты, частота и значения МИК.

Таблица 7 Спонтанные мутанты Mtb, резистентные к 10526038 Мутанты Mtb Концентрация 10526038, используемая для выделения Частота выделения Уровень резистентности NTB1 150X МИК 6,6•10^-7 ≥2000X МИК NTB2 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB3 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB4 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB5 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB6 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB7 300X МИК 2•10^-8 ≥2000X МИК NTB8 40X МИК 3,3•10^-7 ≥2000X МИК NTB9 70X МИК 3,3•10^-7 166X МИК NTB10 150X МИК 6,6•10^-7 ≥2000X МИК

Важно подчеркнуть, что мутанты были выделены только при высоких концентрациях лекарственного средства, и выделенные мутанты имеют два различных уровня резистентности. В частности, мутант NTB9 имеет меньшую резистентность и растет очень медленно.

Для поиска мутации, ответственной за резистентность, авторами была определена нуклеотидная последовательность гена rv3790 во всех мутантах. Были найдены две различные смысловые точечные мутации, затрагивающие тот же кодон гена rv3790 (таблица 8).

Таблица 8 Мутации, идентифицированные в резистентных штаммах Mtb Rv3790. Мутированные нуклеотиды подчеркнуты Штаммы Mtb МИК (уровень резистентности) Кодон Аминокислота (387-е положение) Mtb дикого типа 1,5 нг/мл tgc Цистеин Мутанты NTB1-8, NTB10 ≥2000Х-МИК tcc Серин Мутант NTB9 166Х-МИК ggc Глицин

Приведенные выше результаты указывают на белок Rv3790 в качестве мишени бензотиазиноновых лекарственных средств.

Поскольку два распространенных механизма резистентности к антибиотикам включают амплификацию мишени или модификацию мишени, с помощью первого способа авторами изобретения были выделены штаммы микобактерий, резистентные к бензотиазинонам посредством механизма амплификации, в то время как с помощью второго способа авторами были выделены штаммы микобактерий, резистентные к бензотиазинонам в результате мутаций в определенном кодоне гена rv3790. Этот кодон присутствует в С-концевом участке белка Rv3790; цистеин в белке Rv3790 дикого типа заменен на глицин в M. tuberculosis и M. smegmatis (см. мутанты NTB9, MN47 и MN48) или серин в M. tuberculosis, M. bovis BCG и M. smegmatis (см. мутанты NTB1-8, NTB10, BN1-8, MN81 и MN84), дающие различные уровни резистентности. Наивысший уровень резистентности наблюдался при замене на серин.

Поскольку все мутации присутствуют в одном и том же кодоне, цистеин может представлять собой активный сайт связывания с лекарственным средством.

Поэтому отобранные in vitro мутанты позволяют высказать весьма вероятное предположение, что мишенью бензотиазиноновых лекарственных средств является белок Rv3790, в результате чего нарушается биосинтез арабиногалактана.

Ортологи Rv3790

С помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=microb) авторы изобретения провели поиск наличия ортологов rv3790 в родственных микроорганизмах, принадлежащих семейству актиномицетов: Mycobacterium avium, Mycobacterium aurum, Mycobacterium leprae, других видов микобактерий, Nocardia spp., Rhodococcus spp. и Corynebacterium spp. Поскольку для некоторых микроорганизмов, таких как Mycobacterium aurum, ДНК-последовательность rv3790 была неизвестна, авторы изобретения клонировали и секвенировали в своей лаборатории соответствующий ген. Белок Rv3790 является весьма консервативным во всех исследуемых микроорганизмах, как было показано с помощью выравнивания нескольких последовательностей с помощью программы ClustalW (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html).

Следует отметить консервативность критического цистеина во всех исследуемых микроорганизмах. Действительно, авторы изобретения обнаружили высокую степень консервативности данного цистеина у этих микроорганизмов, за исключением Mycobacterium avium, Mycobacterium avium paratuberculosis и Mycobacterium aurum, в которых Cys замещен аланином и серином соответственно (фиг.1).

Для подтверждения того, действительно ли отсутствие цистеина придает устойчивость к бензотиазинону 10526038, авторы изобретения определили МИК для следующих микроорганизмов: Mycobacterium avium, Mycobacterium aurum, Nocardia spp., Rhodococcus spp. и Corynebacterium spp.

Для видов микобактерий эксперимент проводили на среде 7Н11 с различными концентрациями лекарственного средства. МИК определяли на разведении культуры при плотности 0,5 по стандарту Макфарланда.

Для других актиномицетов Nocardia spp., Rhodococcus spp. и Corynebacterium spp. разведения при плотности 0,5 по стандарту Макфарланда наносили штрихом на кровяной агар Мюллера-Хинтона с добавлением различных концентраций лекарственного средства.

Как показано в таблице 9, бензотиазинон 10526038 был более активен против видов актиномицетов. Только М. avium и M. aurum, по-видимому, обладали природной резистентностью к бензотиазинонам; что подтверждало гипотезу авторов изобретения, что данный Cys играет ключевую роль в чувствительности к бензотиазинону 10526038.

Таблица 9 Определение МИК бензотиазинона 10526038 для видов актиномицетов Микроорганизмы N386 значение МИК Mycobacterium tuberculosis 0,75 нг/мл Mycobacterium bovis BCG 1,5 нг/мл Mycobacterium smegmatis 4 нг/мл Mycobacterium aurum DSM43999 >50 мкг/мл Mycobacterium aurum DSM43536 >50 мкг/мл Mycobacterium aurum SB66 клинический изолят >50 мкг/мл Mycobacterium vaccae 0,75 нг/мл Mycobacterium avium клинический изолят >25 мкг/мл Nocardia spp. клинический изолят 12 нг/мл Rhodococcus spp. клинический изолят 6 нг/мл Corynebacterium spp. клинический изолят 200-500 нг/мл

Гетерологичная экспрессия Rv3790

Поскольку белок Rv3790 работает взаимосвязано с Rv3791 (3), были сконструированы следующие рекомбинантные клоны:

1) Фермент Rv3790 дикого типа (Rv3790 WT) был получен в штамме Escherichia coli BL21(DE3)pLysS с использованием вектора рЕТ32.

2) Фермент Rv3791 дикого типа (Rv3791 WT) был получен в штамме Escherichia coli BL21(DE3)pLysS с использованием вектора рЕТ15.

3) Мутированный фермент Rv3790 (Cys→Gly: из резистентного мутанта M. tuberculosis) был получен в штамме Escherichia coli BL21(DE3)pLysS с использованием вектора рЕТ32.

3) Мутированный фермент Rv3790 (Cys→Ser: из резистентного мутанта M. tuberculosis) был получен в штамме Escherichia coli BL21(DE3)pLysS с использованием вектора рЕТ32.

Гены rv3790 и rv3791 из штаммов M. tuberculosis дикого типа и резистентных штаммов (NTB1 и NTB9) амплифицировали на геноме M. tuberculosis с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонировали в различные экспрессионные векторы. Рекомбинантные конструкции трансформировали в клетки E. coli BL21DE3/pLysS с помощью электропорации. Для получения экспрессии белка в Е. coli были протестировали несколько условий роста, в присутствии или отсутствие изопропил-β-тиогалактозида (IPTG) в качестве индуктора при концентрациях в диапазоне от 0,125 мМ до 1 мМ. Все культуры инкубировали при 37°C в течение 2 часов, при 27°C в течение 2 и 4 часов и при 20°C в течение 2 и 20 часов. Клетки собирали центрифугированием и полученные белковые экстракты анализировали разделением в ДСН-ПААГ.

Литература

1. Shah NS, Wright A, Bai GH, et al. Worldwide emergence of extensively drug-resistant tuberculosis. Emerg Infect Dis 2007, 13:380-387.

2. Williams KJ, Duncan K. Current strategies for identifying and validating targets for new treatment-shortening drugs for TB. Curr Mol Med 2007, 7:297-307.

3. Mikusova K, et al. Decaprenylphosphoryl arabinofuranose, the donor of the D-arabinofuranosyl residues of mycobacterial arabinan, is formed via a two-step epimerization of decaprenylphosphoryl ribose. J Bacteriol 2005, 187:8020-8025.

4. Sassetti CM, et al. Genetic requirements for mycobacterial survival during infection. Proc Natl Acad Sci USA 2003 100:12989-12994.

5. Mullis K, et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, 51:263-73.

6. Andersen P, et al. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice. J Immunol 1995, 154:3359-3372.

7. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975, 256:495-497.

Изобретение относится к медицине и касается способа скрининга in vitro потенциальных лекарственных средств для лечения туберкулеза путем нарушения биосинтеза арабиногалактана, где указанный способ включает стадию приведения в контакт клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующей белок, выполняющий превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом, с потенциальным лекарственным средством, и последующей оценки процента ингибирования, вызываемого потенциальным лекарственным средством, относительно контроля в аналитическом тесте. Изобретение обеспечивает идентификацию новых лекарственных средств. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл.

1. Способ скрининга in vitro потенциальных лекарственных средств для лечения туберкулеза путем нарушения биосинтеза арабиногалактана, где указанный способ включает стадию приведения в контакт клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующей белок, выполняющий превращение декапренил-Р-рибозы в декапренил-Р-арабинозу, и который может кодироваться геном rv3790 или его гомологами, или искусственной открытой рамкой считывания, продукт экспрессии которой идентичен белку Rv3790 или является его гомологом, с потенциальным лекарственным средством, и последующей оценки процента ингибирования, вызываемого потенциальным лекарственным средством, относительно контроля в аналитическом тесте.

2. Способ скрининга по п.1, в котором указанный аналитический тест представляет собой in vitro тест антибактериальной активности или ферментативный тест.

3. Способ скрининга по п.1, в котором клеточная культура Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующая Rv3790, получена трансформацией клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis плазмидой pSODIT-2/Rv3790.

4. Способ скрининга по п.1, в котором оценку процента ингибирования проводят, определяя минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) потенциального лекарственного средства.

5. Способ скрининга по п.4, в котором для вычисления указанной МИК для каждого потенциального лекарственного средства используют две или более концентраций лекарственных средств.

6. Способ скрининга по п.1, в котором каждое потенциальное лекарственное средство также тестируют на клеточной культуре М. tuberculosis, трансформированной одним только вектором pSODIT-2.

7. Способ скрининга по п.1, в котором указанным контролем является изониазид.

8. Способ скрининга по п.1, в котором проводят другой контрольный эксперимент, в котором не используется никакое потенциальное лекарственное средство, то есть с 0% ингибирования, и в котором оценивают % ингибирования, полученный с использованием потенциального лекарственного средства, относительно такого дополнительного контроля.

9. Способ скрининга по п.1, в котором указанную стадию приведения в контакт клеточной культуры Mycobacterium tuberculosis, сверхэкспрессирующей Rv3790, с потенциальным лекарственным средством можно провести посевом препарата клеток на подходящую среду, содержащую различные концентрации потенциального лекарственного средства.

10. Способ скрининга по п.9, в котором указанной средой является твердая среда Middlebrook 7H11 (Difco).

11. Способ скрининга по п.10, в котором к указанной среде добавлены олеиновая кислота, бычий сывороточный альбумин, декстроза и каталаза (OADC).

12. Способ скрининга по п.2, причем указанный аналитический тест является ферментативным тестом, включающим в себя стадию приведения в контакт потенциального лекарственного средства с рекомбинантным ферментом Rv3790 в реакционной смеси, содержащей FAD, NAD⁺, NADPH и радиоактивно меченную декапренилфосфорил-рибозу (DPR), и последующей оценки относительно контроля процента ингибирования ферментативной реакции, дающей декапренилфосфорил-D-Araf (DPA), вызванного потенциальным лекарственным средством.

13. Способ скрининга по любому из пп.1-12, дополнительно включающий в себя in vivo скрининговую оценку потенциальных лекарственных средств, которые прошли тест in vitro, причем указанная оценка in vivo включает в себя введение потенциального лекарственного средства в соответствии с предварительно выбранными схемами приема мышам с гематогенно диссеминированным штаммом туберкулеза относительно контрольного лекарственного средства и относительно плацебо.

14. Способ скрининга по п.13, в котором контрольным лекарственным средством является изониазид.

15. Способ скрининга по п.13, в котором используют мышей линии BALB/c.

16. Способ скрининга по п.13, в котором туберкулезным штаммом является вирулентная культура Mycobacterium tuberculosis H37RV.

17. Способ диагностики для идентификации лекарственно-резистентных штаммов микобактерий у пациента, где способ включает в себя амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции гена rv3790 из штамма Mycobacterium tuberculosis, выделенного из пациента с ТВ, и анализ ДНК-последовательности на присутствие идентифицированных мутаций, ответственных за резистентность к бензотиазинонам.

18. Способ диагностики по п.17, в котором указанными идентифицированными мутациями являются замена цистеина на глицин или замена цистеина на серии в 387 кодоне.

19. Ингибитор белка Rv3790, который можно получить способом скрининга по любому из пп.1-13, где такой ингибитор выбран из моноклональных антител, полученных против Rv3790, антисмысловых РНК-последовательностей к гену rv3790 или вакцин, содержащих белок Rv3790.

20. Ингибитор по п.19, где указанный ингибитор является антисмысловой РНК-последовательностью, которую можно получить из 25-членной последовательности мРНК-последовательности rv3790.

21. Ингибитор по п.20, в котором указанной последовательностью является SEQ ID NO. 1: AUG UUG AGC GUG GGA GCU ACC ACU A.

22. Препарат клеточной культуры мутантных штаммов Mycobacterium tuberculosis, имеющих аминокислоту цистеин в 387 положении гена rv3790, замещенную серином или глицином, в качестве средства контроля.

23. Способ лечения пациента, пораженного туберкулезом, где способ включает введение указанному пациенту ингибитора по п.19 в эффективном количестве.

24. Способ лечения по п.23, дополнительно включающий введение антибактериального лекарственного средства против Mycobacterium tuberculosis, имеющего другой механизм действия, такого как изониазид.

25. Применение ингибитора по п.19 для изготовления лекарственного препарата для лечения туберкулеза.