СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА Российский патент 2013 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена, предназначенной для диагностических целей.

Известен (Paul K.G. The Enzymes. New Jork, Acad. Press, 1963) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором и фракционирование экстракта, причем фракционирование осуществляют последовательной обработкой экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, электрофорезом, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через Сефадекс G 50 и ДЕАЕ-целлюлозу и диализом.

Основными недостатками данного способа являются невысокая чистота и активность полученного препарата, а также сложность и продолжительность процесса его получения. Кроме того, данный способ не предполагает безотходного производства.

Известен также (HU, патент №172872) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гельфильтрацию.

Недостаток данного способа состоит в недостаточно высоком выходе фермента.

Известен (BG, патент 46675) способ получения фермента из отходов производства, включающий гомогенизацию, экстракцию фермента водой, осаждение экстракта сульфатом аммония, очистку и концентрирование фермента ультрафильтрацией и гель-фильтрацией и последующую лиофилизацию.

Известен также (RU, патент №2130070) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с проведением осаждения фермента сульфатом аммония, очистку фермента концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в качестве растительной ткани хрена используют отходы от зачистки корней при производстве пищевой продукции, перед ультрафильтрацией в экстракт вносят сульфит натрия в эффективном количестве, осаждают фермент сульфатом аммония из ультрафильтрата, а после гель-фильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией.

Известный способ выбран в качестве ближайшего аналога разработанного изобретения.

Недостатками указанных способов является длительность процесса очистки с потерей активности, что приводит к ухудшению качества, а именно удельной активности, конечного продукта.

Техническая задача, на решение которой направлено разработанное техническое решение, состоит в разработке способа получения пероксидазы, обеспечивающего максимальный выход активного препарата и его высокую удельную активность.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в уменьшении расхода корней хрена и повышении выхода пероксидазы с высокой степенью чистоты и активности, а также в ускорении способа.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корня хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта, очистку фермента гидрофобной хроматографией, концентрированием ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в экстракт вносят гемин и хлорид кальция, экстракт насыщают азотом путем продувки, а фермент очищают гидрофобной хроматографией.

В некоторых вариантах реализации способа экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.

Предпочтительно гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ, а хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.

В некоторых вариантах реализации гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония в количестве 35% от насыщения.

Преимущественно гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5, а гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.

Разработанный способ включает следующую совокупность признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1) гомогенизация растительной ткани;

2) в качестве растительной ткани могут использовать как корни хрена, так и отходы, полученные при зачистке корней хрена при изготовлении пищевой продукции;

3) экстракция фермента;

4) концентрирование экстракта ультрафильтрацией;

5) очистка фермента гидрофобной хроматографией;

6) дополнительная очистка гель-фильтрацией;

7) лиофилизация фермента.

Достижение технического результата при использовании предлагаемого способа объясняется следующим образом.

Экспериментально было установлено, что образование полифенольных пигментов при разрушении биомассы является следствием протекания оксидазной реакции, которая приводит к частичной инактивации пероксидазы. Продувка буфера для экстракции азотом в течение 2 часов обеспечивает снижение концентрации кислорода до 25-30 мкМ и ингибирует образование полифенолов в 10-12 раз. Включение в состав гемина и хлорида кальция приводит к 100% насыщению активного центра гемином и дополнительной стабилизации фермента. Авторами изобретения предложено впервые использовать указанные добавки для изготовления пероксидазы, что позволило снизить расход корней хрена и повысить выход пероксидазы на единицу массы корней при высокой степени ее чистоты и активности.

Ускорение процесса получения пероксидазы достигается за счет введения стадии гидрофобной хроматографии, которая позволяет избавиться от дорогостоящего и трудоемкого осаждения сульфатом аммония. При этом достигается экономия сульфата аммония.

По сравнению с ближайшим аналогом отличительными признаками изобретения являются:

1) использование добавок гемина, хлорида кальция и предварительная продувка экстрагирующего буфера азотом при экстракции фермента;

2) очистка и одновременное концентрирование фермента гидрофобной хроматографией;

3) дополнительная очистка гель-фильтрацией в присутствии добавок гемина и кальция.

В дальнейшем способ будет иллюстрирован примером реализации.

3 кг промытых водой корней хрена измельчают в гомогенизаторе и заливают 3 л 0.1 М буферного раствора фосфата натрия, рН 7.0, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция, причем буферный раствор предварительно продут азотом. Экстрагирование ведут в течение часа. Экстракт отделяют декантацией, выдерживают сутки при 4°С и фильтруют через бумажный фильтр, а затем через ультрафильтры с диаметром пор 0.23 микрона для полного удаления остатков частиц биомассы перед стадией концентрирования. Концентрирование ведут ультрафильтрацией на проточной концентрационной ячейке с фильтром, удерживающим 30 кДа в течение 6 часов. Конечный объем составляет 0.5 л. Далее к раствору фермента добавляют 200 г сульфата аммония (35% от насыщения), выдерживают 3 часа при 4°С, отделяют выпавший осадок центрифугированием при 9000g, а супернатант наносят на колонку с фенилсефарозой, промывают 1 л буферного раствора, содержащего сульфат аммония, и снимают фермент градиентом сульфата аммония (35-0%) с одновременным повышением рН до 8.0. Собирают фракции с величиной параметра RZ>1,5; объем фракции составляет 100 мл.

Фермент дополнительно очищают гель-фильтрацией на 2 л колонке с Toyopearl HW55F, уравновешенной 0.1 М К-фосфатным буфером, рН 7.8, в присутствии 5 мкМ гемина и 5 мМ хлорида кальция. Собирают фракции основного пика (хвостовые фракции могут быть использованы для получения препаратов кислой изоформы пероксидазы хрена) с величиной параметра RZ>2,7; объем фракций составляет 150 мл. Фракции подвергают диализу против 2 л 5 мМ раствора того же буфера, сменяя буферный раствор 4 раза, и лиофильно высушивают. Высушенная пероксидаза имеет вид аморфной массы ярко-коричневого цвета, легко растворяется в водных буферных растворах. Выход фермента составляет 500 мг. Степень чистоты полученного фермента контролируют спектрофотометрически по показателю RZ (отношению величин поглощения на длинах волн 403 и 278 нм), величина которого должна быть не менее 2,7. Ферментативную активность пероксидазы определяют по индикаторной реакции с АБТС. Препарат считают кондиционным, если в 1 мг содержится не менее 1000 единиц активности. Массовую долю влаги определяют по ГОСТ 24061-89.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализации разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.

Таблица Выделение и очистка пероксидазы хрена Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная актив., Е/мг Выход по акт., % Фактор очистки RZ Экстракция 18000 1010000 56 - - 0,1 Ультрафильтрация 6000 1010000 168 100 1 0,3 Гидрофобная хроматография 1100 1000000 910 99 5,4 1,6 Гель-фильтрация 510 994500 1950 98 11,6 2,9 Диализ и лиофилизация 500 975000 1950 96 11,6 2,9

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализация разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей. Измельченную биомассу корней хрена выдерживают в 0.1 М буферном растворе фосфата натрия рН 7.0, предварительно продутом азотом, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция. Экстракт отделяют декантацией с последующей фильтрацией и концентрированием ультрафильтрацией через ультрафильтры с размером пор менее 30 кДа. Экстракт фермента насыщают сульфатом аммония до 35% от насыщения и наносят на колонку с фенилсефарозой, после интенсивного промывания буфера с сульфатом активные фракции снимают градиентом сульфата аммония (35%-0%) и увеличением рН до 8.0. Фермент очищают гель-фильтрацией на Toyopearl HW55F, подвергают диализу и высушивают лиофилизацией. Использование геминсодержащих буферов на стадии экстракции и гель-фильтрации позволяет получать высокоактивный фермент с высоким выходом за счет 100% насыщения фермента гемином. Это позволяет ускорить процесс производства фермента и существенно улучшить его каталитические характеристики и стабильность. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корней хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с последующим концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что между стадиями ультрафильтрации и гельфильтрации фермент очищают гидрофобной хроматографией, причем экстрагирующий буфер предварительно насыщают азотом путем продувки и вносят гемин и хлорид кальция.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония 35% от насыщения.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.