СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы из корней хрена для диагностических целей.

Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена (1, 2, 3).

Известен способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором, (фракционирование экстракта сульфатом аммония, гельфильтрацией, спиртовым осаждением, электрофорезом, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через сефадекс G 50 и ДЕАЕ - целлюлозу и диализом [1].

Основными недостатками данного способа являются невысокая чистота и активность полученного препарата, а также сложность и продолжительность процесса его получения. Кроме того, данный способ не предполагает безотходного производства.

Известен также способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гельфильтрацию [2].

Недостаток данного способа заключается в недостаточно высоком выходе фермента. Данный способ также не предполагает безотходного производства.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию фермента водой, осаждение экстракта сульфатом аммония, очистку и концентрирование фермента ультрафильтрацией и гель - фильтрацией и последующую лиофилизацию [3].

Недостатки данного способа:
1) экстракция фермента из пророщенного хрена не допускает его использование в качестве пищевого продукта;
2) длительность процесса.

В задачу создания изобретения входила разработка способа получения пероксидазы, обеспечивающего безотходное производство, когда процесс экстракции пероксидазы не препятствует дальнейшему использованию корней хрена в качестве пищевого продукта.

Технический результат от использования изобретения заключается в снижении расхода корней хрена и повышении выхода пероксидазы с высокой степенью чистоты и активности, а также в ускорении способа.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ получения пероксидазы;
2) гомогенизация растительной ткани;
3) использование в качестве растительной ткани отходов, полученных при зачистке корней хрена при изготовлении пищевой продукции;
4) экстракция фермента;
5) использование 0,15-0,25% водного раствора пищевой аскорбиновой кислоты в качестве экстрактирующего раствора;
6) экстракцию фермента ведут в течение 1 часа;
7) осветление экстракта на проточной центрифуге;
8) добавление в экстракт 4,8-5,2% сульфита натрия:
9) концентрирование экстракта ультрафильтрацией;
10) осаждение фермента сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
11) ресуспендирование осадка в дистиллированной воде;
12) осветление раствора центрифугированием на проточной центрифуге;
13) очистка фермента на сефадексе G 25;
14) сбор фракций с величиной параметра RZ > 0,1;
15) повторное осаждение фермента сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
16) отделение осадка центрифугированием;
17) ресуспендирование осадка в бидистиллированной воде;
18) очистка фермента гельфильтрацией на сефадексе G 50;
19) отбор фракций с величиной параметра RZ > 0,5;
20) очистка фермента ионообменной хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе в ацетатном буфере;
21) сбор фракций с величиной параметра RZ > 2,7;
22) лиофилизация фермента.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ получения пероксидазы;
2) гомогенизация растительной ткани;
3) в качестве растительной ткани используют отходы, полученные при зачистке корней хрена, при изготовлении пищевой продукции;
4) экстракция фермента;
5) концентрирование экстракта ультрафильтрацией;
6) осаждение фермента сульфатом аммония;
7) очистка фермента гель-фильтрацией;
8) дополнительная очистка (фермента ионообменной хроматографией;
9) лиофилизация фермента.

Достижение технического результата при использовании предлагаемого способа объясняется следующим образом.

Авторами изобретения установлено, что наибольшее количество пероксидазы содержится в поверхностном слое корней хрена, составляющем 1/3 часть массы корнеплодов. При изготовлении пищевой продукции указанная часть корней зачищается и уходит в отходы, что составляет от 10 до 30% потерь (8). Результаты исследований по изучению активности пероксидазы в экстрактах из различных равных по массе участков корней хрена представлены в таблице.

Авторами изобретения предложено впервые использовать указанные отходы для изготовления пероксидазы, что позволило снизить расход корней хрена и повысить выход пероксидазы на единицу массы корней при высокой степени ее чистоты и активности. При этом производство пероксидазы становится безотходным.

Ускорение процесса получения пероксидазы достигается за счет непосредственного извлечения фермента из поверхностного слоя корней, минуя процесс их прорастания, а также за счет того, что после экстракции фермента и осветления экстракта осуществляют его концентрирование ультрафильтрацией и последующие операции выполняют с объемом, уменьшенным, примерно, в 10 раз. При этом достигается экономия сульфата аммония.

Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) экстракцию фермента производят в 0,15-0,25% водном растворе пищевой аскорбиновой кислоты в течение 1 часа;
2) перед ультрафильтрацией в экстракт добавляют 4,8-5,2% сульфита натрия:
3) после ультрафильтрации фермент осаждают сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
4) очистку фермента производят на сефадексе G 25 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,1;
5) после очистки производят повторное осаждение фермента сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
6) повторную очистку фермента производят на сефадексе G 50 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,5;
7) дополнительная очистка фермента на карбоксиметилцеллюлозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 2,7.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ получения пероксидазы;
2) гомогенизация растительной ткани;
3) экстракция фермента;
4) осаждение экстракта;
5) очистка и концентрирование экстракта гельфильтрацией и ультрафильтрацией;
6) лиофилизация фермента.

По сравнению с прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) использование отходов, полученных при зачистке корней хрена при изготовлении пищевой продукции, в качестве растительной ткани;
2) после экстракции производят концентрирование фермента ультрафильтрацией;
3) после гельфильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, включенными в дополнительные пункты формулы изобретения:
1) экстрацию фермента производят в 0,15-0,25% водном растворе пищевой аскорбиновой кислоты в течение 1 часа;
2) перед ультрафильтрацией в экстракт добавляют 4,8-5,2% сульфита натрия;
3) после ультрафильтрации фермент осаждают сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
4) очистку фермента производят на сефадексе G 25 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,1;
5) после очистки производят повторное осаждение фермента сульфатом аммония, который добавляют до 85-90% от полного насыщения;
6) повторную очистку фермента производят на сефадексе G 50 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,5;
7) дополнительную очистку фермента производят на карбоксиметилцеллюлозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 2,7.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата, изложенных в п. 19.5.3. Правил составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Пример.

300 кг промытых водой корней хрена зачищают на 1/3 часть массы в присутствии 200 л 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, используемого в качестве экстрагирующего раствора. Из очищенных корней готовят пищевые продукты, а очистки, выдерживают в течение 1 часа в экстрагирующем растворе для экстракции фермента пероксидазы. Из экстракта удаляют жмых. После этого экстракт осветляют на проточной центрифуге и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 часов для созревания фермента. Для создания оптимальных условий по сохранению фермента и увеличению скорости обезвоживания в экстракт добавляют 5% сульфита натрия, что в количественном отношении составляет 10 кг. После этого проводят первичное концентрирование экстракта на ультрафильтрационных волоконных аппаратах, собранных в блок из 4 параллельно соединенных колонок с фильтрами с размером пор менее 40 кДа. Обезвоживание проводят до тех пор, пока объем экстракта не сократится в 10 раз, т.е. пока не составит 20 л. Продолжительность этой операции составляет 3 часа. К. полученному концентрату при постоянном перемешивании добавляют 12 кг сульфата аммония, т. е. до 85-90% от полного насыщения. Смешивание проводят в течение 30 мин до полного растворения сульфата аммония, после чего выпавший осадок, содержащий пероксидазу, отделяют на проточной центрифуге. Дальнейшую очистку пероксидазы проводят на колонке для гельфильтрации, заполненной сефадексом G 25 и уравновешенной бидистиллированной водой. Полученный осадок растворяют в 5-кратном по объему количестве бидистиллированной воды, осветляют центрифугированием при 4000 G в течение 1 часа и наносят на колонку. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной показателя RZ > 0,1. Объем этих фракций составляет 16 л. К собранным фракциям добавляют 11,2 кг сульфата аммония, т.е. до 85-90% от полного насыщения, перемешивают до полного растворения и осаждают пероксидазу центрифугированием при 4000 G в течение 1 часа. Осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненной сефадексом G 50 и уравновешенной бидистиллированной водой. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной показателя RZ > 0,5. С помощью 50% уксусной кислоты значение pH во фракциях с пероксидазой устанавливают на уровне 4,4. Их объем составляет 3,2 л. Полученный фермент подвергают дополнительной очистке ионообменной хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе. Для этого на хроматографическую колонку, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную 5 мМ ацетатного буфера с pH 4,4, наносят фракции пероксидазы. Фермент элюируют в линейном градиенте, создаваемом 500 мл 5 мМ и 500 мл 0,15 М ацетатного буфера, в течение 1 часа. Собирают фракции с величиной параметра RZ > 2,7 в объеме 160 мл и с концентрацией фермента 10 мг/мл. В концентрате устанавливают pH 5,0 добавлением аммиака и его лиофильно высушивают. Высушенная пероксидаза имеет вид аморфной массы темнокоричневого цвета и виде таблетки. При помещении таблетки пероксидазы в дистиллированную воду последняя растворяется в течение 1 мин, не расслаиваясь. Степень чистоты полученного фермента контролируют спектрофотометрически по показателю RZ (отношению величин поглощения на длинах волн 403 и 278 нм), величина которого должна быть не менее 2,7. Ферментативную активность пероксидазы определяют по цветной реакции с ортофенилендиамином. Препарат считают кондиционным, если в 1 мг содержится не менее 100.000 условных единиц. Массовую долю влаги определяют по ГОСТ 24061-89.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий:
- способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области биохимии для получения пероксидазы хрена, применяемой для получения коньюгатов с антителами;
- для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- изобретение при его осуществлении способно обеспечить достижение технического результата: снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патеноспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Paul K.G. The Enzymes. New Jork, Acad. Press, 1963.

2. Пат. Венгрии N 172872, кл. C 07 G 7/022.

3. Авт. свид. Болгарии N 46675, кл. C 12 N 9/08, 15.02.90 г. (прототип).

4. Кунаева P.M. Гидролитические и окислительные ферменты обмена фенольных соединений растений. Алма-Ата, изд. "Наука", 1986, 20-28.

5. Авт. свид. СССР N 1108102, кл. C 12 N 9/08, 27.08.82 г.

6. Патент Венгрии N 105727, кл. C 07 G 7/22, 1976 г.

7. Патент Венгрии N 206517, кл. C 12 N 9/08, 09.03.90 г.

8. ТУ 9169-077-04782324-96.

Способ может быть использован в биохимии для получения пероксидазы. Очистки, полученные в результате обработки корней хрена при производстве пищевой продукции, выдерживают в 0,15 - 0,25%-ном растворе аскорбиновой кислоты. Полученный экстракт осветляют и фильтруют через ультрафильтры с размером пор менее 40 кДа до 1/10 части первоначального объема. Фермент осаждают сульфатом аммония очищают последовательно гельфильтрацией на сефадексах G25 и G50 и ионно-обменной хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе. Фермент сушат методом сублимации. Использование отходов снижает расход корней хрена и повышает выход пероксидазы с высокой степенью чистоты и активности. Предложенный способ позволяет ускорить процесс производства фермента. 8 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с проведением осаждения фермента сульфатом аммония, очистку фермента концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве растительной ткани хрена используют отходы от зачистки корней при производстве пищевой продукции, перед ультрафильтрацией в экстракт вносят сульфит натрия в эффективном количестве, осаждают фермент сульфатом аммония из ультрафильтрата, а после гельфильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию фермента производят в 0,15 - 0,25%-ном водном растворе аскорбиновой кислоты в течение 1 ч. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфит натрия вносят в экстракт до концентрации 4,8 - 5,2%. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку экстракта сульфитом натрия ведут в течение 24 ч. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вносят до 85 - 90 мас.% от насыщения. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на сефадексе G 25 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,1. 7. Способ по п.2, отличающийся тем, что после гельфильтрации фермент осаждают сульфатом аммония в количестве до 85 - 90 мас.% от насыщения. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что повторную гельфильтрацию осуществляют на сефадексе G 50 с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 0,5. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионообменную хромотографию проводят на карбоксиметилцеллюлозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ > 2,7.