Способ получения карбоангидразы Советский патент 1982 года по МПК A61K35/78 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОАНГИДРАЗЫ 12

Изобретение относится к технике производства очищенных ферментных препаратов из растений, в частности к получению карбоангидразы, и может быть использовано в научных исследованиях различных направлений биохимии, генетики, а также в медицине для физиологических исследований.

Известен способ получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфитрацией его на сефадексе. По известному способу высокооччщенную карбоангидразу получают из листьев гороха, петрушки, шпината, при этом листья соответствующих растений гомогенизируют в подходящем буфере, гомогенат центрифугируют при 20000-30000g-пoлyчeиный супернатант принимают за исходный экстракт и подвергают фракционному осаждению сульфатом аммония, диализу, затем последовательной хроматографии на ДЕАЕ - целлюлозе, ДЕАЕ-сефадексе, гель-фильтрации на биогеле иЛи агарозе или сефадексе . ультрафильтрации. Причем-метод ультрафильтрации применяется также между отдельйыми этапами очистки с целью концентрирования ферментного раствора Ul.

Недостатками известного способа являются длительность и многостадий ность процессов, применение дорогостоящих редких импортных реактивов Сбиогелей, ДЕАЕ-сефадексов, ультрафильтров К Выход карбоангидразы не10высок и составляет 1-20% по активности и 1% по белку.

Целью изобретения является расши-. рение сырьевой базы и повышение выхода целевого продукта. ,

15

Указанная цель достигается тем, что в способе получения карбоангидразы путем экстрагирования нащземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом

20 аммония и гельфильтрацией его на сефадексе в качестве источника сырья используют листья бобов сорта Черные русские, экстракцию проводят в трисульфатном буфере и после гель25фильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 МЙ сульфата натрия в 0,01 М-триссульфатном буфере, далее полученный ферментный раствор концентрируют

30 сульфатом аммония. Способ осуществляют следующим образом. В качестве исходного сырья используют листья бобов сорта Черные русские. Растения выращивают в деревянных ящиках с почвой. 300 г свежеотобранных листьев (28 дневных) фиксируют жидким азото и растирают в фарфоровой стУпке с 300 мл 0,1 М трис5 ульфатного буфера (рН 8,0), содержащего 0,1 М.меркаптоэтанола и 0,001 М этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА)-буфер Растертую массу фильтруют через двойной слой капрона, фильтрат цент рифугируют при 22000 g 30 мин. Надо садочную жидкость, содержащую 1400 белка, принимают за исходный экстракт. В экстракт добавляют твердый сул фат аммония до концентрации 40% насыщения. Осадок белков, полученный при этомнасыщении, отделяют центри фугированием при lOOOOg 20 мин и отбрасывают. К супернатангу добавляют сульфат аммония до 55% насыщения. Осадок собирают центрифугирова нием (10000g.20 мин) и растворяют в 20 мл буфера А. Полученную фракцию, содержаадую 500 мг белка, наносят на стеклянну хроматографическуто колонку (размере 3x100 см ) с сефалексом Г-200, уравн вешенную 0,01 М трис-сульфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,05 М Э-меркаптоэтанола - буфер После выхода 200 мл пустого объема сбор фракций по 10 мл осуществляпот на коллекторе фракций со скоростью 1 мл-мин. Во фракциях промеряют белок по поглощению при 280 им и акгтивность карбоангидразы колориметрическим методом по Вилбур и Андерсон в модификации Рикли. Наиболее активные фракции с объемгиш выхода от 280 мл до.360 мл объединяют, полученный объем составляет 80 мл и содержит 250 мг белка. Этот ферментный раствор наслаивают на колонку (размером см) с .ДЕАЕ-целлголоэой (номинальная емкость 0,60-0,80 мэкв/г, фак1 ;) набухаемости 9,0 мл/г сухого .ита, фирма Реанал Венгрия), ypaaiu, вешенную буфером Б, содерх ащим 20 мМ сульфата натрия, и неадсорбировавшийся белок вымывают тем же буфером (около 500 мл), получая фракцию 1. Затем целлюлозу промывают 300-500 мл раствора 40 мМ сульфата натрия в буфере Б, получая фракцию II. Прдмлвание в обоих случаях проводят до полного исчезновения поглощения белка в злюате при 280 им, указанных буферных объемов достаточно для достижения этого результата. Затем активную по карбоангидрйзе фракцию получают промыванием ДЕАЕ-целлюлозы раствором 60 мМ сульфата натрия в буфере Б, при этом сбор фракций по 1,0 мл осуществляют на коллекторе фракций со скоростью 10 МП/мин. Во фракциях промеряют булок по поглощению при 280 нм и активность карбоангидразы. Наиболее активные фракции -с объемами выхода от 60 до 180 мл объединяют. Объем полученных фракций составляет 120 МП и содержит 112 мг белка. Полученный ферментный раствор концентрируют сульфатом аммония при 70% насыщения, центрифугируют при 22000g 20 мин и хранят в виде осгшка под сульфатом аммония при . Активность карбоангидразы сохранялась в течение б месяцев. Полученный препарат гомогенен, при исследовании в аналитической центрифуге Spinco модель Е (США) получается единственный пик с коэффициентом седиментации 15,8 (скорость врсццення ротора 48660 об/мин, интервал съемки 8 мин, концентрация белка 3,5 мг/мл) при анёшитическом диск-электрофорезе в 7,5% полиакриламидном геле получается одна полоса. Результаты очистки и выделения карбоангвдразы из листьев бобов .приведены в таблице, где для сравнения приведены также результаты очистки карбоангидразы из листьев гороха по известно способу.

Известный Получение экстракта из листьев гороха 603,1 24 Фракционированиесульфатом аммония

Гель-фильтра- 169,9 ция на сефадексе Г-200

Препаративный диск-электрофорез в полиакрил амидн ом геле

Результаты таблицы показывают, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность гомогенной карбоангидразы в 12 раз и выход (в процентах от общего растворимого белка листьев) в 20 раз.

Таким образом, использование предлаг аемого способа получения ферменТа карбоангидразы из растений упрощает технологию получения -целевого продукта и ускоряет процесс выделения фермента в Л раза за счет применения ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе вместо препаративного электрофореза, позволяет . получить высокоочищенный фермент за счет подбора оптимгшьных условий проведения всех стадий выделения и очистки карбрангидразы, повысить выход и активность гомогенной карбоангидразы стабильной при хранении в 20 раз за счет использования в качестве источника сырья листьев бобов сорта Черные русские с высоким содержанием фермента (8% от растворимого белка листьев )i

Отпадает необходимость в покупке препарата карбоангидразы зарубежных (1мрм.

Продолженя - таалнш,

46,2

2,7

50,2

0,16

200,1

2,1 1847,7

Отечественный препарат карбоангидразы может найти широкое применение в научных исследованиях по установлению физиологической роли карбоангидразы в растениях и фотосинтезирующих организмах, а также может полностью заменить препарат животной карбоангидразы/ выпускаемой зарубежныМИ фирмами и применяемый в медицине , в физиологических исследованиях.

изобретения

Способ получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфильтрацией его на сефадексе,

о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют истья бобов сорта Чэрные русские,

экстракцию проводят в трис-сульфатиом буфере и после гельфильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 мМ сульфата натрия в 0,01 М-триссульфатном буфере, далее полученный фер 955930В

ментный раствор концентрируют суль- 1. Atkins С.А. Patterson B.I).

фатом аммония.Graham D. Plant carbonic anhydrases

,,II. Preparation and Some properties

Источники информации,of dicolydon enzyme types. Plant

принятые BO внимание при экспе тизе.Physiol 1972, 50, 2, p.p. 218-223.