СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОСОБНОСТИ К ПЕРСИСТЕНЦИИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS Российский патент 2013 года по МПК C12N1/02 G01N33/569 C12R1/445 

Изобретение относится к области медицины, а именно урологии, и может быть использовано, в частности, для определения роли микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний урогенитальной сферы.

Под персистенцией (от лат. persistere - оставаться, упорствовать) понимают длительное переживание возбудителя в организме хозяина. Способность персистировать обусловлена состоянием их индифферентности к воздействующим внешним факторам физико-химической или биологической природы, обеспечением стабильных антагонистических эффектов в биоценозе и сохранением жизнеспособности популяции за счет приобретения ею устойчивости к защитным механизмам хозяина. Только при соблюдении этих основных условий бактериальная клетка имеет шанс на выживание, на персистирование (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). - Екатеринбург: УрО РАН, 1996, с.64-65). Переход бактерий из одной среды существования в другую (внешняя среда - клетка хозяина), вынужденный ход микроорганизмов, позволяющий, в конечном счете, обеспечить их существование как вида. Поэтому персистирование бактерий в организме следует рассматривать как стратегию выживания вида. Если учесть, что любая стратегия порождает разнообразие тактики, то смена экологической ниши бактериальной клеткой и ее переход в организм хозяина будет сопровождаться неизменным появлением у бактерий новых биологических характеристик, облегчающих адаптацию патогена к новым условиям среды обитания.

Наиболее близким к предлагаемому нами способу является способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов, постановка которого занимает в среднем 48 ч. Обнаружение этого свойства у Staphylococcus aureus и установление выраженности этого признака у других видов свыше 6 мкг/мл позволяет определить микроорганизм - носитель данного свойства к категории резидентных микроорганизмов, то есть по определению, обладающих персистентным потенциалом (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Немцева Н.В. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии №2, 1984, с.27-28).

Данный способ имеет следующие недостатки:

Способ требует для количественного определении антилизоцимной активности использования тест-культуры Micrococcus lysodeictius и как следствие, дополнительных манипуляций и реактивов для ее подготовки.

Способ основан на методе отсроченного антагонизма и поэтому увеличивает время анализа на дополнительные 24 ч для предварительного выращивания исследуемой культуры.

Целью представленного изобретения является увеличение чувствительности, точности, сокращение времени, необходимого для установления способности к персистенции выделенного штамма.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в качестве маркеров используют обнаружение в жидкой культуре микроорганизмов веществ, иммунологически сходным с лептином и растворимым рецептором лептина.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в том, что определение наличия способности у микроорганизмов к синтезу веществ, иммунологически сходных с лептином и растворимым рецептором лептина, повышает достоверность определения способности выделенного микроорганизма к персистенции. Определение указанных веществ проводится методом иммуноферментного анализа (ИФА), время которого составляет около 4 часов, что на 44 часа быстрее, чем прототип. Кроме того, ИФА делает предлагаемую методику более чувствительной, чем достигается более высокая точность и воспроизводимость результатов.

Предложенный способ был успешно апробирован на 80 образцах в практической работе кафедры молекулярной биологии, генетики и биохимии Астраханского государственного университета в течение 2011 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1

Определяли способность к синтезу веществ, иммунологически сходных с лептином и растворимым рецептором лептина у Staphylococcus aureus, выделенных из спермы пациента И-а с хроническим простатитом.

Культуру стафилококка засевали в 0,9% раствор хлорида натрия в концентрации 10³ КОЕ/мл и инкубировали в течение 37°С в течение 24 ч.

Суточную культуру вносили в лунки наборов для проведения иммуноферментного анализа для определения лептина, а также для определения растворимого рецептора лептина. Далее проводили иммуноферментный анализ и оценку результатов стандартным способом в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам.

В этом варианте результаты по определению к синтезу веществ, иммунологически сходных с лептином и растворимым рецептором лептина, отрицательные исходя из чего делается вывод об отсутствии персистентного потенциала у данного штамма Staphylococcus aureus (Таблица 1).

Пример №2

Определяли способность к синтезу веществ, иммунологически сходных с лептином и растворимым рецептором к лептину у Staphylococcus aureus, выделенных из носоглотки пациента Т-го с хроническим тонзиллитом.

Исследования проводили способом, описанным в примере №1.

В этом примере результаты по определению вещества, иммунологически сходного с лептином, составили 1,01 нг/мл, а сходного с растворимым рецептором лептина составили 1,9 нг/мл, исходя из чего делается вывод о наличии персистентного потенциала у данного штамма Staphylococcus aureus (Таблица 1).

Пример №3

Определяли способность к синтезу веществ, иммунологически сходных с лептином и растворимым рецептором лептина у Staphylococcus aureus, выделенных из спермы пациента П-ва с хроническим простатитом.

Исследования проводили способом, описанным в примере №1. В этом примере результаты по определению вещества, иммунологически сходного с лептином, составили 1,0 нг/мл, а с иммунологически сходным с растворимым рецептором лептина составили 1,877 нг/мл, исходя из чего делается вывод о наличии персистентного потенциала у данного штамма Staphylococcus aureus (Таблица 1).

Предлагаемым способом достигается положительный эффект:

Повышается эффективность определения способности к персистенции микроорганизмов за счет использования в качестве маркера обнаружение в жидкой культуре микроорганизмов вещества, иммунологически сходного с лептином и растворимым рецептором лептина, повышается чувствительность, точность проведения анализа, сокращается число стадий по сравнению с прототипом и, как следствие этого, сокращается время, необходимое для выдачи заключения лаборатории на 44 часа.

Проведение этого исследования расширит возможности установления этиологии инфекционного процесса различной локализации.

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической медицине для определения способности к персистенции микроорганизмов.

Таблица 1 Воспроизводимость результатов определения способности к перистенции Staphylococcus aureus. Пример Концентрация вещества, иммунологически сходного с лептином (нг/мл) Концентрация вещества, иммунологически сходного с растворимым рецептором лептина (нг/мл) Способность к перистенции 1 0 0 Не персистентный 2 1,01 1,9 Персистентный 3 1,0 1,877 Персистентный

Изобретение относится к урологии и может быть использовано, в частности, для определения роли микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний урогенитальной сферы. Изобретение раскрывает способ определения способности к персистенции Staphylococcus aureus, путем определения биологических свойств, в частности, способности синтезировать иммунологически сходные с лептином и/или растворимым рецептором лептина веществ в суточной жидкой культуре стафилококков. При наличии синтеза указанных веществ определяют способность стафилококка к персистенции. Использование способа по изобретению позволяет повысить чувствительность, точность определения и ускорить определение. 1 табл., 3 пр.

Способ определения способности к персистенции Staphylococcus aureus, включающий определение его биологических свойств, отличающийся тем, что в суточной жидкой культуре микроорганизмов определяют с помощью ИФА синтез иммунологически сходных с лептином и/или растворимым рецептором лептина веществ, по наличию которых определяют способность исследуемой культуры Staphylococcus aureus к персистенции.