ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА КРАСНУХИ "ОРЛОВ-Д" И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРАСНУХИ Российский патент 2001 года по МПК C12N7/00 A61K39/20 

Изобретения относятся к области медицинской биотехнологии и могут быть использованы при получении вакцины против краснухи.

Известны вакцинные штаммы вируса краснухи HPV-77, HPV-77DE5, HPV77DK-12, Cendehill, MEQ-11, RA27/3 и др. (см. например, Best J.M- Epidemiol. Infect., 1991, 107, 17-30; GalazkaA. Epidemiol. Infect., 1991, 107, 43-54; Herrmann К.L. Epidemiol. Infect. 1971, 107, 55-61).

Однако вакцины из штаммов HPV высоко реактогенны для людей, о чем сообщается в литературе (Thomson C.R., Weiss J.J., Shillis J.L. et al.Am. J. Dis. Child. , 1973, 125, 526- 530). Штамм Cendehill потенциально опасен в отношении контаминации онкогенными вирусами, так как получен с использованием клеточных культур приматов. Вакцины из штамма RA27/3 вызывают 40% артралгий у взрослых (Best J.V., Banatlava J. E. Principles and practice of clinical Virology, 1990, 337-374).

Известен также вакцинный штамм вируса краснухи "Орлов" Мешалова В.Н. Опыт получения и аттенуации краснушного вакцинного штамма "Орлов". В кн.: "Респираторные вирусные инфекции". Труды ЛНИИЭМ им. Пастера, Л., 1973, 137-143). Однако данный штамм, как и штамм MEQ II, обладает низкой иммуногенностью. Остальные штаммы недостаточно изучены в отношении целевого назначения.

Наиболее близким к заявляемому является вакцинный штамм вируса краснухи "Орлов-В" (Патент РФ N 2081912, приоритет 22 мая 1995). Штамм "Орлов-В" получен путем многократного пассирования в первичной культуре клеток почки кролика с последующим клонированием методом предельных разведений и селекцией по признаку утраты репродукционной активности при температуре 40^oC. Культурально-морфологические, физико-биологические признаки, антигенные, иммуногенные и вирулентные свойства штамма раскрыты в описании изобретения к патенту.

Однако штамм "Орлов-В" не адаптирован к полуперевиваемым диплоидным культурам клеток человека, рекомендованным экспертами Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) для производства медицинских иммунобиологических препаратов.

Известен способ получения вакцины против краснухи, предусматривающий заражение вирусом краснухи линии диплоидных клеток человека Wistar-38 с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде (см. Plotkin S. A. , Farquar J.Katz М., Ingals T.H- - Amtr. J.Epidem.,1967 86, 468-477). Однако указанный способ основан на использовании штамма RA27/3, выделенного и аттенуированного в США, то есть не являющегося эпидемически актуальным для территории Российской Федерации. Урожай вируса краснухи при этом не превышал 4,5 1g ТЦПД₅₀/0,5 мл. Кроме того, создание в России генофонда перспективных зарубежных клеточных линий, способных обеспечить коммерческое производство, практически невозможно. Нет также и отечественных клеточных линий, рекомендованных в качестве субстратов для получения культуральных краснушных вакцин и диагностических препаратов.

Наиболее близкой по сущности к заявляемой технологии является способ получения вируса краснухи, предусматривающий заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде (Патент РФ N 2129608, приоритет от 06.06.96). В качестве диплоидной клеточной культуры используются фибробласты легкого эмбриона человека - ФЛЭЧ 385/13, а в качестве вируса краснухи - штамм "Орлов-В".

Однако данная диплоидная линия клеток не обеспечивает длительного получения высокоактивного вирусного материала (полуфабриката вакцины против краснухи). Кроме того, она не разрешена к применению для производства вакцины против краснухи, т. к. авторы линии не имеют производственного банка клеток, а также не располагают исчерпывающей аттестацией линии в соответствии с требованиями ВОЗ.

Изобретения направлены на получение штамма для производства вакцины против краснухи, адаптированного к диплоидной клеточной культуре М-22, а также на разработку способа получения противокраснушной вакцины, при котором обеспечивается повышение выхода вирусной биомассы и степени чистоты вакцины.

Сущность изобретения сводится к следующему.

В качестве продуцента краснушной вакцины используют штамм вируса краснухи "Орлов-Д" (ГКВ N 2347 от 29.12.93), полученный в результате адаптирования штамма "Орлов-В" (ГКВ N 2326 от 04.04.95) к диплоидной клеточной культуре путем пассирования в клетках кожно-мышечных фрагментов эмбриона человека М-22(РКК N 2-3-2 от 16.12.84).

Штамм "Орлов-Д" характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. При электронном микроскопировании популяция представляет однородные сферические частицы с диаметром 50-70 нм. Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,18-1,20 г/см³. Размножается с развитием цитодеструктивного действия до инфекционного титра 4-6 1g ТЦД₅₀/0,5 мл в клеточных культурах животных и человека: ППК, перевиваемых культурах клеток гипернефромы, SIRK, HAKRK-I. RK-13, ВНК-21 (до 7-8 1g ТЦД₅₀/0,5 мл при роллерном способе культивирования). Штамм адаптирован к диплоидным клеткам почки легкого и кожно-мышечных фрагментов эмбриона человека, инфекционные титры вируса при культивировании в статических и роллерных условиях составляют 4-5 1g ТЦД₅₀/0,5 мл и 5-7 1g ТЦД₅₀/0,5 мл соответственно. Слабо размножается в первичных тканевых культурах куриных и перепелиных фибробластов. Не размножается при температуре ниже 20^oC и выше 40^oC. Оптимальная температура культивирования в клеточных культурах - +35^oC.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная pH=7,4+0,6. Инактивируется в течение 30 мин при 56^oC. Чувствителен к действию эфира и ацетона.

Антигенные свойства. Гемагглютинирующая активность in vitro 8-32 ГАЕ. Агглютинирует эритроциты голубей, 1-дневных цыплят, гусей, человека с группой крови 0.

Иммуногенные свойства. Штамм "Орлов-Д" характеризуется высокой иммуногенностью для лабораторных животных. Специфические антитела при контроле на кроликах и морских свинках образуются в 100% случаев и характеризуются обратным титром антител в РТА от 640 до 5120 и от 1280 до 15840 соответственно (см. табл.1).

Вирулентные свойства. Штамм не обладает вирулентными и контагиозными свойствами.

Токсичность. Штамм не токсичен при введении мышам в дозе 1000 ТЦД₅₀/0,5 мл (1 прививочная доза человека).

Способ получения вакцины против краснухи предусматривает заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде. В качестве диплоидной клеточной культуры используют клетки кожно-мышечных фрагментов эмбриона человека М-22 (патент РФ N 1317021, приоритет 23.04.85).

Очевидно преимущество использования диплоидной клеточной культуры М-22 для совершенствования технологии производства вакцины по сравнению с первично-трипсинизированными клеточными культурами вследствие простоты и экономичности первых из них, возможности всесторонней аттестованности в соответствии с требованиями ВОЗ в отношении онкогенной безопасности, отсутствия посторонних контаминантов и стабильности биологических свойств клеточной линии. Кроме того, в случае использования первично-трипсинизированной клеточной культуры ППК конечный продукт загрязняется балластными белками, образующимися на стадии ферментолиза почечной ткани и достаточно прочно адсорбирующимися на поверхности культуральных флаконов.

Преимущество использования для приготовления вакцины клеток кожно-мышечных фрагментов эмбриона человека заключается также в их тканевом родстве с вакцинируемым и позволяет повысить иммуногенные свойства штамма.

Спектр чувствительности диплоидных клеточных культур к вирусу краснухи чрезвычайно разнообразен и может меняться в зависимости от используемого штамма вируса. Исследования, выполненные авторами, показали, что используемая ими в качестве субстрата для репродукции вируса краснухи диплоидная клеточная культура М-22 является оптимальной из целого ряда исследованных клеточных культур, таких как почка эмбриона человека, фибробласты легкого эмбриона человека, а также первично-трипсинизированная почка новорожденного кролика. Инфицирование этой клеточной культуры вызывает длительную хроническую инфекцию без деструкции клеточного пласта, что в свою очередь обеспечивает получение более чистого целевого продукта, не отягощенного белковыми компонентами, способными вызывать аллергические реакции у вакцинируемых.

Установленная в пределах 0,01-0,1 ТЦД₅₀/клетку заражающая доза вируса краснухи заявлена в качестве отличительного признака, поскольку:
- позволяет увеличить в 4-5 раз (по объему) количество собираемого вируса, т. к. при такой заражающей дозе продлевается время нормального функционирования клеток и осуществляется длительная продукция вируса в культуральную жидкость, что позволяет более продолжительное время получать полезные вирусные сборы (вируссодержащую культуральную жидкость с инфекционной активностью не менее 4 1g ТЦД₅₀/0,5 мл) - табл.2,
- дает возможность получать вируссодержащую культуральную жидкость, содержащую минимальные количества примесного белка, вследствие длительной продукции вируса без существенной деструкции клеточного монослоя (табл.3).

Таким образом, за счет использования системы "диплоидные клетки М-22 - штамм "Орлов-Д", а также избирательно установленной в определенных пределах заражающей дозы, удалось повысить выход и степень чистоты конечного продукта. Способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Культивирование вируса краснухи в статических условиях.

Матрасы объемом 250 мл с клеточной культурой М-22 трижды отмывают от сыворотки фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 5 мл поддерживающей питательной среды, содержащей расчетное количество посевного вируса (множественность инфицирования для штамма "Орлов-Д" составляет 0,01 ТЦД₅₀/клетку), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 часов при комнатной температуре, после чего добавляют по 35 мл поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 45%
среды 199 - 50%
2,5%-ного аргинина - 5%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина.

Зараженные клетки инкубируют при температуре 34-35^oC, ежедневно регистрируя состояние монослоя, развитие цитопатогенного действия вируса и делая сборы вируссодержащей культуральной жидкости, начиная с 5-го дня после заражения с интервалом в 2 дня до полной деградации клеточного монослоя. Вирусные сборы охлаждают при 4-8^oC, а затем трехкратно замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37^oC. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость после удаления клеточного детрита, соответствующих контролей на инфекционную активность, специфичность, стерильность, содержание белка и добавления стабилизатора лиофилизируют.

Содержание инфекционного вируса в конечном продукте составляет 4-6 1g ТЦД₅₀/0,5 мл. Количество общего белка - от 100 до 200 мкг/мл.

Пример 2.Культивирование вируса краснухи в роллерных условиях.

Роллерные флаконы объемом 1 или 3 литра с клеточной культурой М-22 трехкратно отмывают от сыворотки фосфатно-солевым буферным раствором, вносят по 10 или 30 мл соответственно поддерживающей питательной среды, содержащей 0,1 ТЦД₅₀/клетку посевного вируса краснухи (штамм "Орлов-Д"), проводят адсорбцию вируса в течение 1,5 - 2 часов при 37^oC, после чего добавляют по 90 или 270 мл соответственно поддерживающей питательной среды, состоящей из
среды Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот - 50%
среды 199 - 45%
2,5%-ного аргинина - 5%
и по 250 мкг/мл стрептомицина и канамицина.

Зараженные клетки инкубируют при температуре 34-35^oC на роллерной установке. По мере развития цитопатогенного действия вируса делают 4-7 сборов вируссодержащей культуральной жидкости, начиная с 5 дня после заражения с интервалом в 2 дня вплоть до тотальной деструкции монослоя клеток. Вирусные сборы трехкратно замораживают в сухом льду со спиртом и оттаивают в водяной бане при 37^oC. Вируссодержащую культуральную жидкость освобождают от клеточного детрита центрифугированием в течение 1 часа при 3000 об/мин, добавляют стабилизатор и лиофилизируют или хранят при температуре (-20)-(-40)^oC. Контроль биологической активности вируссодержащей культуральной жидкости проводят на перевиваемой культуре клеток почек кролика RK-13.

Инфекционный титр вируса составляет 5-7 1g ТЦД₅₀/0,5 мл. Содержание общего белка - от 120 до 230 мкг/мл.

Таким образом, использование диплоидной клеточной культуры М-22 и штамма "Орлов-Д" вируса краснухи позволяет по сравнению с прототипной линией клеток в 4-6 раз увеличить объем собираемой вируссодержащей культуральной жидкости, а следовательно, увеличить количество выпускаемых доз вакцины, не содержащей сколько-нибудь значительных количеств балластных примесных компонентов, присутствие которых является крайне нежелательным при производстве вакцины против краснухи.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при получении вакцины против краснухи. Изобретение направлено на получение штамма для производства вакцины против краснухи, адаптированного к диплоидной клеточной культуре М-22, а также на разработку способа получения противокраснушной вакцины, при котором обеспечивается повышение выхода вирусной биомассы и степени чистоты вакцины. В качестве продуцента краснушной вакцины используют штамм вируса краснухи "Орлов-Д" (ГКВ 2347 от 29.12.98), полученный в результате адаптирования штамма "Орлов-В" (ГКВ 2326 от 04.04.95) к диплоидной клеточной культуре путем пассирования в клетках кожно-мышечных фрагментов эмбриона человека М-22 (РКК 2-3-2 от 16.12.84). За счет использования системы "диплоидные клетки М-22 - штамм "Орлов-Д", а также избирательно установленной в определенных пределах заражающей дозы удалось повысить выход и степень чистоты конечного продукта. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Штамм вируса краснухи ГКВ 2347 для получения вакцины. 2. Способ получения вакцины против краснухи, предусматривающий заражение диплоидной клеточной культуры вирусом краснухи с последующим культивированием вируса в поддерживающей питательной среде, сбором вируссодержащей жидкости и определением ее антигенной активности, отличающийся тем, что в качестве диплоидной клеточной культуры используют кожно-мышечные фрагменты эмбриона человека М-22, а вируса краснухи - штамм "Орлов-Д" по п.1 в заражающей дозе 0,01 - 0,1 ТЦД 50/клетку, культивирование вируса проводят при 33 - 35°С, а сборы вируссодержащей жидкости - через 1 - 3 дня.