СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВИРУСА КОРИ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для восстановления музейных и производственных вакцинных штаммов вируса кори.

В процессе длительного хранения музейные и производственные вакцинные штаммы вирусов кори снижают инфекционную активность (ИА). При этом увеличивается доля вирулентных частиц как наиболее устойчивых в гетерогенной вирусной популяции, а многократное пассирование вирусов в процессе производства живой коревой вакцины снижает их иммуногенность (Бойчук Л.М. Смородинцев А. А. Тарос Л.Ю. Общие закономерности аттенуации вируса кори.-"Проблема ликвидации кори", /труды ЛНИИЭМ им. Пастера/, Л. 1968, с.11-29; WHO Technical Report Series, N 771, 1988, 93-121). Поэтому вакцинные штаммы вирусов кори необходимо периодически регенерировать, что и является задачей предлагаемого способа.

Единственно известный способ регенерации вакцинного штамма вируса кори заключается в заражении тканевой культуры исходным вирусом с последующим инкубированием в режиме периодического съема вируссодержащей жидкости (ВСЖ) в зависимости от состояния тканевой культуры и специфической вирусной дегенерации и объединением съемов ВСЖ в пул из расчета требуемой инфекционной активности (Производственный регламент N 196-74 вакцины коревой культуральной живой сухой, утвержденный 25 марта 1974 г. Начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР Христовым Л.Н. раздел V).

Однако известный способ не гарантирует отсутствия нейровирулентности регенерированной вирусной популяции, что важно для исключения у вакцинированных высокой реактогенности, в том числе осложнений со стороны центральной нервной системы.

Целью изобретения является исключение нейровирулентности восстановленного штампа.

Цель достигается тем, что в способе регенерации вакцинного штамма вируса кори, предусматривающим заражение тканевой культуры исходным вирусом, взвешенным в поддерживающей среде, с последующим инкубированием в режиме периодического съема ВСЖ, через 1±0,5 ч после заражения неадсорбированный вирус переносят на новую тканевую культуру, которую инкубируют при тех же условиях, далее съемы от каждой тканевой культуры объединяют.

Таким образом, в предлагаемом способе с интервалом в 1±0,5 ч запускают две технологические линии, причем тканевую культуру второй линии заражают от первой.

При достаточно высокой ИА исходного штамма возможен запуск третьей линии, в которой тканевую культуру заражают неадсорбированным вирусом, перенесенным от второй линии через 1± 0,5ч после внесения в нее вируса. Периодические съемы ВСЖ с этой линии также добавляют в общих пул.

Причинно-следственная связь внесенных изменений с достигнутым результатом заключается в следующем. Подлежащие восстановлению вакцинные штаммы генетически неоднородны: они включают вирусные частицы с различной степенью вирулентности, в том числе нейровирулентные, что известно из (Штейнберг Л.Ш. Генетическая характеристика клонов, выделенных из вируса кори штамма Л-16. Автореф. дисс. к.м.н. ГИСК им. Л.А.Тарасевича, М. 1979). Автором заявляемого способа установлено, что после заражения тканевой культуры исходным вирусом на ее клеточном монослое в первую очередь сорбируются и в дальнейшем репродуцируются наиболее вирулентные вирусные частицы, а менее вирулентные частицы в течение 0,5-1,5 ч в основном остаются взвешенными в поддерживающей среде. Именно поэтому в указанный промежуток времени неадсорбированный вирус переносят на новую тканевую культуру, запуская вторую технологическую линию, где собираются и в дальнейшем репродуцируются менее вирулентные вирусные частицы. Перенос вируса на более поздний срок неэффективен, так как в этом случае менее вирулентные вирусные частицы успеют сорбироваться на тканевой культуре первой технологической линии, где их репродукция будет ингибироваться, что приведет к повышению доли вирулентных частиц в общем пуле ВСЖ. Объединение полезных съемов (характеризуются значением ИА не менее 4 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.) от всех линий в общий пул обеспечивает гетерогенность вирусной популяции, чем достигается высокая иммуногенность и репродукционная активность восстановленного штамма при его слабой реактогенности.

Пример 1. В два литровых матраца с монослоем тканевой культуры фибробластов эмбрионов перепелов (ФЭЛ) после удаления ростовой среды вносят по 6 ампул (0,02 ТЦД₅₀/кл.) восстанавливаемого музейного вакцинного штамма вируса кори Л-16, разведенного в поддерживающей среде Игла с 5 объем. аминопептида (1-я технологическая линия).

После 1 ч контакта вируса с клетками при температуре 35^oC поддерживающую среду с неадсорбированным вирусом переносят в другие два матраца с клеточным монослоем тканевой культуры ФЭП (2-я технологическая линия).

В первые два матраца с адсорбированными на клеточном монослое за указанный промежуток времени наиболее вирулентными вирусными частицами добавляют по 120 мл поддерживающей среды Игла с 5 объем. аминопептида и инкубируют при 35^oC.

После 1 ч контакта вируса с клетками недостаточную жидкость 2-й технологической линии переносят в матрац с клеточным монослоем ФЭП )3-я технологическая линия), а в матрацы 2-й линии добавляют по 120 мл поддерживающей среды Игла с 5 объем. аминопептида и инкубируют при 35^oC.

Дальнейшее культивирование вируса всех технологических линий производят при 35^oC в течение срока сохранения тканевой культуры (19 дней). По мере нарастания цитопатогенных изменений клеточного монослоя, характерных для вируса кори (наблюдают под микроскопом), вируссодержащую жидкость сливают во флаконы и хранят под резиновой пробкой при (-20)^oC для следующего использования, а в матрацы добавляют по 120 мл свежей поддерживающей среды Игла с вышеуказанным количеством аминопептида и культивируют при тех же условиях. Такую процедуру многократно повторяют. Интервал замены среды составляет 1-3 дня в зависимости от интенсивности цитопатогенных изменений тканевой культуры. При данных условиях число полезных съемов колеблется от 3 до 5, уменьшаясь по мере очередности запуска технологической линии (табл.1).

Все операции выполняют в стерильных условиях.

Далее формируют следующие пулы ВСЖ:
пул А объединение выемок одного из матрацев первой технологической линии с выемками одного из матрацев второй технологической линии (вариант по п.1 формулы);
пул В объединение выемок других матрацев 1-й и 2-й линий с выемками 3-й линии (вариант по п.2 формулы).

Общий объем собранной ВСЖ составляет 1,1 и 1,4 л при ИА 5,6 и 5,7 lg ТЦД₅₀/0,5 мл для пулов А и В соответственно.

Исходный штамм и полученные пулы вируса контролируют на нейровирулентность по косвенному критерию rct₄₀ способности размножаться при температуре 40^oC (Хозинский В.И. и др. Характеристика некоторых генетических вариантов вируса по маркирующим признакам rct₄₀ и T₅₀. Acta virologica, 1966, 10, 1, 20).

У исходной культуры rct₄₀=1,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, что соответствует значению этой характеристики в (Васильева Х.А. Изучение технологии производства и прививочных свойств живой коревой вакцины Л-16, изготовляемой на фибробластах японских перепелок. Автореф. дис. к.м.н. ВНИИ гриппа, Л. 1971), тогда как вирус полученных пулов после инкубирования при 40^oC не титруется. При rct₄₀ -контроле объединенных съемов технологических линий инфекционный вирус (0,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл) выявлен лишь в 1-й линии, что является, в частности, подтверждением избирательности осаждения вирусных частиц гетерогенной популяции на клеточном монослое, на чем, как указано выше, основан предлагаемый способ.

Для оценки эффективности предлагаемого способа исходный штамм регенерируют также прототипным способом. Длительность стадии культивирования в прототипном способе составляет 25 дней, число полезных съемов 6, выход ВСЖ - 0,7 л с одного матраца при ИА=5,6 lg ТЦД₅₀/0,5 мл и rct₄₀=1,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл. Таким образом, в данном примере предлагаемый способ превосходит прототипный как по rct₄₀, так и по объему выхода вируса.

Регенерированные предлагаемым (пул А) и прототипным способами популяции вируса испытывают на нейровирулентность в прямом тесте на обезьянах. Для этого двум группам по 10 серонегативных обезьян вводят по 0,5 мл соответствующих ВСЖ в зрительный бугор каждого полушария и 1,0 мл внутримышечно. Общая доза коревого вируса составляет по 20000 ТЦД₅₀ (10 минимальных прививочных доз человека). Для контроля используют 2 группы по 4 серонегативных обезьяны, которых содержат вместе с опытными.

Все обезьяны опытных и контрольных групп выжили.

По результатам испытания вируса, регенерированного предлагаемым способом, установлено, что он не обладает нейровирулентностью (отсутствуют симптомы поражения нервной системы, что подтверждается гистологически) и контагиозностью (отсутствуют противокоревые антитела у обезьян контрольной группы). В ответ на введение вируса у 100% обезьян образуются антитела в обратном титре от 64 до 256 (средний геометрический обратный титр 120).

У восьми обезьян группы, зараженной вирусом, полученным прототипным способом, в различных отделах коры и ствола головного мозга выявлены диффузные гликопролиферативные явления с формированием микроглиальных очажков и перицеллюлярного глиоза, а также выпадание отдельных нейронов. В ядрах ствола головного мозга отмечалось наличие микронекрозов с последующим замещением их глиальной тканью, образование очажков нейронофагии и различного рода дистрофических изменений нейронов. Изменения нейронов были диффузными, мозаичного характера и не сопровождались выраженной сосудисто-инфильтративной реакцией в ткани мозга. Обнаруженные изменения свидетельствуют о высокой степени нейровирулентности штамма, регенерированного прототипным способом, вследствие чего его невозможно использовать в производстве живой коревой вакцины.

Пример 2. Производственный штамм вируса кори (коллекция НИИЭМ им. Пастера) регенерируют и контролируют на rct₄₀ как в примере 1 с использованием в качестве тканевой культуры диплоидных клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ). Целевой продукт формируют объединением полезных съемов трех технологических линий. Для технологического контроля воспроизводят прототипный способ.

У исходного вируса rct₄₀=1,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Характеристики съемов ВСЖ предлагаемого и прототипного способов приведены в табл.2. В предлагаемом способе в данных условиях с 1 матраца собирают 960 мл ВСЖ при среднем титре ИА 4,9 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, в то время как в прототипном способе собирают 120 мл ВСЖ (1 полезный съем) с титром 5:5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, причем rct₄₀ регенерированного штамма в прототипе 2,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, а в инкубированной при 40^oC ВСЖ, полученной предлагаемым способом, инфекционный вирус не титруется.

Пример 3. Дикий вирулентный штамм вируса кори (коллекция НИИЭМ им. Пастера) регенерируют как в примере 2. При этом 1-ю технологическую линию запускают в 4-х матрацах, от которых далее соответственно запускают последующие технологические линии через 0,5, 1,0, 1,5 и 2 ч после заражения предыдущих матрацев.

ИА исходного вируса составляет 4,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, а значение rct₄₀=3,2 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Результаты приведены в табл.3. Как видно из таблицы, при пересеве вируса на следующую технологическую линию с интервалом 0,5-1,0 ч после заражения предыдущей сохраняется небольшая активность нейровирулентных частиц (0,2-0,5 lg ТЦД₅₀/0,5 мл), а по мере увеличения указанной экспозиции сокращается количество полезных съемов и ИА регенерированного штамма. В оптимальном режиме (экспозиция 1,0 ч) число полезных съемов равно 8, выход ВСЖ составляет 1 л при ИА=4,8 lg ТЦД₅₀/0,5 мл.

Как пояснено приведенными примерами, использование предлагаемого способа гарантирует отсутствие нейровирулентности получаемого вирусного пула, что важно для снижения реактогенности живой коревой вакцины. Сопутствующим положительным эффектом, производным от принципиальной необходимости технической реализации способа путем запуска 2-3 технологических линий, является повышение в 2-3 раза выхода целевого продукта по сравнению с прототипом.

Использование: биотехнология, при получении живой коревой вакцины. Сущность изобретения: способ предусматривает заражение тканевой культуры исходным вирусом с последующим инкубированием в режиме периодического съема вируссодержащей жидкости, через 0,5 - 1,5 ч после заражения неадсорбированный вирус переносят на новую тканевую культуру, которую инкубируют при тех же условиях, а съемы вируссодержащей жидкости от каждой культуры объединяют. При высокой инфекционной активности последней зараженной культуры через 0,5 - 1,5 ч от ее инкубирования возможен перенос с нее неадсорбированного вируса на очередную тканевую культуру, съемы с которой дополнительно включают в состав популяции регенерированного штамма. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ регенерации вакцинного штамма вируса кори, предусматривающий заражение тканевой культуры исходным вирусом с последующим инкубированием в режиме периодического съема вируссодержащей жидкости, отличающийся тем, что через 1,0 ± 0,5 ч после заражения неадсорбированный вирус переносят на новую тканевую культуру, которую инкубируют при тех же условиях, а съемы вируссодержащей жидкости от каждой культуры объединяют. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что через 1,0 ± 0,5 ч от начала инкубирования последней зараженной культуры неадсорбированный вирус переносят с нее в очередную тканевую культуру, съемы с которой дополнительно включают в состав популяции регенерированного штамма.