Способ определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

11302196

Изобретение относится к биохимии

в л

и клинической гематологии и может быть использовано для определения

метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов.

Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий.

Способ осуществляют следующим образом.

Эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмьтают в буфере рН 7,4, содержащем 0,01 М , / и 0,8% NaCl. К осажденным эритроцитам добавляют равный объем 0,5%-ного нитрита натрия, приготовленного на физиологическом растворе, и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. За это время окисляется 85-95% гемоглобина. После инкубации эритроцита 5-кратно отмывают от нитрита в фосфатном буфере. Готовят 3-4%-ную суспензию эритроцитов в Кребс-Рингер фосфатном буфере (120 мМ NaCl, 4,8 мМ КС1, 1,3 мМ СаС,, 1,2 мМ NgSO , 16,5 мМ НРО , рН 7,4). Две пробирки с равными объемами нитритных эритроцитов помещают в качалку и инкубируют 3 ч при , причем в одной пробирке присутствует 10 мМ глюкозы и 2-10 М метиленового синего, а в другой пробирке добавки отсутствуют. В термостатируемую ячейку, содержащую 1 мл пробы при 37 С при перемешивании вносят 10 м (CN), и

о 6

регистрируют изменение окислительно- восстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода и хлорсеребряного электрода на рН- метре, с выхода которого сигнал подается на самописец. Скорость восстановления феррицианида калия определяют по времени, необходимому для восстановления стандартного количества К Fe(CN)g , и выражают в мМ Fe/л эритроцитов/ч. Значения этой скорости, характеризующие метгемоглобинре- дуктазную активность, возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиле- новым синим и не изменяются в пробе без добавок (контроль). .

Пример. Используют суспензию эритроцитов, содержащую 6,03 гемоглобина.

Относительные изменения скорости восстановления феррицианида калия

во времени предстанлеил лице.

т;)Г,5

0

5

0

5

0

5

Проводят касательную к начальному участку кривой зависимости скорости от времени и определяют,что за 10 мин изменения скорости восстановления феррицианида калия 3,1 мМ Fe/л эритроцитов/ч, а изменения скорости восстановления феррицианида калия,отнесенные ко времени I мин, 0,31 мМ Fe/л эритроцитов/ч. Проводя дальнейшие преобразования, получают,что скорость восстановления феррицианида калия равна 5,17 мМ Fe/мин, что в пересчете на 1 гем составляет 1 ,30 мМ Fe/мин - метгемоглобинредуктазная активность эритроцитов в данной пробе. Формула изобретения

Способ определения метгемоглобинре- дуктазной активности эритроцитов путем обработки эритроцитов нитритом натрия, инкубации с субстратами и кофакторами с последующим определением активности по скорости восстановления метгемоглобина, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа за счет сокращения числа стадий, после инкубации к суспензии цельных эритроцитов добавляют феррицианид калия, а скорость восстановления метгемоглобина определяют по скорости восстановления феррицианида, рег истрируе- мой иотенциометрическй.

Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии, предназначено для определения метгемоглобин- редуктазной активности эритроцитов. Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий. Для этого эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмывают в буфере рН 7,4, содержащем 0,01 М КН Pq, /К НРО и о, 8% NaCl. К осажденным эритроцитам добавляют равный объем 0,5%-ного нитрата натрия на физиологическом растворе, смесь инкубируют 10 мин, за это время окисляется 85-95% гемоглобина. Затем эритроциты 5-кратно отмьгоают в фосфатном буфере. Две пробирки с равными объемами нитритных эритроцитов инкубируют 3 ч при 37°С. В одной пробирке 10 мМ глюкозы и ме- тиленового синего, в другой добавки отсутствуют. В термостатирующую ячейку, содержащую 1 мл пробы, при перемешивании 37 °С вносят К Fe(CN), 3 о И регистрируют изменение окислительно-восстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода Э11В-14, хлорсеребряного электрода ЭВЛ-1 МЗ на рН-метре рН-121, с выхода которого сигнал подается на . самописец КСП-4. Скорость восстановления феррицианида калия определяют по времени восстановления стандартного количества KjFe(CN)g и выражают в ммоль Fe/л эритроцитов/ч.;Значения этой скорости, характеризующие мет- гемоглобинредуктазную активность, возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробе без добавок (контроль). 1 табл. ю (Л оо о N3 СО о: