СПОСОБ ОЦЕНКИ УГРОЗЫ РАЗВИТИЯ АНЕМИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ УДЕЛЬНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ НАРУШЕНИИ ОКСИГЕНАЦИИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации снижается оксигенация дезоксигемоглобина эритроцитов периферической крови.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики снижения оксигенации гемоглобина при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации путем определения степени удельной оптической плотности гемоглобина в области красного спектра при спектрофотометрическом облучении эритроцитов периферической крови.

3. Раскрытие изобретения

Исходя из электронной структуры молекул, можно уточнить, что они способны поглощать электромагнитное излучение [10]. Весьма характерны спектры поглощения гемоглобина, что и используется для количественной оценки степени насыщения гемоглобина кислородом. Поглощение света молекулами проявляется в ослаблении светового потока после его прохождения через объект. Поглощение света объектом тем выше, чем выше его плотность. Это выведено законом Бугера-Ламберга-Бера и измеряется показателем удельной оптической плотности [1]. При гомогенном строении вещества (таком как гемоглобин) интенсивность света во всех точках оптического пути одинакова, что приводит к тому, что оптическая плотность образца меньше, чем в растворе [6]. Для оксигемоглобина наиболее информативным является диапазон волн поглощения света λ 415-542 нм [2, 4]. При этом диапазоне мы и изучали удельную оптическую плотность гемоглобина, содержание которого зависит от степени оксигенации дезоксигемоглобина в свою очередь зависит от количества присоединенного к нему 2,3 ДФГ. Если количество присоединенного к дезоксигемоглобину 2,3-дифосфоглицерата будет выше 5 мкмоль/мл, присоединение кислорода к дезоксигемоглобину кислорода будет резко снижаться. Это отражается на количестве HbO₂, а удельная оптическая плотность его становится ниже.

4. Новая техническая задача

Найти новый способ оценки степени оксигенации гемоглобина методом измерения удельной оптической плотности при действии на организм беременной цитомегаловирусной инфекции.

5. Уровень техники раскрытия изобретения

Определение гемоглобина в эритроцитах разрабатывалось многими исследователями. В основном они представляют разновидности спектрофотометрического метода: 1. облучение эритроцитов терапевтическим лазером, при котором происходят в объекте температурно-зависимые изменения свойств среды, в том числе показатели преломления (фото-эффект), подлежащие спектрометрии [3]. Разновидностью спектрометрического определения гемоглобина является метод, предложенный в [7]. Оба эти метода носят многоступенчатый характер определения и весьма трудоемки. Используемый вновь созданный цитофотометрический аппарат «Mekos» (медицинские компьютерные системы) позволяет определять фотометрические параметры клеток для диагностики заболеваний. Аппарат зарегистрирован МЗ РФ 29/10010198/1282-01. Одно из исследований этим аппаратом было проведено на больных бронхиальной астмой для определения гемоглобина в эритроцитах периферической крови [8]. Мы применяли этот метод для определения содержания гемоглобина в отобранной группе эритроцитов (500 единиц), окрашенных на мазке по Лепене - специфическая окраска на гемоглобин. И после облучения в красном спектре, характерном для оксигемоглобина (это выполняется на аппарате «Mekos» по выбору исследователя), получали среднее значение гемоглобина в исследуемых эритроцитах.

Метод специфичен и прост в своем исполнении. После получения содержания гемоглобина в эритроцитах дополнительно принимается для анализа содержание HbO₂ и 2,3 ДФГ, которые позволяют окончательно делать вывод о нарастающей угрозе формирования анемии у пациента. Подобные исследования у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции в доступной литературе мы не встречали.

6. Осуществление изобретения

6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к ЦМВ.

6.2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.3. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПНР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.4. Содержание 2,3 ДФГ определяли по прописи Лугановой И.С. и Блиновой М.Н. [5].

6.5. Уровень оксигемоглобина оценивали по прописи Эвелина и Мэллой [9].

6.6. Удельная оптическая плотность оксигемоглобина определялась на мазках, окрашенных на гемоглобин по Лепене [11] и автоматически вычислялась удельная оптическая плотность гемоглобина в эритроцитах на цитоспектрофотометре «Mekos» (Россия).

7. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стьюдента и методом Фишера.

В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 на третьем триместре гестации связано со снижением оксигенации дезоксигемоглобина в эритроцитах периферической крови до 95,0±1,7%. При этом отмечается, что содержание 2,3 ДФГ в эритроцитах нарастало до 6,7±0,3 мкмолль/мл (контроль - 4,90±0,20 мкмоль/мл). В сложившихся условиях удельная оптическая плотность оксигемоглобина составляла 0,70±0,01 нм (контроль - 0,25±0,05 нм).

Таким образом, при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 изменяется связь 2,3 ДФГ с гемоглобином и количество его присоединяется до 6,7±0,3 мкмоль/мл, что мешает оксигенации гемоглобина. Плотность гемоглобина снижается, поэтому удельная оптическая плотность гемоглобина будет составлять 0,70±0,01 нм (контроль - 0,25±0,05 нм), что создает угрозу формирования анемии.

Литература

1. Алексеевский В.Б., Бардин В.В. и др. Физико-химические методы анализа. Л.: Химия. 1988.

2. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин // Соросовский образовательный журнал. 1998. №4.

3. Брусничкин А.В., Недоседин Д.А., Рындина Е.С. Определение различных форм гемоглобина методом термолизиновой спектрометрии // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2009. Т. 50. №1. С. 55-66.

4. Колотова Н. Фотоника. «Лабметод». 2009. №6.

5. Луганова И.С., Блинова М.Н. Определение 2,3-дифосфоглицериновой кислоты неэнзиматическим методом в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом // Лабор. дело. 1975. №11.

6. Мерзляк М.Н., Чивунова О.Б.. и др. Спектры поглощения и рассеяния света клеточными суспензиями некоторых цианобактерий и микроводорослей // Физиология растений. 2008. 55(3). С. 464-470.

7. Мосур Е.Ю. Спектрофотометрический метод определения содержания основных производных гемоглобина. Дисс. канд. физико-математических наук. 2007. 118 с.

8. Надточий Е.В. Морфофункциональная характеристика нарушений газообмена у больных бронхиальной астмой. Автореф. дисс. на соискания степени канд. мед. наук. 2007.

9. Биохимические методы исследования. Справочник (под редакцией А.А. Покровского). М.: Медицина. 1969. 337 с.

10. Тучин В. Оптическая биомедицинская диагностика. М.: Наука. Физматлит. 2007.

11. Undritz Ε. Atlas of Haematology. Sandoz: Basle. 1973.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам диагностики и может быть использовано для диагностики угрозы оценки формирования анемии на третьем триместре беременности вследствие снижения процессов оксигенации гемоглобина при обострении цитомегаловирусной инфекции. Способ включает определение титра антител к цитомегаловирусу, содержания в эритроцитах 2,3 ДФГ (2,3-дифосфоглицерата), оксигемоглобина. При увеличении титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, нарастании 2,3 ДФГ до 6,7±0,3 мкмоль/мл, содержании HbO₂ 95,0±1,7%, при снижении удельной оптической плотности гемоглобина до 0,70±0,01 делают вывод о формировании угрозы развития анемии. Способ позволяет изучить характер нарушения оксигенации гемоглобина с помощью определения удельной оптической плотности.

Способ оценки угрозы развития анемии на третьем триместре гестации, включающий определение титра антител к цитомегаловирусу, содержания в эритроцитах 2,3 ДФГ, оксигемоглобина, и при увеличении титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600, нарастании 2,3 ДФГ до 6,7±0,3 мкмоль/мл, содержании HbO₂ 95,0±1,7% удельная оптическая плотность гемоглобина снижается до 0,70±0,01 нм, что свидетельствует о формировании угрозы развития анемии.