Способ получения антисыворотки к инсулину Советский патент 1988 года по МПК A61K39/39 

1

Настоящее изобретение отмоснтся к биохимии и медицине , а именно к способам получения антисывороток к гормонам которые могут быть использонаны при разработке и создании радиоиммуноло- гичес1сих систем для определения гормонов в Сыворотке (плазме) крови; как компонент радиодиагностических наборов для определения гормонов при их серийно-промышленном выпуске; для анализа гормонов другими иммунологическими тестами - иммунопреци- питацией, иммуноэлектрофорезом и пр.

Целью изобретения является повышение титра сыворотки.

Это достигается тем, что введе- ние инсуггина эмульгированного в полном адъюванте Фрейда чередуют с введением инсулина, Ковалентно связанного с сефарозой, активированной бромицианом, или коньюгированного с шдроокисью алюминия, причем названные антигенные смеси вводят внут- рикожно ,во множество точек спины и

ПЕЙ.

J1 р И м е р. Приготовление антигена для иммуниза1;ии.

Антиген I. 5 единиц (0,2 иг) инсулина растворяют в 0,3 мл стерильного физиологического раствора. Для полного растворения инсулина добавляют к зтому раствору 10-20 мкл 0,1 Н соляной кислоты. Полученный раствор инсу1шна тщательно эмугируют с 0,3 мл (равным объемом) полного адьго ванта Фрейда. Такую антигенную смесь используют для первого введения при иммунизации. Антиген 1 для третьего, пятого и нечетных введений готовят аналогичнь1м способом из р асчета на 5 единиц инсулина 0,3 мл физиологического раствора и 0,3 мл полного адьюванта Фрейда.

Антиген II. Инсулин - BrCN-сефа- роза.

Посадку инсулина на сефарозу проводили по известной методике. Лиофилизован1Л11й препарат BrCN - се- фарозы суспе1щируют в I тМ НС1, дают набухнуть в течение 15 мин и промывают тем же раствором от консер вируюишх добавок. Количество ее беру из расчета посадки 5-10 мг белка на I мл влал;ног-о сорбента с учетом то- го, что 1 г лиофилизированной сефа- розы набухает до объема 3,5 мл. После промывки обменник переводят в 0,1 М раствор ЫаНСОз (рН 8,3) с

49046 0,5

NaCl. В этом растпоре .обменник (1,4 г или Д,9 мл) п теч(ние 2 ч поремеишвают с 50 мг инс-1 Ш1на (раст- вор антигена 5 мг/мл) на встряхивате- ле при комнатной температуре (asm в течение ночи на холоду). После окончания посадки антигена блокируют не занятые им актив1гые центр 1 сорбента. 10 Для этого гель обрабатывают таким же образом в 1 М растворе зтанолами- на или 0,2 М растворе глицина при рН 8. Затем избытки белка и блокирую- Diero агента отмывают тем же раство- 15 ром бикарбоната с солью, потом 0,1М ацетатным буфером (рН 4) с добавкой 0,5 М NaCl и снова бикарбонатом.

Иммуносорбент переводят в 0,01 М (юсфат)тый буфер (рН 7,0) с 0,15MNaCl. 20 Готовят суспензию, где степень посадки инсулина 1 мг/мл. Получетип 1Й таким образом антиген вводят в колн- чествах , приведенных в схеме 1 , из расчета, что в 0,1 л суспензии со- держится 0,1 мг инсулитья.

Инсулин, коиьюгиропаниый с гидроокисью алюминия.

Для первого введения антиген готовят следующим образом: 0,3 мг иису- 30 лина растворяют в 0,3 мл физиоло- тческого стерильного рпстворл и добавляют 0,3 мл 1%-ной гидроокиси алюминия, все тщательно переметшают. 1%-ный раствор гидроокиси алюминия 35 готовят перед употреблением из концентрированного раствора гидроокиси алюминия. Для всех последуюишх введений антиген берут в количь стпах, указан1{ых в схеме I , из рпсчетл 40 0,1 мг инсулина на 0,1 мл фиг .иологи- ческого раствора.

. Проведение иммунизации. Процесс иммунизации состоит из 10 циклов.

45Первый цикл иммунизации включал

ИЕстикратное виуТрикожиое введение во множество точек стшы и гаеи антигенного материала каждые 3 недели по следующей схеме;

50Введение мг . антиген

1-ое0,25I

2-ое0,3II

3-ое0,33I

4-ое0,4011

55 5-ое0,45I

6-ое0,5II

Количество вводимых коктонентов антигенной смеси дается в расчете на 1 животное,ПРИзтом 1 ед. 0,ОД08 мг

инсулина. Второй и все последую11у1е ilHKj D) (до 10) состоит яэ однократнст го вв дега1Я каж;а,1е ЗПдней антигена 1 (чет1тые Щ1клы) иля антиг ена TI (нечетные циклы) в дозах 0,3 мг инсулина. Взятие крови для тестиропа- иия проводят путем кардиальной пункции на 7-10 день после очередного введения антигена.

В Гсследуемой антисыворотке ра- диoим fyнoлoгичecким методом опреде- JWIOT:

I. Титр антисыворотки (пеличшгу, обратную тому разведению антисыворотки, которая вызывает связывание 50% I - инсулина в аналитической тест-систег-fc).

2.Константу ассоциации (характеризует сродство антител к антигену)

3.Специфичность антител (oHenii- ваетс.и процент перекрестной реакции с друП1№1 структурно-родственньти соедин мшями - гфоинсулином, глютсаго ном, С-пептидом).

TtfTp антисыворотки после первого цикла иммунизации в пределах 1:10000 - 1:30000; через 7-9 1;еся- це-в 1:70000 - 1:100000; через 10-12 месяцев 1:100000 - 1:250000, что позволяло в радиоиммунологической Tecf-системе для определе1{ия ицгу.т- на доводить разведение антисыворотки (рабочий титр) до 1:400000-1:100000

Величина константы ассоциации равна 1 ,02-1 ,73 10 л/мол.

Перекрестная реакция с проинсу- лином не более 10%, с глюкагоном - 0,37,, с С-пептидом - 0,05%, что говорит о высокой специфичности полученных антител.

KpoNie того, антисыворотки тестировали методом двойной иммуноди(|х})у-г зии по Оуу.терлшп. Антисыворотки давали (линстяеиную полосу преципита НИИ с инсулином и не реагировали с проинсулмнпм.

Из 10 ЖИВОТН7ЛХ, взятых в эксперимент, ереч 12-15 месяцев им ryнизa- 1ШИ остагалось в ont.iTe 8, две свинки погибли в момент взятия крови через 9-11 месяцев после начала иммунизации ,

В региультате предложенного метода получен,) П лсокоспецифич1гые (перекрестная pt;акция с проинсулином - не более Юл, с г люкагоном - 0,3, с С-пептидпм - 0,05/), высокоаффинш.1е (конста1гта ассоциации не нижа

1 ,02-I , 75 Ш л/моль) и p.iiicoKo- актит-:ные антитела (раГ пчий титр анти- ci ip iroTKH в аналитической тест-системе 1:800000-1000000), 1;оторые удовлетворяют требовятям, гфедъяв- ляем111М к антисывороткам, используе- м),1М для panjionMbry ionorH4ecKoro анализа. Использование внутрикожных чере- дуютдих введеннй инсулина с депонирующими адьювантами позволило в эксперименте практически исключить летальность живот1с,1Х от развития диабетической KoMiii.

Состояние имм нологической толерантности к инсули1гу возникает через 6-8 месяцев после начала иммунизации. Развитие этого состояния су- гаесгвенно ограничивает возможность эксперимента, так как у морской свинки однократно взять липпз D сред- н(м 5-R мл крови, что длет выход антисыпоротки 2-А мл. Поэтому удлинение периода выработки высокоактив- шлх антител до 12-15 месяцев путем использования предложенного способа впадения антигена создает большой экономический эффект.

Увеличение тгро; ,олжительности периода выработки пыспкоактишштх антител бе-3 наступления состоятся иммунологической то.мсра ггности поз- вот1ло получить антт сыворотки с высокими титракт и улуч1 :ен ыми аналитическими параметрами. P;poN e того, в этот период иммунизации возможно создать запасы антисыворотки. Это обстоятельство особенно важно для обеспечения серийно-промысленного выпуска наборов реактивов для радиоиммунологического определеш я инсу;и- на. Хорошие характеристи си получен- П;1х антисывороток к ннсуянну позволяют использовать их и в и 5-1yнoлoгичecкиx методах для анализа инсулина, в частности методах имму- нодиффузии (и tмyнoпpeциm тaция в агаре и агарозе, иммунозлсктрофорез) и др.

Формула изобретения

Способ получения антисыпоротки к инсулину путем HMNtyiuiiauHH морских свинок инсулином с полным адъювантом Фрейнда, о т л и ч а ю i:i и с я тем, что, с целью .MiiiH титра

сыворотки, жинотньге дополнительноинсулина с сефароэоЙ, при этом ,

иммунизируют комплексом инсулина снизацию осутдествляют во множество тогидроокисью алюминия и комплексомчек спины и гаеи подкожно.

Изобретение относится к биохимии и медицине, точнее к способам получения антисывороток к гормонам. Предназначенным для разработки и создания разноиммунологических систем (при определении гормонов в сыворотке или плазме гфови); как компонент радиодиагностических наборов для определения гормонов при их серийно- промышленном выпуске; дпя анализа гормонов другими иммунологическими тестами. - иммунопреципитацией, им- муноэлектрофорезом и пр. Цель изобретения - повышение титра сыворотки, Для этого инсулин эмульгируют с рав- ,ным объемом полного адьюванта Фрейда, чередуют его введение с введением инсулина, ковалентно связанного с сефарозой, активированной бромциа- ном, или коньюгированного с гидроокисью алюминия. Эти антигенные смеси вводят внутрикожно во множество точек спины, и шеи. Весь процесс иммунизации состоит из 10-ти циклов. Хорошие характеристики полученных антисывороток к инсулину позволяет использовать их в иммунологи- ческих методах для анализа инсулина, в частности в методах иммунодиффу- зии (иммунопреципитаЦия в агаре и агарозе, иммуноэлектрофорез и др.). сл со 4 СО о 4 О5