СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНОГО РАСТВОРА МЕДА И СПОСОБ ПРОВЕРКИ ЕГО ПОДЛИННОСТИ Российский патент 2014 года по МПК A23L1/08 A23L1/30 G01N33/02 

Изобретение относится к получению водного раствора меда посредством его кристаллизации, который может быть использован в качестве фармацевтического средства (антимутагенного препарата), добавки в продукты питания, корма животным, косметических препаратов и т.д.

Известен способ концентрирования жидких пищевых продуктов, основанный на принципе отверждения жидкостей при замораживании. При этом используют устройство (заявка Франции №2388581, кл. B01D 9/00, 1988), в котором смесь двух жидкостей, замерзающих при разной температуре, разделяют. Однако устройство применимо только при концентрировании молочных продуктов и фруктовых соков.

Известен способ кристаллизации, обеспечивающий непрерывное получение кристаллических веществ с определенным размером кристаллов и гранулометрическим составом. Способ основан на растворении кристаллизуемого вещества в растворителе и выдерживании маточного раствора в вакууме при заданной температуре. Однако способ реализуется только в присутствии третьего вещества (см. патент Франции №2165354, кл. B01D 9/00, 1973).

Наиболее близким к предложенному является способ получения водного раствора меда, предусматривающий кристаллизацию меда на поверхности льда при температуре не выше минус 20°С, при массовом соотношении меда 20-25% и льда 20-25% (патент РФ №2407403, A23L 1/08, 2010).

К недостаткам способа следует отнести низкое качество и низкая степень чистоты водного раствора меда, а также долгий технологический процесс.

Технический результат заявленного технического решения заключается в обеспечении высокой степени чистоты водного раствора меда, а также в уменьшении времени технологического процесса и повышение качества водного раствора меда.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения водного раствора меда, предусматривающий нагрев дистиллированной воды до температуры кипения с последующим ее замораживанием в жидком азоте до образования льда во всем объеме и выдерживанием полученного льда в жидком азоте, после чего на его поверхность последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед, после чего осуществляют размораживание смеси до полного растворения льда, затем замораживают и выдерживают в течение не менее 30 суток, после чего вновь проводят размораживание, при этом процессы размораживания проводят при температуре не выше 25°С, отличающийся тем, что после нагрева дистиллированной воды до температуры кипения, воду переливают в сосуд, в котором с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм.рт.ст., после замораживания в жидком азоте осуществляют проверку вакуума внутри сосуда, после чего выдерживают полученный лед в жидком азоте в течение не менее 15 мин и не более 30 мин., далее на поверхность льда последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед в количестве соответственно 40 мас.% и 7 мас.% от общей массы исходной воды, а перед размораживанием смеси до полного растворения льда повторно с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм.рт.ст.

Способ предусматривает возможность фильтрации полученного раствора меда через фильтр с диаметром пор 0,2-0,4 мкм и последующее его запаивание в ампулы.

Изобретение включает в себя также способ проверки подлинности водного раствора меда, полученного способом по п.1, включающий использование свойств водного раствора меда, который значительно снижает частоту мутации, вызванной ультрафиолетовым излучением, при этом анализ проводят на базе тест-системы С3, высокочувствительной к мутагенному действию различных веществ, причем тест-систему С3 облучают ультрафиолетовыми лучами, применяя лампу с мощностью дозы 0,25-0,30 Дж/м² сек., после окончания облучения, в тест-систему С3 привносят исследуемый водный раствор меда, и после проведения сравнения, препарат понижающий частоту мутаций в ADE4-ADE8 локусах у тестерного штамма при УФ-облучении примерно в 2 раза, определяют как подлинный водный раствор меда, произведенный согласно способу по п.1.

Заявляемое техническое решение поясняется чертежами, где:

на фиг.1 показано влияние водного раствора меда на частоту мутаций, индуцированных УФ-лучами в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3);

на фиг.2 показано влияние водного раствора меда на частоту мутаций, индуцированных γ-лучами в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3);

на фиг.3 показано влияние водного раствора меда на частоту мутаций, индуцированных ЭМС в локусах ADE4-ADE8 штамма 2-LMG-3031 (rad2 hsm3).

В настоящее время проблема поиска и создания препаратов, обладающих антимутагенным действием, приобретает особую остроту. Это связано с тем, что в больших масштабах происходит загрязнение окружающей среды химическими веществами антропогенного происхождения, при этом некоторые из них обладают в разной степени мутагенным и канцерогенным действием. Кроме того, в медицине используются противораковые лекарственные препараты и физические воздействия, побочным эффектом которых может быть индукция мутаций в половых и соматических клетках пациентов. В связи с возникновением "озоновых дыр" остро встала проблема борьбы с мутагенным действием УФ-лучей солнечного происхождения, которые являются сильнейшим из известных физических мутагенов. Известно, что причиной раковых заболеваний, как правило, являются нарушения генетического материала перерожденной клетки, то есть мутационные изменения, поэтому антимутагенные препараты могут иметь и антиканцерогенное действие. Можно представить два наиболее вероятных механизма антимутагенного действия химических препаратов. Во-первых, это могут быть вещества, перехватывающие и инактивирующие мутагены в клетке или организме. Такие антимутагенные препараты могут использоваться в тех случаях, когда заранее известно, что мутаген попадет в организм. Во-вторых, антимутагенами могут быть химические вещества, способные стимулировать клеточные системы, которые в норме нацелены на борьбу с мутагенными повреждениями генетического материала клетки. Этот класс антимутагенов является наиболее перспективным для медицинского применения, так как он не так жестко ограничен сроками применения, как в предыдущем случае, и, что особенно важно, такие вещества могут защищать клетку от мутагенов, обладающих совершенно различной специфичностью индуцированных повреждений генетического материала. К тому же у таких веществ трудно ожидать побочных неблагоприятных воздействий на организм.

Проблема разработки антимутагенных препаратов сильно затруднена отсутствием быстрых и надежных методов оценки мутагенной и особенно антимутагенной активности исследуемых препаратов. Возникновение мутаций - редкое событие, поэтому для надежного определения частоты индуцированных мутаций необходимо анализировать потомки сотен тысяч мутагенизированных клеток. В связи с этим необходимо иметь тест-системы высокочувствительные к мутагенному действию различных веществ. При этом такие тест системы должны давать достаточно быстрый и точный ответ, а также быть относительно дешевы. Идеальная тест-система для выявления мутагенов и канцерогенов должна учитывать любые типы повреждений генетического материала, чтобы максимально уменьшить число ошибочных негативных результатов. Генетическим событием наиболее подходящим для этих целей является индукция прямых генных мутаций. Такая система создана в ПИЯФ РАН и включает штаммы, несущие уникальный набор мутаций, позволяющий с высокой чувствительностью и точностью определять степень генетической опасности исследуемых веществ.

Последовательность операций и выбранные технологические режимы получения водного раствора меда обеспечивают возможность обогащения раствора меда глюкозой в гидратной форме, которая наиболее адаптирована к ее усвоению млекопитающими, в частности человеком. Получение гидратной глюкозы из глюкозо-фруктозных сиропов связано с большими технологическими сложностями, касающимися обеспечения ее кристаллизации, высушивания и хранения. Кроме того, процесс кристаллизации гидратной глюкозы требует обеспечения микробиологической чистоты всего процесса, что связано с дополнительными трудозатратами.

Полученный водный раствор меда с высоким содержанием глюкозы в гидратной форме, позволяет использовать его в качестве адаптогена с высокой степенью активности. При этом полученный раствор обладает высокой микробиологической чистотой, позволяющей применять его не только в качестве добавки в пищу или к корму животных, но и в качестве добавки в косметические и фармацевтические препараты, а также в качестве самостоятельного лекарственного средства, т.е. в качестве антимутагенного препарата после воздействия различных мутагенов.

Способ проверки подлинности водного раствора меда, полученного указанным способом, позволяет гарантировать потребителю подлинность биологически активных свойств раствора меда, полученного с использованием вышеуказанной технологии.

Контроль подлинности водного раствора меда, полученного указанным способом, осуществляют следующим образом.

Анализ подлинности проводился на базе тест-системы С3, разработанной в ПИЯФ и разрешенной к использованию для данных целей Госкомприроды СССР. Учитывалась индукция прямых генных мутаций по пяти генам, контролирующим биосинтез аденина.

Тестерная линия дрожжей Saccharomyces cerevisiae 2-LMG-3031, генотипа МАТа ade2-248 leu2 rad2 hsm3. Ген MAT контролирует пол клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2 приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, мутантный ген hsm3 резко повышает уровень индуцированных мутаций.

Генотип созданной тестерной линии позволяет учитывать возникновение прямых мутаций в 5 генах, контролирующих биосинтез аденина, предшественника биосинтеза нуклеиновых кислот. Разрушенный ген ade2 придает колониям дрожжевых клеток красную окраску, а мутация в одном из 5 вышеупомянутых генов изменяет окраску колоний на белую. По появлению белых колоний мутантов судят об интенсивности мутагенеза. Мутации rad2 и hsm3 в сотни раз повышают чувствительность клеток дрожжей к мутагенному и летальному действию различных химических и физических мутагенов. Перечисленные выше свойства тестерной линии позволяют с наименьшими затратами учитывать такое редкое событие как возникновение мутации в определенном гене.

Основная среда, имела следующий состав: глюкоза - 2 г/л, этиловый спирт - 20 мл/л, KH₂PO - 2 г/л, MgSO - 1 г/л, (NH₄)SO₄ - 1 г/л, дрожжевой автолизат - 2 г/л, пептон - 2 г/л, агар-агар 30 г/л.

Перед началом испытаний культура клеток расконсервировалась путем высева на жидкую питательную среду и выращивалась в течение 3 суток в термостате при 30°С. После этого, суспензия выросших клеток разводилась водой и высевалась на чашки Петри с плотной (агаризированной) средой для получения отдельных клонов. После 3 суток выращивания отдельные красные клоны отбирались для выявления частоты спонтанных мутаций. Для определения частоты спонтанных мутаций и устойчивости к канаванину методом упорядоченного посева использовали среду минимального состава с добавлением аминокислот и азотистых оснований, необходимых для роста тестируемых штаммов, и концентрации канаванина 60 мг/л.

Метод упорядоченного посева определяет частоту спонтанных мутаций, появляющихся в процессе медленного роста клеток на селективной среде, содержащей определенную концентрацию канаванина, позволяющие клеткам поделиться 8-10 раз. Клетки инкубировали в 2 мл полной жидкой среды в течение двух дней, затем 1 мл выросшей культуры разводили в 4 мл воды. Специальный репликатор со 150 штырями погружали в эту суспензию и переносили капли на чашки с селективной средой, содержащей канаванин и водного раствора меда и на контрольные чашки без водного раствора меда. Канаванин устойчивые мутанты росли быстрее немутантных клеток и выглядели как «бородавки» на фоне ограниченного роста тестируемых культур. После 15 дней инкубации число бородавок и общее число выросших на 150 пятнах клеток было подсчитано. Число выросших клеток определяли после их смыва с нескольких отдельных отпечатков, на которых не появлялись бородавки. Частоту мутаций на клетку на клеточное деление определяли при делении числа бородавок на число клеток на всех 150 отпечатках.

Облучение ультрафиолетовыми лучами (УФ-лучи). Применяли лампу БУВ-30П с мощностью дозы на используемом уровне: 0,20-0,30 Дж/м² сек.

Суспензия дрожжевой культуры в дистиллированной воде с концентрацией 10⁷ клеток/мл в количестве 4 мл наливалась в стерильные чашки Петри и облучалась УФ-лучами в требуемой дозе. Немедленно после облучения исходную суспензию клеток разводили с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало для учета выживаемости не более 500 клонов, а для учета мутагенеза 1000-1500 колоний. Рассев производили на среду, состав которой описан выше. Учет мутантов производили на 6-7 сутки инкубации под бинокуляром (увеличение в 15 раз).

Испытание водного раствора меда на антимутагенную активность.

Для оценки генетического эффекта препарата использовали одну ампулу, содержимое которой разводили в 10 раз. Это позволило заметно снизить вариабильность результатов параллельных опытов и получить более точную характеристику действия указанного водного раствора меда. Суспензию тестерных клеток, приготовленной на основе этого разбавленного раствора, вносили на чашки Петри по 0,1 мл. В результате конечная концентрация раствора в питательной среде составила 0,03%.

При изучении генотоксичности водного раствора меда мы обнаружили, что он не только не увеличивал выход прямых генных мутаций, но заметно снижал их уровень. Обработка водного раствора меда клеток штамма 2-LMG-3031 в течение 24 часов привела к снижению частоты спонтанных мутаций в генах ADE4- ADE8 от (5.4±1.2)×10^-6 в контроле до (0.4±0.1)×10^-6. За это время водный раствор меда не оказывал влияния на размножение клеток.

Три хорошо изученных мутагена УФ - и гамма-лучи и химический супермутаген этил-метан сульфонат (ЭМС), вызывающие различные первичные повреждения ДНК, были использованы, чтобы выяснить распространяется ли антимутагенное действие водного раствора меда на летальные и мутагенные повреждения, индуцированные этими агентами. Данные фиг.1 показывают, что водный раствор меда понижал частоту мутаций в ADE4-ADE8 локусах у тестерного штамма при УФ-облучении примерно в два раза. В еще большей степени (примерно, в три раза) водный раствор меда понижал частоту гамма индуцированных мутаций (фиг.2), и в меньшей степени (полтора раза) - ЭМС индуцированных мутаций (фиг.3). Ни в одном из проведенных исследований мы не обнаружили влияния водного раствора меда на выживаемость клеток.

Раствор меда, полученный данным способом, обладает высокой эффективностью, что подтверждено клиническими исследованиями.

Как известно, талая вода обладает способностью ускорять биологические процессы в живых организмах. Это связано с наличием кристаллически-организованных групп молекул воды. Поскольку в талой воде сохраняются кристаллические решетки, мы имеем дело с кристаллоподобной жидкостью. Структура воды в живом организме во многом напоминает структуру кристаллической воды. Если организм получает извне неталую воду, то необходимы затраты энергии на ее адаптацию. Талая вода гораздо легче обычной вступает в реакции с различными веществами, и организму не требуется тратить дополнительную энергию на перестройку ее структуры.

При растворении меда в талой воде происходит процесс образования и удержания молекулы глюкозы в гидратированной форме, что позволяет повысить степень усвояемости глюкозы млекопитающими.

Растворение меда в талой воде с последующим замораживанием раствора в жидком азоте при давлении 150 мм рт.ст. позволяет обеспечить ее равномерное распределение. Выдерживание замороженного раствора при температуре не выше минус 25°С, предпочтительно в пределах 20-25°С, в течение не менее 30 суток позволяет окончательно стабилизировать молекулярную структуру раствора.

Следует подчеркнуть, что такой лед в природе не встречается. В жидком азоте он растрескивается и при нанесении на его поверхность кипящей воды процесс растрескивания становится более интенсивным.

А поскольку вода имеет разную плотность при разной температуре, в нашем случае, образовавшиеся трещины заполняет самая плотная вода, температура которой +4 градуса по Цельсию.

Размораживание, которое осуществляют на разных этапах технологического процесса при давлении 150 мм рт.ст., в условиях которого таяние протекает дольше, а также при комнатной температуре не выше 25°С, предпочтительно в пределах 20-25°С, что позволяет сохранить молекулярную структуру полученного раствора, следовательно и обеспечивает его свойства.

Следует также подчеркнуть, что указанного количества меда 7 мас.% к общей массе смеси достаточно для того, чтобы растопить лед и кристаллизовать целевой продукт. Причем приготовленный по данной технологии водный раствор меда обладает ярко выраженными бактерицидными свойствами, значительно превосходящими аналогичные свойства исходного продукта, повышает его биологическую активность при использовании его в лечебных целях по общепринятым методикам, и тем самым обеспечивает высокую степень чистоты раствора.

Кроме того, создание давления внутри сосуда влияет на качественные и количественные показатели водного раствора меда, что, в свою очередь, отражается на качестве лекарственных препаратов и ассортименте производимой продукции. При создании давления внутри сосуда происходит ослабление температурного воздействия на раствор за счет чего температура закипания жидкости ниже, что положительно влияет на время технологического процесса и на качество лекарственного препарата.

Раствор может быть применен в качестве добавки в продукты питания, корма животным, косметических препаратов, а также в качестве самостоятельного лекарственного средства.

Пример конкретного осуществления способа.

В металлическую емкость объемом 0,45 литра наливают дистиллированную воду в количестве 0,25 литра, доводят до кипения. Затем из емкости воду переливают в специальный сосуд, в котором с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст., который погружают в жидкий азот на 0,3 высоты стакана. После замораживания в жидком азоте осуществляют проверку вакуума внутри сосуда. Выдерживают в жидком азоте до полного замерзания воды. После этого, на поверхность льда последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед в количестве соответственно 40 мас.% и 7 мас.% от общей массы исходной воды, создают давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст. и выдерживают при комнатной температуре не выше 25°С, предпочтительно в пределах 20-25°С, в течение 60 минут. За это время происходит полное размораживание льда и распределение раствора меда по всему объему. Затем сосуд помещают в морозильную камеру, замораживают, и выдерживают при температуре не выше минус 25°С, предпочтительно в пределах 20-25°С в течение 30 суток. После этого вновь проводят размораживание при комнатной температуре не выше 25°С, предпочтительно в пределах 20-25°С.

Приготовленный по данной технологии раствор обладает ярко выраженными адаптогенными свойствами, значительно превосходящими аналогичные свойства исходного продукта. За счет указанного соотношения воды и меда, а также за счет создания давления внутри сосуда, измененная технология и структура меда в растворе повышает его биологическую активность, при этом процесс кристаллизации обеспечивает высокую степень чистоты раствора.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно при получении водного раствора меда. Способ предусматривает нагрев дистиллированной воды до температуры кипения. Затем воду переливают в сосуд, в котором с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст. Далее осуществляют замораживание в жидком азоте до образования льда во всем объеме. После замораживания в жидком азоте осуществляют проверку вакуума внутри сосуда и выдерживают полученный лед в жидком азоте в течение не менее 15 мин и не более 30 мин. После чего на поверхность льда последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед в количестве соответственно 40 мас.% и 7 мас.% от общей массы исходной воды. Затем опять создают давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст. и осуществляют размораживание смеси до полного растворения льда. Предложен также способ определения подлинности водного раствора меда. Изобретение позволяет получить водный раствор меда высокой степени чистоты, а также уменьшить время технологического процесса и повысить качество водного раствора меда. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения водного раствора меда, предусматривающий нагрев дистиллированной воды до температуры кипения с последующим ее замораживанием в жидком азоте до образования льда во всем объеме и выдерживанием полученного льда в жидком азоте, после чего на его поверхность последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед, после чего осуществляют размораживание смеси до полного растворения льда, затем замораживают и выдерживают в течение не менее 30 суток, после чего вновь проводят размораживание, при этом процессы размораживания проводят при температуре не выше 25°C, отличающийся тем, что после нагрева дистиллированной воды до температуры кипения воду переливают в сосуд, в котором с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст., после замораживания в жидком азоте осуществляют проверку вакуума внутри сосуда, после чего выдерживают полученный лед в жидком азоте в течение не менее 15 мин и не более 30 мин, далее на поверхность льда последовательно вносят кипящую дистиллированную воду и мед в количестве соответственно 40 мас.% и 7 мас.% от общей массы исходной воды, а перед размораживанием смеси до полного расворения льда повторно с помощью вакуумного насоса доводят давление внутри сосуда до 150 мм рт.ст.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовый продукт фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2-0,4 мкм и запаивают в ампулы.

3. Способ проверки подлинности водного раствора меда, полученного способом по п.1, включающий использование свойств водного раствора меда, который значительно снижает частоту мутации, вызванной ультрафиолетовым излучением, при этом анализ проводят на базе тест-системы С3, высокочувствительной к мутагенному действию различных веществ, причем тест-систему С3 облучают ультрафиолетовыми лучами, применяя лампу с мощностью дозы 0,25-0,30 Дж/м² с, после окончания облучения в тест-систему С3 привносят исследуемый водный раствор меда, и после проведения сравнения препарат, понижающий частоту мутаций в ADE4-ADE8 локусах у тестерного штамма при УФ-облучении примерно в 2 раза, определяют как подлинный водный раствор меда, произведенный согласно способу по п.1.