Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды Российский патент 2021 года по МПК C12N1/19 C12N15/81 

Изобретение относится к области использования микробиологических объектов для контроля загрязнения окружающей среды. Может найти применение в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод и почв. В мировой практике широко используются тест-системы, позволяющие регистрировать генетические и концерагенные эффекты веществ, загрязняющих окружающую среду. Генетическим событием, наиболее подходящим для обнаружения генетически опасных соединений, является индукция прямых генных мутаций. Другим генетическим событием, используемым для обнаружения потенциальных мутагенов, является митотическая рекомбинация - митотический кроссинговер и общая митотическая сегрегация.

Известно применение штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae для оценки общей токсичности воды, описанное в патенте РФ 2170258 [1].

В основу предложенного способа положено явление, заключающееся в кратковременном защелачивании среды при переходе сухих дрожжей Saccharomyces cerevisiae в активную фазу развития. Экспериментально показано, что наличие в среде токсикантов приводит к тому, что явление защелачивания отсутствует. Это достаточно грубая оценка, которая не выделяет генетическую активность токсиканта. (А.С. СССР №648607, МПК C12N 15/00.) [2].

Но данные штаммы не позволяют получить характеристику мутагенной активности тестируемого вещества, так как фиксируется рекомбиногенный эффект, т.е. данные штаммы не могут фиксировать возникновение мутаций в клетках организма.

Также на учете рекомбиногенной активности при повреждении ДНК базируются штаммы Т2 (МАТа ade2-192 rad2) и Т3 (МАТα ade2-192 rad54), описанные в работе: «Использование дрожжей-сахаромицетов как тест-объекта для оценки генетических эффектов системных фунгицидов». Микология и фитопатология. 1993. Т.27. N1. С. 60-66. [3]. Для повышения чувствительности к рекомбиногенному действию, этих диплоидных штаммов в обе гомологичные хромосомы были введены мутации rad2-1 и rad54.

Главным недостатком этого штамма является то, что с его помощью нельзя учесть мутагенность испытуемых веществ, т.е. данный штамм не может фиксировать возникновение мутаций, возникающих в клетках организма при повреждении ДНК

Известен штамм 1ПГ-216, описанный А.С. СССР №1135188, который обладает высокой точностью и чувствительностью определения прямых генных мутаций, т.е. мутагенности [4]. В основе этого штамма лежит регистрация прямых генных мутаций по 6 генам аденинзависимости (ade3, ade4, ade5, ade6, ade7, ade8). Введение в генотип мутации rad2-1 увеличивает чувствительность штамма к летальному и мутагенному действию мутагенов.

Недостатком тест-штамма является то, что ключевая мутация rad2-1 способна ревертировать (клетки приобретают устойчивость к повреждению ДНК) и эта мутация повышает чувствительность штамма только за счет высокой гибели клеток при повреждении ДНК, а значит снижает эффективность штамма.

Известен штамм 3С-СКВ-173 (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 him1-1 rad2-1) для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2-1 и him1-1. Штамм описан в работе: «Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1». Генетика. 1996. Т. 32, №3, С. 366-372. - прототип. [5]

В данной работе впервые предложен ген HIM1, мутации в котором усиливают только мутагенный эффект, не затрагивая летального. Данный штамм содержит в генотипе мутации в 4-х генах. Ген ADE2 контролирует одну из стадий биосинтеа аденина. Делеционная мутация ade2-248 определяет красную окраску колоний дрожжей. При возникновении мутаций в шести генах аденинзависимости (ade3, ade4, ade5, ade6, ade7, ade8) колонии клеток теряют красную окраску, возвращаясь к белому цвету. Ген LEU2 контролирует биосинтез аминокислоты лейцина. Мутант leu2-3,112 не может расти на среде без лейцина. Ген RAD2 кодирует эндонуклеазу, участвующую в нуклеотидэксцизионной репарации. Мутанты по этому гену высоко чувствительны к летальному действию широкого спектра мутагенов. Биохимическая роль продукта гена HIM1 не установлена.

К недостаткам штамма 3С-СКВ-173 следует отнести способность мутаций him1-1 и rad2-1 ревертировать к дикому типу. Это особенно проявляется в комбинации rad2-1 - him1-1 из-за взрывного повышения частоты мутирования в двойном мутанте. Реверсия him1-1 резко ухудшает эффективность штамма по выявлению генотоксикантов. К тому же при работе с этим штаммом требуется высокая квалификация персонала, для отслеживания ухудшения тестирующих свойств штамма.

Задача заявляемого штамма 1-ТАЕ-1 заключается в неспособности мутаций hsm3Δ и rad2Δ ревертировать к дикому типу (мутации ответственные за высокую чувствительность к генотоксикантам).

Технический эффект настоящего изобретения состоит в создании штамма, обладающего более высокой стабильностью и высокой эффективностью по выявлению генотоксикантов (т.е. с большей чувствительностью, чем у 3С-СКВ-173, и набором неревертирующих аллелей использованных мутаций.)

Технический эффект достигается тем, что создан штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, имеющий генотип МАТα ade2-248 Ieu2-3,112 ura3-160.188 rad2Δ hsm3Δ, обладающий стабильностью, неспособностью мутаций hsm3Δ и rad2Δ ревертировать к дикому типу и обеспечивающий высокую чувствительностью к генотоксикантам окружающей среды.

Усиление чувствительности в штамме 1-ТАЕ-1 обеспечено путем замены мутации him1-1 (прототипа) на мутацию hsm3Δ (фиг. 1), что увеличило стабильность и чувствительность тест-штамма, так как мутация hsm3Δ в отличие от him1-1 показывает большую чувствительность к мутагенному действию генотоксикантов, что доказано экспериментально. К тому же все использованные для конструирования штамма мутации были делеционными аллелями своих генов. Это исключает ревертирование ключевых мутаций и стабилизирует тесторный штамм.

На фиг. 1 показана зависимость частоты прямых мутаций в локусах ADE3-ADE8 от дозы УФ-лучей для штаммов: 11D-3031 (1); ТАЕ-1 (2); 3С-СКВ-173 (3); 1-ТАЕ-1 (4).

Способ получения заявляемого штамма.

Для создания штамма 1-ТАЕ-1 использовали штамм дикого типа 11D-3031 (МАТα ade2Δ-248 leu2-3,112 иrа3-160.188 trp1Δ) из коллекции дрожжевых штаммов Лаборатории генетики эукариот ПИЯФ. На первом этапе в этом штамме был делетирован ген RAD2. Использовалась плазмида pWS521 любезно предоставленная др. W. Siede. Плазмида разрезалась по двум сайтам рестриктазой Sal1. Полученные фрагменты трансформировали в клетки штамма 11D-3031 и клетки высевали на селективную среду без триптофана. Через четыре дня отбирали выросшие колонии, в которых ген RAD2 был заменен на ген TRP1. Полученные таким образом штаммы проверяли на чувствительность к УФ-лучам. Штаммы с высокой УФ-чувствительностью несли мутацию rad2Δ.

На следующем этапе использовали один из полученных на первом этапе штаммов с высокой УФ-чувствительностью, названный ТАЕ-1, для делетирования гена HSM3. Для этой цели использовали штамм MS71hsm3Δ-7 любезно предоставленный др. J.D. Merker. В этом штамме на месте гена HSM3 (в прототипе) встроен ген kanМх4, который обеспечивает устойчивость клеток к антибиотику дженитицину. Из клеток этого штамма была выделена геномная ДНК и с помощью праймеров (HSM3_del_L_ tggcttcaactccatttatgac; и del_R_cttgccagaccttacatactg), которые комплементарны флангам гена HSM3, методом ПЦР были получены фрагменты ДНК, несущие ген устойчивости к антибиотику, окруженный с обеих сторон последовательностями, комплементарными флангам гена HSM3. Полученный таким образом фрагменты ДНК трансформировали в клетки штамма ТАЕ-1 и высевали на среду с дженицитидином (50 мг/л). Через четыре дня отбирали выросшие колонии, в которых ген HSM3 был заменен на ген kanМх4, обеспечивающий устойчивость клеток дрожжей к антибиотику дженицитидину.

Проверка штамма 1-ТАЕ-1 на неспособность мутаций hsm3A и rad2A ревертировать к дикому типу базируется на доказательстве отсутствия генов HSM3 и RAD2 в геноме заявляемого штамм 1-ТАЕ-1, которые были заменены на гены kanМх4 и TRP1, соответственно. Наличие вставки (ген kanМх4) проверяли с помощью ПЦР. Один из полученных трансформантов, удовлетворяющих заданным свойствам, назван 1-ТАЕ-1 (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 ura3-160.188 hsm3Δ rad2Δ).

Из фиг. 1 (кривая 2) видно, что введение в клетки мутации rad2Δ повысило чувствительность штамма ТАЕ-1 к мутагенному действию по сравнению с диким типом (кривая 1) примерно в семь раз.

Чувствительность к УФ клеток прототипа 3С-СКВ-173, в котором присутствует мутация him1-1, отображена на кривой 3. Можно видеть, что чувствительность этого штамма к мутагенному действию УФ в три раза выше по сравнению с штаммом ТАЕ-1 (кр. 2).

Кривая 4 (заявленный штамм 1-ТАЕ-1, где мутация him1-1 прототипа заменена на мутацию hsm3Δ) показывает, что заявленный штамм чувствительнее к мутагенному действию УФ по сравнению с 3С-СКВ-173 в 1,3 раза.

Литература

1. Патент РФ №2170258, МПК C12Q 1/02.

2. Авторское свидетельство СССР №648607, МПК C12N 15/00.

3. Левитин М.М., Ковальцова С.В., Королев В.Г., Федорова И.В. Использование дрожжей-сахаромицетов как тест-объекта для оценки генетических эффектов системных фунгицидов. Микология и фитопатология. 1993. T. 27. N1. C. 60-66.

4. Грачева Л.М., Касинова Г.В. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ЦМПМ Y-449, используемый для регистрации прямых генных мутаций. Авторское свидетельство СССР №1135188 А, МПК C12N 15/00.

5. Ковальцова С.В., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1. Генетика. 1996. Т. 32, №3, С. 366-372. - прототип.

Изобретение относится к штамму дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеет генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 ura3-160.188 rad2Δ hsm3Δ. Штамм обладает стабильностью, неспособностью мутаций rad2Δ hsm3Δ ревертировать к дикому типу. Штамм обладает высокой чувствительностью к генотоксикантам окружающей среды. Изобретение может быть использовано в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод и почв. 1 ил.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, имеющий генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 ura3-160.188 rad2Δ hsm3Δ, обладающий стабильностью, неспособностью мутаций hsm3Δ и rad2Δ ревертировать к дикому типу и обеспечивающий чувствительность к генотоксикантам окружающей среды.